全 文 ：珍稀濒危植物天目木兰( Magnolia amoena)
遗传多样性的 RAPD 分析 3
刘登义 3 3储　玲　杨月红
(安徽师范大学生物多样性中心 ,重要生物资源保护与利用研究安徽省重点实验室 ,芜湖 241000)
【摘要】　运用随机扩增多态 DNA (RAPD)技术 ,对天目木兰 ( M agnolia amoena) 居群的遗传多样性进行了
研究. 从 40 个 102mer 随机引物中筛选出 14 个能得到清晰、稳定扩增带的引物进行扩增 ,14 个引物共检测
了 94 个位点 ,其中多态性位点为 23 ,占 2414 %. 计算了 12 个居群之间的遗传相似度和遗传距离 ,并运用
U PGMA 法进行了聚类分析 ,结果显示相同产地个体间 (居群内) 的遗传距离较小 ,遗传多样性水平很低 ;
不同产地个体间 (居群间)遗传距离较大 ,遗传多样性水平较前者高 ,即天目木兰个体间遗传多样性水平与
它的地理分布有关. 天目木兰总体较低的遗传多样性是导致它濒危的原因之一.
关键词 　天目木兰 　聚类分析 　RAPD
文章编号 　1001 - 9332 (2004) 07 - 1139 - 04 　中图分类号 　Q948. 3 　文献标识码 　A
Genetic diversity of rare and endangered plant Magnolia amoena . L IU Dengyi , CHU Ling , YAN G Yuehong
( Biodiversity Research Center , The Provincial Key L aboratory of the Conservation and Ex ploitation of Biologi2
cal Resources in A nhui , A nhui Norm al U niversity , W uhu 241000 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2004 ,15
(7) :1139～1142.
The genetic variations within and between eleven natural populations and one cultured population of M agnolia
amoena from different distribution regions were investigated at the DNA level by employing RAPD. Out of 40
random primers ,fourteen random primers were screened which could generate highly reproducible and clear
RAPD fragments for further population analysis. With these primers ,a total of 94 discernible DNA fragments
were obtained and 23 (24. 4 %) were polymorphic ,which indicated that low levels of genetic variation existed in
the investigated populations. In addition ,U PGMA map were made according to the genetic similarity and dis2
tance of the twelve populations calculated in this article. The result showed that the genetic diversity between in2
dividuals within population was lower than that between populations. The individual genetic differentiation might
be relation to their geographic distribution. The low total genetic diversity of M agnolia amoena was one reason
for its endangerment .
Key words 　M agnolia amoena , Cluster analysis , RAPD.3 安徽省自然科学基金项目 (03043501) 、教育部科学技术重点研究
项目和重要生物资源保护与利用研究安徽省重点实验室专项基金资
助项目.3 3 通讯联系人.
2003 - 10 - 08 收稿 ,2004 - 04 - 18 接受.
1 　引 　　言
天目木兰 ( M agnolia amoena) 为木兰科 ( Mag2
noliaceae) 木兰属 ( M agnolia) 植物[1 ,11 ] ,是我国东部
中亚热带特有树种 ,1984 年被列为国家三级珍稀濒
危保护物种[1 ] ,目前天目木兰自然种群分布范围狭
窄、个体数目较少 ;现零星分布于浙江、安徽、江苏、
江西等地 ,生于海拔 200～1 200 m 丘陵的山林中 ;
天目木兰花先叶开放[4 ,9 ] ;花美丽芳香、白色、淡红
色或红色 ,是重要的园林观赏、香料和药用植物. 同
时木兰科植物具有一些比较原始的性状 ,是研究被
子植物起源和早期演化的关键类群之一 ,因而对濒
危植物天目木兰的深入研究很为重要. 迄今为止对
它的研究多限于形态学、解剖学、细胞学 (染色体)水
平等方法[3 ,4 ,18 ] ,这些传统方法没有揭示出其居群
层次上的差异 ,有关天目木兰在 DNA 水平上的遗
传变异研究尚未见报道. RAPD ( Randomly Ampli2
fied Polymorphic DNA)是 20 世纪 90 年代发展起来
的DNA 分子标记新技术[17 ] ,它成本低、分析速度
快 ,仅需极微量的 DNA 即能获得丰富的多态性特
征 ,实践证明 RAPD 是植物遗传多样性研究的一个
有效而简便的工具[2 ,5 ,10 ] . 利用 RAPD 技术来研究
物种的遗传变异 ,对深入探讨物种致濒机理 ,保护和
延续物种多样性具有重要的理论意义和实际价值.
