全 文 ：41 卷　3 期
2001 年 6月
微 生 物 学 报
Acta Microbiologica Sinica
Vol.41
June
　No.3
2001
＊中澳合作项目(ACIAR PN9680)与国家自然科学基金项目(30070511)资助
＊＊联系人
作者简介:陈晓斌(1967-),男 ,四川简阳人 ,农学博士 ,研究方向是根围PGPR生态学。
收稿日期:2000-07-24 ,修回日期:2000-10-18
运用生色基因标记黄瓜根围促生菌(PGPR)筛选菌株＊
陈晓斌1 　张炳欣1＊＊ 　楼兵干1 　Ryder M H2
(1 浙江大学植物保护系 ,杭州　310029)
(2 CSIRO Land and Water , Glen Osmond ,SA , 5064 ,Australia)
摘　要:采用三亲交配方法 ,通过 Tn7转座系统将 lacZY 标记基因导入黄瓜根围促生菌(PG-
PR)筛选菌株 Pseudomonas fluorescens CN116和 Pseudomonas corrugata CN31 的利福平抗性突变株
中;标记假单胞菌菌株则被赋予了利用乳糖作为唯一碳源的能力 , 在只有乳糖的 M9 培养基
上生长能分解 X-Gal , 菌落显出特有的蓝色;经 Southern 杂交分析 ,证明标记基因 lacZY存在于
转化菌株的染色体上;经验证标记菌株标记性状稳定 , 与对应的野生菌株比较其它性状如培
养性状 、形态特征 、生防效果等基本不变;PGPR菌株利福平抗性和生色基因标记的结合(双标
记)能最大限度地将土壤中引入的 PGPR菌株与土著细菌分开 ,检测下限可达 10 CFU mL , 为
PGPR在根围的分子生态学研究提供了一个较好的工具。
关键词:植物根围促生菌(PGPR), 基因标记 , lacZY基因 ,转座子 Tn7 , 分子生态学
中图分类号:Q344.+3　　文献标识码:A　　文章编号:0001-6209(2001)03-0287-06
植物根围促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria ,简称 PGPR)是指根围的一类有
益细菌 ,能直接或间接地对植物生长起促进作用 ,能够抑制多种植物病害尤其是土传病
害[ 1] 。近年来 ,PGPR菌株的筛选利用及其防病促生机制的研究已成为一个热点 ,至 1997
年 ,有关 PGPR的国际专门研讨会已举行了四届[ 2] 。但对PGPR的作用机制的研究尚很不
清楚[ 3] ,特别是 PGPR菌株在根围定殖动态的研究 ,如分布规律 ,非生物因素(如水势 、温
度和 pH 等)的影响 ,与宿主植物的关系 ,与病原微生物的互作等 。由于缺乏理想的研究
方法去跟踪检测引入根围的 PGPR菌株 ,而将其与土著细菌分开 ,以致于上述许多问题的
研究结果准确性不高[ 4] 。
随着分子生物学技术发展 ,近几年来生态学和分子生物学交叉形成了一门新兴边缘
学科—分子生态学 ,其研究的主要内容是以分子生物学技术探讨生态学问题[ 5] 。一些具
有高选择性 、高灵敏度的技术包括免疫学方法 、核酸探针和分子标记等日益成熟并用于根
围生态学研究 ,其中 ,通过遗传重组将外源标记基因(Marker gene)导入供试菌株从而在回
收或检测引入根围中的该种菌株时可以将其与同类土著细菌分开的方法为一个突出的代
表 ,正成为飞速发展的研究领域。在土壤微生物研究中应用最多的标记基因是生色基因
(如 gus基因 , lacZY基因等)和生物发光酶基因(如 luxAB)[ 4、6 、7] 。PGPR菌株中的假单胞
菌类通常不能利用乳糖作为碳源和能源物质[ 7] ,通过转座子系统将大肠杆菌乳糖操纵子
DOI :10.13343/j.cnki.wsxb.2001.03.005
