全 文 ：胶州湾浮游植物 rbcL 基因分子遗传多样性研究 3
刘永健　杨官品 3 3 　管晓菁
(中国海洋大学海洋生命学院 ,青岛 266003)
【摘要】　利用聚合酶链式反应扩增胶州湾表层海水浮游植物核酮糖 1 ,52二磷酸羧化/ 氧化酶大亚基基因 (
rbcL )片段 ,建立了该基因片段变异类型文库. 随机测定了 28 个 rbcL 片段序列 ,依此初步分析了胶州湾
表层海水浮游植物 rbcL 基因分子遗传多样性. 结果表明 ,春季胶州湾表层海水浮游植物优势种群为 D 类
rbcL 代表的浮游植物 ,其中隐藻占 2816 %、S t ramenopies 占 3211 %、定鞭藻占 2816 %、红藻占 316 %. B 类
rbcL 代表的浮游植物为绿藻 ,占 711 %. 根据各操作分类单元丰度计算的分子遗传多样性指数为 2185 ,根
据逆翻译成的氨基酸序列计算的序列多样性为 0120.
关键词 　浮游植物 　核酮糖 1 ,52二磷酸羧化/ 氧化酶大亚基基因 　分子遗传多样性
文章编号 　1001 - 9332 (2004) 09 - 1626 - 07 　中图分类号 　Q344 ,Q94312 　文献标识码 　A
Molecular genetic diversity of phytoplankton rbcL gene in Jiaozhou Bay. L IU Yongjian , YAN G Guanpin ,
GUAN Xiaojing ( College of M arine L if e Sciences , Ocean U niversity of China , Qingdao 266003 , China) .2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2004 ,15 (9) :1626～1632.
The variants of a 500 base pair fragment of RubisCo large subunit gene ( rbcL ) from the phytoplanktonic DNA of
Jiaozhou Bay surface seawater were amplified by using polymerase chain reaction and cloned. Twenty2eight clones
were randomly selected and sequenced ,which were further used to determine the molecular genetic diversity of
the phytoplankton of Jiaozhou Bay surface seawater. Systematic analysis showed that the clones representing
cryptophyta counted for 2816 % , S t ramenopiles 3211 % , Haptophyta 2816 % , Rhodophyta 316 % and
Chlorophyta 711 %. The sequences from Cryptophyta , S t ramenopiles , Haptophyta and Rhodophyta belonged to
type D of Form I rbcL and Chlorophyta to type B ,indicating that the dominant phytoplankton were those repre2
sented by type D rbcL . The genetic diversity index and the reversely translated amino acid sequence diversity of
Jiaozhou Bay phytoplankton were 2185 and 0120 ,which were determined by the abundances of operational tax2
onomy units and the reversely translated amino acid sequences respectively.
Key words 　Phytoplankton , Ribulose21 , 52bisphosphate carboxynase/ oxygenase large subunit gene ( rbcL ) ,
Molecular genetic diversity.
3 国家自然科学基金资助项目 (40176028) .3 3 通讯联系人. E2mail :yguanpin @mail. ouc. edu. cn
2003 - 05 - 29 收稿 ,2003 - 11 - 05 接受.
1 　引 　　言
卡尔文循环是生物有机体固定 CO2 、将光能转
化成化学能的主要途径 ,广泛存在于光合细菌、藻类
和绿色植物中. 核酮糖 1 , 52二磷酸羧化/ 氧化酶
( ribulose21 , 52bisphosphate carboxylase/ oxygenase ,
RubisCo)是卡尔文循环中固定 CO2 的关键酶 ,具有
催化 CO2 还原和 1 ,52二磷酸核酮糖氧化的双重功
能 ,参与地球碳循环 ,对农业和环境具有特殊意义.