本文旨在通过对天目木兰不同居群间和居群内遗传
多样性 RAPD 分析 ,以期了解其居群层次上的遗传
多样性水平 ,为进一步探讨天目木兰濒危原因和加
强保护提供分子遗传学数据.
应 用 生 态 学 报 　2004 年 7 月 　第 15 卷 　第 7 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,J ul. 2004 ,15 (7)∶1139～1142
2 　材料与方法
211 　供试材料
野外采集供试天目木兰当年生枝条上的幼叶 ,每一种群
随机取样 ;存于冰壶中 ,带回实验室 ,贮存于270 ℃冰箱待用.
供试材料来源见表 1.
表 1 　供试材料来源
Table 1 Source of plant materials investigated
编号
Number
采集地
Locality
海拔
Altitude (m)
01 安徽黄山 Mt1Huangshan 980
02 安徽黄山 Mt1Huangshan 702
03 浙江天目山 Mt1Tianmushan 304
04 浙江天目山 Mt1Tianmushan 428
05 浙江天目山 Mt1Tianmushan 690
06 浙江天目山 Mt1Tianmushan 840
07 浙江天目山 Mt1Tianmushan 1000
08 南京中山植物园 Zhongshan Vivarium 100
09 江苏宜兴 (小黑沟) Xiaoheigou , Yixing 340
10 安徽金寨白马寨 Baimazhai ,Jinzhai 760
11 安徽金寨天堂寨 Tiantangzhai ,Jinzhai 528
12 安徽金寨天堂寨 Tiantangzhai ,Jinzhai 900
212 　研究方法
21211 植物基因组 DNA 提取 　CTAB 是一种去污剂 ,具有
既能裂解细胞又能有效沉淀多糖等独特的优点. 故采用
CTAB 法[6 ]提取基因组 DNA (genomic DNA) . 剪取各居群嫩
叶约 110 g ,DNA 纯化步骤 :DNA2TE 溶液加入 1 %体积的
RNA 酶 (10 mg·ml - 1) ,37 ℃温育 1 h ;加入 3 倍体积的 6 mg·
ml - 1 NaCl ,约 4μl 玻璃粉 TE溶液 ,混匀 ,放置 5 min (中间摇
动几次) ;5 000 rpm 离心 3 min ,去上清液 ;加洗液 (含 012
mol·L - 1 NaCl ; 10 mmol·L - 1 Tris2HCl ,p H810 ; 1 mmol·L - 1
EDTA ;50 %乙醇) 150μl ,混匀 ,4 000 rpm 离心 1 min ,去上清
液 ,重复清洗 3 次 ;晾干 ,加 50μl 1 ×TE ;50 ℃保温 20 min ;
1 000 rpm 离心 10 min ,将上清液移至新管 ,弃沉淀 , - 70 ℃
保存 ,用于 PCR.
21212 DNA 浓度和纯度的检测 　采用紫外吸收检测和凝胶
电泳检测. 在 752 型紫外分光光度计上测定在波长为 260
nm 和 280 nm 处吸光光度值 ,根据 OD260 nm/ OD280 nm 光吸
收比值和通过 018 %琼脂糖凝胶电泳 ,以标准浓度的 (DNA
为对照来判断 DNA 样品的纯度和浓度.