的 lacZ基因(编码 β-半乳糖基酶)和 lacY基因(编码乳糖透性酶)转入假单胞菌菌株后 ,
转化菌株则能利用乳糖作为唯一的碳源 ,在只有乳糖的 M9培养基上生长 ,并能分解 X-
Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷),菌落显出特有的蓝色 ,从而区别于同类土著细菌而
得以回收[ 8 , 9] 。本文报道了将生色基因 lacZY通过转座子 Tn7导入黄瓜 PGPR筛选菌株
Pseudomonas fluorescens CN116和 Pseudomonas corrugata CN31 ,以及导入基因的Southern杂交
验证和标记菌株初步应用于检测的实验结果 。
1　材料和方法
1.1　供试菌株
供体菌株大肠杆菌 E-coli R126 ,质粒为 pMON7197 ,含 lacZY基因 、转座子 Tn7成分 ,
具有Gmr(庆大霉素抗性)等[ 10] ;助体菌为大肠杆菌 E .coliR81 ,质粒 pRK2013 ,Kmr(卡那霉
素抗性),目标菌株为两个 PGPR菌株 Pseudomonas fluorescens CN116和 pseudomonas corruga-
ta CN31(以下简称CN116和 CN31),为本实验室分离筛选自黄瓜根围 ,经盆栽和田间实验
证明对黄瓜植株生长有明显的促进作用 ,并对由多种病原引起的黄瓜苗期猝倒病有较好
的防治效果[ 11] ,经细菌 BIOLOG鉴定系统和 GC-FAME鉴定系统鉴定至种。
1.2　培养基 ,抗生素及试剂
实验所用培养基有:KMB 、TZCA[ 11] 、LB[ 12] 和M9[ 12] 。
抗生素:庆大霉素(Gm),卡那霉素(Km),利福平(Rif),均为 Sigma产品 ,分子生物学实
验涉及的溶液和试剂参考文献[ 12] 。
1.3　目标菌株的乳糖利用缺陷(lac-)表型鉴定和利福平自发抗性(Rif)突变株筛选
CN116和 CN31经 KMB活化后 ,于M9 lac 平板(含1%乳糖的M9固体培养基)划线培
养(27℃,48 h),检测生长情况;利福平自发抗性突变株的筛选采用平板涂布法 ,培养基为
KMB Rif , Rif浓度从低到高:20mg L 、40mg L、60mg L 、80mg L、100mg L。
1.4　细菌杂交和转移接合子(标记菌株)的筛选
供体菌 、助体菌和受体菌分别于含相应抗生素的 LB培养液中培养 ,28℃过夜 ,取对数
生长期的菌液 ,按供体菌∶受体菌∶助体菌为 1∶1∶1 ,10∶1∶1 ,1∶10∶1和 1∶1∶10等组合 ,分别
至1mL Eppendorf管中混匀 ,用微量加样器转移到 LB平板中央(不必涂布),30℃培养 18 ～
24 h后 ,用 2mLM9培养液小心回收 ,涂布到M9/ lac(1%) Rif(50mg L)X-Gal(0.006%)平
板上 ,直到蓝色菌落长出 。转移接合子的筛选是将长出的蓝色单菌落同时于M9 lac Rif
X-Gal和M9/ lac Gm X-Gal两种平板上划线培养 ,观察其生长情况 ,只保留在 Rif平板上能
生长而在Gm平板失去生长能力的蓝色菌落 ,即标记菌株的筛选 。
1.5　标记基因的Southern杂交验证
供体菌质粒 DNA的提取 ,标记 PGPR菌株和相应野生菌株基因组DNA的提取 ,South-
ern杂交等均参考文献[ 12]进行 ,其中杂交用探针是供体菌质粒 DNA经限制性内切酶 Bgl
Ⅱ和 HindⅢ酶切后 ,回收约 7kb片段(质粒上 lacZY基因所在片段),并用同位素α-32 P标
记;基因组 —完全酶切所选限制性内切酶为 HindⅢ ,杂交滤膜为尼龙膜 。
1.6　标记性状的稳定性检测