RubisCo 可分为 3 种类型 : Ⅰ型存在于植物和一些
细菌中 ,是由 8 个大亚基 ( rbcL ) 和 8 个小亚基
( rbcS )形成的 16 聚体 L8 S8 ; Ⅱ型存在于某些细菌
中 ,通常是由大亚基形成的 2 聚体 L2 ;而 Ⅲ型 Ru2
bisCo 存在于一些古细菌中 ,由 2 个大亚基形成 2 聚
体 ,再由 5 个 2 聚体形成 10 聚体 (L2) 5 [17 ] . RubisCo
小亚基基因变异大 ,而大亚基基因 ( rbcL ) 相对保
守. RubisCo 大亚基基因是研究物种间系统学关系
比较恰当的指示基因 , 已广泛应用于植物系统
学[4 ,8 ,11 ,13 ,22 ,33 ] 、淡水浮游植物遗传多样性[3 ,23 ,34 ] 、
海洋浮游植物系统学及多样性[16 ,29 ,31 ] 、海洋浮游植
物群体 rbcL 基因表达及其海洋环境变化相关
性[24 ,25 ]等研究. 基于氨基酸序列差异 , Ⅰ型 rbcL 基
因又可分为 A、B、C、D 4 类[26 ,30 ] . A 类主要由原细
菌 (protobacteria) 组成 ;B 类包括蓝细菌、绿藻和高
等植物 ;C 类主要由部分原细菌构成 ;而D 类主要包
括杂色藻.
海洋覆盖地球表面约 70 % ,是生态系统最重要
的组成部分. 海洋浮游植物是初级生产者和食物链
的基础 ,其种类组成和群落结构因海洋环境而异 ,能
反映海洋环境变化 ;赤潮等海洋环境灾害直接与浮
游植物有关[36 ] . 用分子生物学方法 ,在 DNA 层次上
分析浮游植物多样性、剖分浮游植物群落结构、探索
浮游植物种属组成及其与环境因子的相互关系 ,是
应 用 生 态 学 报 　2004 年 9 月 　第 15 卷 　第 9 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Sep. 2004 ,15 (9)∶1626～1632
研究环境生物遗传多样性及其与环境因子相关性的
良好手段. 继根据形态分类和色素组成剖分浮游植
物群落结构之后 ,根据基因变异剖分群落结构、描述
多样性等已越来越受到重视. 目前 ,环境生物尤其是
环境微生物的分子遗传多样性研究已有较多报
道[1 ,12 ,14 ,32 ,35 ] .
胶州湾位于 35°38′～36°18′N ,120°04′～120°23E
之间 ,是一个中型半封闭浅海湾. 1980 年以来 ,以形态
分类为基础 ,对其生态学和生物资源进行了连续的实
验性研究[18 ,19 ] . 近年来 ,沿岸城市化和经济发展迅
速 ,胶州湾水体污染不断加重 ,迫切需要快速、客观的
方法监测其环境变化.为此 ,选择 rbcL 基因为环境指
示基因 ,先扩增、测序胶州湾水体 rbcL 基因片段 ,分
析浮游植物系统学关系和分子遗传多样性 ,以便研制
群落结构分子生物学剖分方法 ,分析浮游植物多样性
及其与环境因子的关系 ,最终用浮游植物分子遗传多
样性监测胶州湾环境质量.本文报道了春季胶州湾浮
游植物分子遗传多样性分析结果.
2 　材料与方法
211 　供试材料
于 2003 年 4 月上旬取胶州湾各生态观测站位[19 ]表层
海水 1 L 混合 ,立即带回实验室 ,在取样当天完成水样过滤
和 DNA 提取.
212 　研究方法
21211 海水总 DNA 提取 　用 0122μm 混合纤维素膜过滤海
水 ,富集海洋浮游生物 ;将浮游生物用液氮研磨 ,转入离心管
中 ;估计浮游生物生物量 ,当 ≤100 mg 时 ,加入 500μl 2 倍
CTAB 抽提缓冲液 (100 mmol·L - 1 Tris2HCl ,p H 810 ,114 mol
·L - 1 NaCl ,20 mmol·L - 1 EDTA ,p H 810 ,2 % (w/ v) CTAB ,
011 %(w/ v) PVPP) ;65 ℃保温 1 h ,用酚、氯仿抽提 ,获得浮
游生物总体混合 DNA[27 ] .
21212 PCR 扩增 　电泳后根据分子量标记粗略确定海水浮
游生物总 DNA 浓度 ,取约 50 ngDNA 为模板扩增 rbcL 基
因.根据 Ⅰ型 RubisCo rbcL 氨基酸高度保守序列 KPKL GLS
和 VV GKL EG 设计简并引物序列分别为 : 5’2AA (A G) CC
( TA) AA (A G) ( TC) TA GG( TG) (CT) T(A T) TC23’和 5’2CC
(TC) TC ( TC) A (A G) ( TC) TTA CC (A T) AC ( GA T) AC2
3’[34 ] . PCR 反应体系体积为 50μl ,含有 50 ng 模版 DNA ,4
mmol·L - 1 Mg2 + , dN TP 各 012 mmol·L - 1 ,正反向引物各
012μmol·L - 1 ,2 单位 Taq DNA 聚合酶和 1 倍缓冲液. 循环
条件为 95 ℃预变性 10 min ,接 94 ℃变性 1 min、50 ℃复性 2
min、72 ℃延伸 1 min30 个循环 ,再在 72 ℃延伸 20 min.