21213 RAPD 扩增反应 　RAPD2PCR 反应在 PTC2100 型
PCR 仪上进行 ,均重复一次 ;用于 PCR 反应的 DNA 模板用
011 TE 稀释至使用浓度 (5 倍) . RCR 反应参照 Willians 等
(1990)方法[17 ] ,筛选的最佳反应体系为 :总体积 25μl/ 管 ,其
中含 50 ng 模板 DNA ,10 ×PCR 缓冲液 ,210 mmol·L - 1 Mg2
Cl2 ,100 mmol·L - 1 dN TP ,1/ 10 反应体积的随机引物 ,115U
TaqDNA 聚合酶. 每次反应均设一空白对照 ,以无菌双蒸水
代替模板 ,以排除系统误差. 反应以下列程序进行扩增 :94 ℃
预变性 4 min ,1 个循环 ; 94 ℃变性 1 min ,36 ℃退火 1 min ,
72 ℃延伸 2 min ,45 个循环 ;72 ℃延伸 10 min ,1 个循环.
21214 PCR 产物检测 　取 10μl 扩增产物在含有 015μg·
ml - 1 EB (溴化乙锭)的 114 %琼脂糖凝胶电泳检测 ,电泳缓冲
液为 011 ×TBE ,稳压 (5 V/ cm) ,电泳 2 h ;电泳结果在紫外
分析仪中观察、记录、拍照.
21215 数据处理与聚类分析 　每一随机引物重复 1 次 ,只记
录重复的带. 在 RAPD 分析中 ,电泳图谱中的每一条带作为
一个分子标记 ,它代表了模板上与引物互补的一对结合位
点 ,迁移率相同的谱带视为同源位点. PCR 扩增产物按条带
的有无分别进行 0、1 数据处理 ,在相同迁移位置上有带记为
1 ,无带记为 0. 所有模板都具有的带为公共带 ,表示无多态
性 ,其余为多态带. 按 Nei 等的方法 [13 ]计算任意 2 个样本间
的遗传距离 (D) ,D = 1 - F , F = 2NXY/ (NX + NY) ,其中 F 是
任意两样本之间的遗传相似系数 ,NX、NY 分别是样本 X 和
样本 Y扩增出的 DNA 片段总数 ,NXY是样本 X 和样本 Y共
有的 DNA 片段数. 根据遗传距离得到的不同居群间的遗传
相似性 ,应用 MEGA 程序中的非加权组法 (U PGMA) 法进行
聚类分析构建居群间亲缘关系分支树系图.
3 　结果与分析
311 　模板 DNA 的纯度和浓度的检测
用紫外分光广度法检测了所有 DNA 样品的浓
度和纯度 ,结果 DNA 样本 OD260 nm/ OD280 nm 大于
117 ,均可用来 RAPD 分析 ;用 018 %琼脂糖凝胶电
泳检测所有 DNA 样本均无降解.
312 　引物的筛选
本实验共选用 40 个随机引物 (10 碱基的寡核
苷酸)进行 PCR 扩增 ,仅选用能得到清晰扩增带、对
照无假带 ,或扩增假带若加总 DNA 后这些假带消
失的引物用于正规的 PCR 扩增 ,共筛选出 14 个引
物 (表 2)进行正式的扩增反应.
表 2 　引物及其序列
Table 2 Primers and their sequences
Primers Sequences(5’- 3’) Primers Sequences(5’- 3’)
OPI203 CAGAAGCCCA OPE214 TGCGGCTGAG
OPI205 TGTTCCACGG OPE216 GGTGACTGTG
OPI208 TTTGCCCGGT OPQ212 AGTAGGGCAC
OPI213 CTGGGGCTGA OPQ214 GGACGCTTCA
OPI214 CTGGGGCTGA OPQ215 GGGTAACGTG
OPI220 AAAGTGCGGC OPH201 GGTCGGAGAA
OPE212 TTATCGCCCC OPH204 GGAAGTCGCC
313 　RAPD 扩增带的多态性分析
14 个引物在供试材料中共获得 94 条可区分的
扩增产物 ,不同引物的扩增带数从 3 到 11 条不等 ,
平均每个引物可扩增 617 条. 94 条扩增产物中有 23
条表现出多态性 , 在 12 个样本中所占比率为
2414 % ,说明天目木兰种群表现出较低的遗传多样
性.