标记性状的稳定性检测包括在 KMB平板(包括加和不加 Rif)上连续转代培养后 、菌
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种斜面保存一定时期后并混入土样(灭菌和不灭菌的菜园土)中一定时期后再用 M9 lac
Rif X-Gal平板检测 。
1.7　标记 PGPR菌株与对应野生型茵抹比较
标记 PGPR菌株与对应野生型菌株比较包括:TZCA 培养基上菌落形态比较;通过液
体培养 ,用分光光度计比较两者的生长速度;在 KMB培养基上的荧光色素产生情况;PDA
平板对峙培养测定对黄瓜苗期猝倒病主要病原 Rhizoctonia solani AG4 、Pythium aphanider-
matum 和P .ultimum 的离体拮抗性;盆栽和隔离温室实验中促生和防病效果测定等 。
1.8　标记菌株应用于回收检测
标记菌株选取 CN116RL ,生理盐水制成的菌悬液经平板稀释记数法测得已知浓度(达
到109CFU mL ～ 1010CFU mL)后 ,用不同菜园土土样浸出液(含有大量土著细菌)进行梯度
系列稀释后涂布于KMB Rif 、M9 lac Rif X-Gal和M9 lac X-Gal平板上 ,30℃培养48 h ,观察
形成菌落和生色情况 。
2　结果和分析
2.1　CN116和 CN31两菌株的 lac-表型鉴定和 Rif突变株筛选
图 1　同一稀释浓度菌株 CN116RL在不同选择性
平板上菌落回收情况
Fig.1　Recovery colonies of CN116RL grown on different selec-
tive media at the same diluted densi ty
A:M9 lac X-Gal;B:M9 lac Rif X-Gal.
CN116 和 CN31两菌株在 M9平板上划
线培养 ,均没有菌落长出 ,说明这两株菌与
其它假单胞菌一样 ,均不能利用乳糖作为唯
一碳源 ,为 lac-(乳糖利用缺陷)表型。通过
采用培养基中 Rif 浓度逐渐升高的方法 ,筛
选CN116和 CN31 抗性突变株到 Rif浓度为
100mg L ,记为 CN116R和 CN31R ,经染色体
指纹分析 ,抗性菌和野生菌株为一致的 。
2.2　细菌杂交与标记菌株筛选
M9培养液回收的混合液涂布到 M9
lac Rif X-Gal选择平板上长出蓝色菌落后 ,
挑取的同一菌落只有极少数(约 5%)能在
M9 lac Gm X-Gal平板生长 ,其余绝大部分均
失去Gmr ,说明采用三亲本交配法 ,双元载体
在 pRK2013协助下 ,将标记基因 lacZY转移到了 CN116R和 CN31R菌株。选择培养基的
使用同时既排除了供体菌的干扰 ,同时也排除了转化菌中质粒 pMON7197的存在 。筛选
的标记菌株记为CN116RL和CN31RL ,在M9 lac Rif50 X-Gal平板上划线培养 ,菌落为蓝色
(生色表型)(如图 1)。
2.3　导入基因的Southern印迹分析
CN116 、CN116RL 、CN31 、CN31RL的基因组 DNA 经 Hind Ⅲ酶完全酶切(图 2)后 ,与同
位素标记的探针杂交 ,经放射自显影后 , CN116RL 和 CN31RL 均有杂交带出现 ,CN116RL
和CN31RL 杂交后只有一条带 ,说明基因组DNA上均只有一个位点插入 。
289　3 期 陈晓斌等:运用生色基因标记黄瓜根围促生菌(PGPR)筛选菌株
图 2　导入标记基因的 South-
ern杂交分析
Fig.2　Southern blotting analysis of
inserted marker gene
1.CH116;2.CN116RL;3.CN31;4.