21213 PCR 扩增片段克隆、测序 　PCR 扩增片段经低熔点琼
脂糖凝胶回收、苯酚、氯仿纯化 ,连接到 pMD182T 载体上 (大
连宝生物) ,转化感受态 J M109 ,获得海水 rbcL 基因序列变
异类型集合文库. 随机挑选 30 个重组子 ,经商业服务测序.
21214 数据分析 　用 Chromas 软件 (Version 1162) 从测序峰
谱图中提取序列并剪除引物区. 用 DAMBE 软件 ( Version
411119)进行核苷酸序列和氨基酸序列多序列对位分析
(multiple alignment) ,用 MEGA (Version 211) 核苷酸序列逆
翻译成氨基酸序列 ,用邻接法 (Neighbor2Joining ,NJ ) 和最大
简约法 (Maximum Parsimony ,MP) 构建系统树[21 ] . 重复 500
次计算靴带值 (bootstrap) ,获得系统树各分支点的支持率.
用 Shannon 多样性指数 H = - Σf i ·Inf i 和操作分类单元
(Operational Taxonomic Unit ,O TU) 丰度计算浮游植物群体
遗传多样性 , f i 为某 O TU 占总克隆数的百分比. 用 MEGA
计算氨基酸序列多样性.
21215 GenBank 收录号 　将获得的核苷酸全部序列提交到
GenBank , 收 录 号 为 : PPJ ZS03 , A Y302470 ; PPJ ZS01 ,
A Y302471 ; PPJ ZS05 , A Y302472 ; PPJ ZS07 , A Y302473 ;
PPJ ZS08 , A Y302474 ; PPJ ZS09 , A Y302745 ; PPJ ZS10 ,
A Y302476 ; PPJ ZS27 , A Y302477 ; PPJ ZS25 , A Y302478 ;
PPJ ZS24 , A Y302479 ; PPJ ZS23 , A Y302480 ; PPJ ZS22 ,
A Y302481 ; PPJ ZS21 , A Y302482 ; PPJ ZS04 , A Y302483 ;
PPJ ZS17 , A Y302484 ; PPJ ZS18 , A Y302485 ; PPJ ZS19 ,
A Y302486 ; PPJ ZS11 , A Y302487 ; PPJ ZS12 , A Y302488 ;
PPJ ZS13 , A Y302489 ; PPJ ZS14 , A Y302490 ; PPJ ZS15 ,
A Y302491 ; PPJ ZS02 ,A Y302492.
3 　结果与分析
311 　RubisCo 大亚基的系统学分析
在 GenBank 中搜寻并下载浮游植物 rbcL 序
列 ,根据全长氨基酸序列 ,用最大简约法构建系统树
(图 1) ,确定浮游植物的系统学关系. rbcL 氨基酸
序列变异丰富 ,可分为 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型. Ⅰ型 rbcL 又分
成“green2like”和“red2like”两个主要类群 ,Watson[29 ]
根据进化关系将“green2like”rbcL 分为 A 和 B 两
类、将“red2like”rbcL 分为 C 和 D 两类. Ⅱ型只存在
于某些细菌中 , Ⅲ型仅存在于一些古细菌中.
312 　DNA 提取、rbcL 基因片段扩增、文库构建和
测序
采用 CTAB 法提取的胶州湾浮游植物总 DNA 见
图 2.提取的 DNA 分子量在 21 kb 左右 ,分子大小均
一 ,能用于 Hind Ⅲ酶切 ,也能用于 PCR 扩增反应 ,表
明提取的 DNA 质量较好. 另外 ,根据 DNA 分子量标
记可对 DNA 进行粗略定量 ,结果表明 ,从 1 L 海水可
以获得约 50μgDNA.Ⅰ型 rbcL 中有两个非常保守的
氨基酸区段 : KPKL GLS和 VV GKL EG,参考通用密码
子表和核苷酸序列 ,Xu 等[34 ]已经设计出了扩增Ⅰ型
rbcL 基因区段的 PCR 引物对 ,本研究直接合成和使
用了该引物对进行 PCR扩增反应.