314 　天目木兰种群的遗传变异和聚类分析
群体间 RAPD 片段共享性 (即遗传相似度) 能
0411 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
够在一定程度上反应群体间 DNA 的差异 ,根据每
个引物在 12 个天目木兰样本 DNA 的扩增结果 ,算
出 12 个样本 RAPD 片段的平均遗传相似度 ,根据
遗传相似度计算出遗传距离见表 3. 根据遗传距离
进行聚类分析[20 ] ,用 MEGA 程序中的非加权组法
(U PGMA)法进行聚类分析 ,得到居群间亲缘关系
分支树系图 (图 1) . 由图 1 可以看出 ,U PGMA 聚类
方法把供试的 12 个天目木兰个体聚为两大类群 :位
于长江以北的天堂寨天目木兰居群聚为一类 ;包括
10、11、12 等个体. 位于长江以南的浙江天目山、安
徽黄山、江苏的宜兴和南京中山植物园的天目木兰
居群聚为一类 ;包括 01、02、03、04、05、06、07、08、09
个体. 后者又分为两个亚类 :安徽黄山和浙江天目山
及南京中山植物园聚为一个亚类 ;江苏宜兴聚为另
一个亚类. 由图 1 可知 ,各亚类的天目木兰群体间表
现出较近的遗传关系 ;居群内的天目木兰个体遗传
距离较小 ,遗传多样性水平很低 ,即具有极为相似的
遗传背景 ;居群间个体遗传距离较大 ,遗传多样性水
平较前者高 ,这种遗传差异可能与天目木兰的生境
有关.
表 3 　任意 2 个居群间的遗传距离
Table 3 Genetic distance bet ween any t wo populations
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12
01
02 010214
03 010319 010388
04 010510 010490 010318
05 011144 010312 010215 010106
06 010644 010420 010312 010520 010315
07 010108 010997 010714 010509 010218 010108
08 010542 011095 010900 010630 011168 010325 010742
09 011717 012078 011429 011399 011668 011168 011492 011688
10 011792 012211 011831 011876 011836 011837 012001 011717 012114
11 011916 012129 011917 011917 011754 011800 012084 011800 012155 010530
12 011617 012245 012121 012002 011669 011634 011961 011633 012078 010210 010104
图 1 　根据 RAPD 数据应用 UPGMA 法构建的天目木兰居群遗传树
系图
Fig. 1 Genetic dendrograms of populations of M1 ameona using UPG2
MA algorithms to cluster RAPD data.
4 　讨 　　论
居群遗传结构就是遗传变异或者说基因和基因
型在时间和空间上的分布式样 ,它受突变、基因流、
自然选择和遗传漂变的共同作用 ,同时还和物种的
进化历史和生物学特性有关[12 ] . 对植物群体遗传结
构的研究是探讨物种对环境适应性及其进化机制的
基础 ,也是保护生物学的核心[8 ] . 研究证明 ,多态位
点百分率可作为度量遗传变异水平高低的指标 ,
RAPD 可以客观地说明群体遗传多样性水平 ,遗传
多样性的高低 ,决定了物种对环境适应能力的强弱 ,
也决定了其利用潜力的大小[14 ,16 ,19 ] . 本研究首次利
用 RAPD 技术对天目木兰种群进行了遗传多样性
分析 ,揭示了不同地理环境和生境中的居群间与居
群内的遗传差异. 结果表明 ,天目木兰具有较低的遗
传多样性 ,天目木兰居群间个体的遗传变异总体上
大于居群内个体的遗传变异. 聚类图显示了位于长
江以北的天堂寨天目木兰居群聚为一类 ;位于长江
以南的浙江天目山、安徽黄山、江苏宜兴和南京中山
植物园的天目木兰居群聚为一类 ;后者又分为两个
亚类 :安徽黄山和浙江天目山及南京中山植物园聚
为一个亚类 ;江苏宜兴聚为另一个亚类. 野外调查表
明 ,天目木兰在华东地区的分布为不连续的岛屿状
或斑块状分布 ,各居群所处地理位置的不同而产生
的水热条件差异对于天目木兰长期的作用和对其生
境趋异适应的结果 ,产生了天目木兰的不同生态型.