CN31RL.A.CN116;B.CN116RL;
C.CN31;D.CN31RL.
2.4　标记性状的稳定性检测
连续转接 30次以上 ,保存半年以上标记菌株的标记性状
在选择平板上均稳定表达;无论是灭菌土还是非灭菌土经低
温保存两个月 ,在选择性平板上均能有效地回收到典型的蓝
色菌落 。这些实验说明标记基因在转化菌株中是较稳定的。
2.5　标记 PGPR菌株与对应野生型菌株的比较
通过比较 ,每一标记菌株与其对应的野生型菌株的菌落
形态 、生长速度 、荧光色素产生情况基本一致;标记菌株对黄
瓜苗期猝倒病主要病原 Rhizoctonia solaniAG4 、Pythium aphani-
dermatum 、P .ultimum 的离体拮抗也基本无变化;尤其是作为
PGPR菌株的重要特征的防病促生效应仍然得以保持(图 3 、图
4),标记菌株除标记性状以外其他性状基本与野生型菌株一
致 。
2.6　标记菌株应用于回收检测
通过已知浓度的 CN116RL菌悬液用含有大量土著细菌的
土壤浸液梯度系列稀释后涂布于不同的选择性平板 ,发现土
壤中存在一定量的细菌(约占 10%)能利用乳糖 ,并能分解 X-
Gal形成蓝色菌落(如图 1A),虽然这些菌落通常都较小(假单胞菌掠夺营养能力强 ,生长
速度相对较快),但不可避免地会造成干扰:而在加 Rif的抗性M9平板上 ,则只有一种大
小均一的菌落(如图 1B):另外在 KMB Rif平板上回收的目标菌落数常常偏大 ,存在土著
细菌的天然利福平抗性 。利用双标记回收目标细菌时 ,稀释倍数在 109 —1010时 ,尚能分
离到蓝色菌落 ,检测平板上仍能观察到蓝色菌落 ,即检测下限能达到 10CFU mL ,能较好地
反映出目标菌株在土壤 、根围等特殊生境中的真实情况 ,而我们在只用 Rif 标记菌株时 ,
检测下限至少在 102 —103CFU mL 之间 。
图 3　CN31菌株的防病促生效果
Fig.3　The cucumber growth-promoting and disease control ef-
fect of CN31
图 4　CN31 和 CN31RL防病促生效果比较
Fig.4　Comparison on the ef fect of disease control and cucumber
growth-promoting by CN31 and CN31RL marked with lacZY
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3　讨论
将引入根围的 PGPR菌株与环境中的同类土著细菌分开 ,达到特异性回收检测 ,是研
究其作用机制和在根围的生态学等问题的基础。传统的检测方法中最具代表性的是利用
菌株的自发抗生素抗性 ,即筛选PGPR菌株的抗生素突变体利用选择性平板回 收 。该方
法具有操作简便 ,成本低廉等优点 ,但由于土著细菌往往存在一定的天然抗性素抗性 ,因
而有背景干扰。虽然采用筛选同时具两种(或以上)抗生素抗性的突变菌株能一定程度地
解决这一问题 ,但往往导致筛选细菌生长明显受抑制或存活能力低 ,而不利于跟踪检测 。
此外 ,抗生素抗性突变体的利用还存在抗性不稳定的问题 ,而且其检测下限只在 102CFU g
～ 103CFU g土的水平 ,灵敏度有限[ 4] 。
Drahos和 Hemming[ 8 , 9] 通过对至少 500个假单胞菌菌株分离物验证 ,发现它们都不能
利用乳糖作为唯一碳源 ,即乳糖利用缺陷型(lac-)。我们在肯定了供试 PGPR菌株的 lac
表型基础上 ,通过Tn7转座系统 ,将基因 lacZY导入其中 ,经 Southern杂交分析 ,证明标记
基因位于染色体而非质粒上 ,从而保证标记性状遗传的稳定持久 ,这正是作为跟踪检测工
具所必须具备的[ 13] 。作为生防菌 ,标记后仍具有生防效果乃是至关重要的 ,也就是说 ,最
好达到标记菌株除标记性状以外其它性状基本与野生型菌株一致。人们早就发现筛选的
利福平抗性突变株往往不影响菌株的生防活性[ 8] 。同时本研究选用的 Tn7转座子 ,插入
位点在细菌基因组上是特异的 ,而且在每个细菌基因组的插入位点只有一个[ 13] ,外源基
因插入目标菌株后往往不会产生诱变 ,即非诱变插入(non-mutagenic insertion)[ 14 , 15] :而与过
去常采用的 Tn5转座系统 ,其在基因组上的插入是随机的 、多位点的 ,插入诱变(mutagenic
insertion)非常普通 ,而插入诱变有利时情况(如彭于发等用 Tn5诱变的 D93生防菌株[ 16])
一般极少 ,往往有害或至少改变目标菌株的性状。因此 ,我们采用了 Tn7转座系统对生防
菌是适用的 ,从而保证了 PGPR菌株的防病促生效应不受影响。实验结果也证明 lacZY