天堂寨的天目木兰居群和其它样地的居群之间表现
出较大的遗传差异性 ,可能是由于受地理距离、环境
因子、气候因子等因素的影响形成的 ,其他不同样地
的居群之间表现出有较近的遗传距离 :天目山为黄
山的余脉 ,呈连续分布于黄山、天目山的天目木兰居
群表现出有较大的遗传相似性 ,08 个体采自南京中
14117 期 　　　　　　　　刘登义等 :珍稀濒危植物天目木兰 ( M agnolia amoena)遗传多样性的 RAPD 分析 　　　　　　　　　　　
山植物园的多年栽培种 (幼苗源于天目山) ,从图 1
可以看出与天目山的野生居群产生了一定的遗传差
异 ,这可能是由于栽培种和野生种的生态条件、环境
差异显著所致 ,是受到人工环境长期驯化的结果. 因
为栽培植物在一个人工驯化与引种迁移的过程中 ,
由于自然选择与人工选择 ,其形态与遗传特性会发
生根本的变化 ,所以其遗传多样性的分布规律与自
然植物有很大的不同[15 ] ,09 个体来源于江苏宜兴
小黑沟自然保护区 ,它所处的生境很特殊 ,与 4 株红
紫柴共生 ,被一片毛竹林包围 ,林下无灌木并少草
本 ,在适应于此种环境因素的情况下 ,导致与其它样
地种群之间发生遗传分化. 另一方面 ,RAPD 分析结
果显示出海拔高度对天目木兰居群内遗传分化也有
一定的影响 ,从图 1 可以看出 ,浙江天目山的山麓
(海拔 304m)和三里亭 (海拔 428m)的遗传距离就小
于与五里亭 (海拔 690m)的遗传距离.
长期以来由于森林砍伐、火灾以及群众采摘花
蕾入药、践踏林地等使得天目木兰的生境受到严重
破坏 ,加上其生长缓慢 ,结实率小 ,种子发芽率低 ,自
然更新能力弱 ,林下几无实生苗 ,从而天目木兰植株
量越来越少. 除了来自人类的直接干扰破坏和类群
的进化历史以及生态环境因子的影响外 ,天目木兰
生存环境狭窄的斑块状小居群分布增强了遗传漂变
和自交衰退的影响 ,不同局部居群之间个体由于地
理位置的间隔产生了生殖屏障 ,阻断了居群之间的
基因交流 ,导致了珍稀濒危植物居群遗传变异水平
下降 ,最终降低居群的适应环境的生存能力 ,从而严
重影响到其居群的生存和发展. 较低的遗传多样性
会导致居群较低的适应环境能力和易于受到生态环
境突变的影响[7 ] . 因此 ,种内遗传多样性的研究是
保护生物学的重要内容.
参考文献
1 　Bureau of the National Environmental Conservation (国家环境保
护总局) , Institute of Botany of the Chinese Academy of Sciences
(中国科学院植物研究所) . 1987. Lists of Chinese Rare and En2
dangered Plants. Beijing :Science Press. (in Chinese)
2 　Caetano2Anolles G. 1993. Amplifying DNA with arbitrary oligonu2
cleotide primers. PCR Methods and A pplications ,3 :85～94
3 　Cai X(蔡 　霞) , Hu Z2H (胡正海) . 2000. Comparative studies on
leaf structure and oil cells of the Magnoliaceae in China. Acta Phy2
totaxon Sin (植物分类学报) ,38 (3) :218～230 (in Chinese)
4 　Chen R2Y(陈瑞阳) ,Zhang W(张　玮) ,Wu Q2A(武全安) . 1989. A
report on chromosome numbers of partly Magnoliaceae plants in Yun2
nan ,China. Acta Bota Yunnanica(云南植物研究) ,11 (2) :234～238
(in Chinese)
5 　Dawson IK , Chalmers KJ , Waugh R , Powell W. 1993. Detection
and analysis of genetic variation in Hordeum spontaneum popula2
tions from Israle using RAPD markers. Mol Ecol ,2 :151～159
6 　Doyle JJ , Doyle JL . 1987. A rapid DNA isolation procedure for
small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem B ull ,9 (1) :11～15
7　Du D2L (杜道林) , Su J (苏 　洁) , et al . Genetic diversity of
Cephalotax us mannii ,a rare and endangered plant . Acta Bot S in
(植物学报) ,44 (2) :193～198 (in Chinese)
8 　Falk DA , Holsinger KE. 1991. Genetics and Conservation of Rare
Plants. New York :Oxford University Press Inc.