基因在两个供试菌株染色体上插入位点的特异性 ,标记菌株与其对应的野生菌株比较 ,除
标记性状以外其他性状如培养性状 ,形态特征 ,生防效果等基本保持不变。
作为标记性状用于目标菌株的跟踪检测 ,要求检测灵敏度高。本实验结合 lac+和
Rif+双标记目标菌株 ,能有效避免背景干扰 ,特异性表型明显 ,回收菌落下限<10CFU g
土 ,比传统的利用抗生素抗性的回收检测方法精确得多 。
实验结果表明 ,CN116RL和 CN31RL两标记 PGPR菌株标记性状稳定 、菌株的促生防
病效果不变(图 4)、回收检测灵敏度高等特点 ,为 PGPR菌株在根围的分子生态学研究工
作提供了一个较为理想的工具 。
参 考 文 献
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INTRODUCTION OF THE CHROMOGENIC GENE TO THE PLANT
GROWTH-PROMOTING RHIZOBACTERIA OF CUCUMBER＊
Chen Xiaobin
1　Zhang Bingxin1＊＊　Lou Binggan1 　Ryder M H2
(1Department of Plant Protection , Zhejiang University , Hangzhou ,310029 , China)
(2CSIRO Land and Water , Glen Osmond , SA ,5064 , Australia)
Abstract:Using a bicomponent transposition system with the E .coli lacZY gene cloned between
Tn7 termini , a sensitive , selectable marker based on expression of the E.coli lac operon genes en-
coding β-galactosidase and lactose permease was transformed into the rifampicin resistant mutant of
plant growth-promoting rhizobacteria of cucumber , Pseudomonas aeruginosa CN116 and Pseudo-
monas corrugata CN31 , respectively.Transformants were conferred the ability to utilize lactose as a
sole carbon source and the abtlity to cleave the chromogenis substrate X-Gal to show a specific blue
color.Southern blotting analysis showed that lacZY gene was inserted into the genome DNA of target
strains.Compared with the wild type strains , the cultural characters ,morphological features , growth
promoting and disease control effects of transformants were almost unchanged , except the new marked
phenotype.This marker system enabled the detection of lac+ transformants at sensitivity of 10 CFU
g soil ,which makes the further studies on PGPRmore easily.
Key words:Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR),Chromogenic marker gene , lacZY gene ,
Transnoson Tn7 ,Molecular ecology
＊Project Granted by ACIAR PN9680 and Chinese National Natural Science Fund(30070511)
＊＊To whom correspondence should be addressed
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