9 　Fu L2G(傅立国) , et al . 1991. China Plant Red Data Book2Rare
and Endangered Plants. Volume Ⅰ. Beijing :Science Press. (in Chi2
nese)
10 　Lanner C ,Bryngelsson T , Gustafsson M. 1996. Genetic validity of
RAPD markers at the intra2and inter2specific in wild B rassica
species with n = 9. Theor A ppl Genet ,93 :9～14
11 　Liu Y2H(刘玉壶) . 1996. Flora Reipublicae Popularis Sinicae. Vol.
30. Beijing :Science Press. 82～198 (in Chinese)
12 　Liu Z2L (刘占林) , Zhao G2F (赵桂仿) . 1999. Population genetic
and its implications for conservation of rare and endangered plants.
Chin Biodiver (生物多样性) ,7 (4) :340～346 (in Chinese)
13 　Nei M , Li WH. 1979. Mathematical model for studying genetic
variation in terms of restriction endonucleases. Proc Natl Acad Sci
USA ,76 :5269～5273
14 　Pei Y2L (裴颜龙) ,Zou Y2P(邹喻苹) , et al . 1995. Preliminary re2
port of RAPD analysis in Paeonia suf f ruticosa subsp . sopontanea
and Paeonia rockii . Acta Phytotaxon Sin (植物分类学报) , 33
(4) :350～356 (in Chinese)
15 　Peng S2L (彭少麟) ,Zhang T2P(张太平) . 2000. An introduction to
molecular ecology of cultivated plants. J W uhan Bot Res (武汉植物
研究) ,18 (2) :165～168 (in Chinese)
16 　Qiao A2M (乔爱民) ,Liu P2Y(刘佩瑛) ,Lei J2J (雷建军) . 1998.
RAPD analysis of sixteen varieties of mustard. Acta Bot S in (植物
学报) ,40 (10) :915～921 (in Chinese)
17 　Williams J PK , Kubelik AR ,Livak KJ . et al . 1990. DNA polymor2
phisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.
N ucleic Acids Res ,18 :6531～6535
18 　Wu S2M (吴树明) ,Lin J2X (林金星) ,Li Z2L (李正理) . 1993.
Comparative studies on wood rays anatomy off sixty2six plant
species in nine genera of Magnoliaceae in China. Acta Bot S in (植物
学报) ,35 (4) :268～279
19 　Zhang J2Y(张继益) ,Dong Y2C(董玉琛) ,Jia Z2Z(贾增增) ,et al .
1999. RAPD analysis for the germplasm resources of genus Ere2
mopyrum . Acta Gene Sin (遗传学报) ,26 (1) :54～60 (in Chinese)
20 　Zou Y2P (邹喻苹) , et al . 2001. Molecular Markers in Systematic
and Evolutional Botany. Beijing :Science Press. 34～35 (in Chinese)
作者简介 　刘登义 ,男 ,1958 年 9 月生 ,博士 ,教授 ,博导 ;主
要从事植物种群生态学、生物多样性与保护生物学和环境生
态学研究 ,发表论文 60 余篇 ,出版专著两部. Tel : 05532
3869233 　E2mail :ldy @mail. ahnu. edu. cn
2411 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