72619 期 　　　　　　　　　　　　刘永健等 :胶州湾浮游植物 rbcL 基因分子遗传多样性研究 　　　　　　　　　　　
图 1 　根据 rbcL 氨基酸全序列用最大简约法构建的系统树
Fig. 1 Phylogenetic tree of full2length rbcL amino acid sequences re2
trieved from GenBank using maximum parsimony method.
M25396 : A llochromatium vinosum ;L02520 : A nabaena sp . ; E69454 :
A rchaeoglobus f ulgidus ; X62349 : Cryptomonas sp . ; M20655 : Chlorel2
la elli psoidea ;M59080 : Cylindrotheca sp . ;D45845 : Emiliania huxley2
i ; X52503 : Ectocarpus siliculosus ; D45846 : Chrysochrom ulina hi rta ;
L41063 : Gonyaulax polyedra ; X61918 : Heterosigma akashiwo;
D43266 : Hydrogenovibrio marinus ; U30276 : Micromonas pusilla ;
L32182 : M anganese2oxidizi ng bacterium S I8529 A 1 ; L22885 : Ni2
t robacter v ulgaris ; Z67753 : Odontella sinensis ; D11140 : Pleurochrysis
carterae ; X17597 : Porphyridium aerugineum ;D21833 : Prochlorococcus
marinus str . GP2 ; X57359 : Prochlorothri x hollandica ; D21834 :
Prochloron sp . P04718 : Rhodospi rill um rubrum ; M64624 : Rhodobac2
ter sphaeroides ; AJ400848 : S pinacia oleracea ; AF298221 : Sy mbiodini2
um sp . ;J01536 : Synechococcus sp . PCC6301 ; D13971 : Synechococcus
PCC7002 PR26 ;U30284 : Tet rase l mis marina ;AB01855 : Thermococ2
cus kodakaraensis ; L37437 : Thiobacill us denit rif icans ; X17252 : Xan2
thobacter f lav us.
　　在 50μl 反应体系中 ,固定模版 DNA 为 50 ng ,
保持其它条件不变 ,对 Mg2 + 浓度进行了优化. 发现
当 Mg2 +浓度为 4 mmol·L - 1时 ,扩增带均一 ,无拖
尾现象. 尽管产量不是最高 ,但能获得高质量的
PCR 产物 ,提高克隆效率 ,我们选取 4 mmol·L - 1为
Mg2 +最佳浓度. PCR 扩增情况见图 3. 由于 DNA 分
子量标记是定量的 ,根据标记用量 ,可以对 PCR 产
物进行粗略定量 ,并由此估计连接反应中外源 DNA
的用量 (图 3) .
图 2 　海洋浮游植物总 DNA 及其 Hind Ⅲ酶切结果
Fig. 2 Total DNA of marine plankton and its Hind Ⅲdigestion pattern.
1) Hind Ⅲ酶切 Total DNA digested by Hind Ⅲ; 2 ) 总 DNA Total
DNA ;3) DNA 分子量标记 DNA marker (λDNA/ EcoRI) . The average
length of total DNA is about 21 kb.
图 3 　浮游植物 rbcL 基因片段的 PCR 扩增
Fig. 3 Amplification of rbcL gene fragment from the total DNA of ma2
rine planktons.
　　按照最佳反应条件扩增 rbcL 基因片段 ,将 10
管反应产物合并 ,低熔点琼脂糖凝胶回收 ,酚/ 氯仿
抽提 ,溶于适量水中. 与定量 DNA 分子量标记同时
电泳估计浓度并调整到约 50 ng·μl - 1 . 固定载体为
50 ng ,计算外源片段与载体的摩尔比 ,按 5∶1 和 10∶
1 两个比例进行连接 ,转化 J M109 获得海洋浮游植
物 rbcL 基因片段变异类型集合质粒文库. 100 ng 载
体可以获得 400～500 个转化子 ,其中 90 %以上含
有外源片段. 随机挑选 30 个克隆送商业服务测序 ,
共获得 28 个 rbcL 基因片段变异类型的序列.
313 　 rbcL 基因多样性
将测序获得的原始数据转换成文本序列 ,剪切
掉载体和引物区并逆翻译成氨基酸序列. 序列多样
性分析可以直接用核苷酸序列 ,也可将核苷酸序列
转换成氨基酸序列后再进行分析. 进行海洋浮游植
物分子遗传多样性分析的长远目标是建立浮游植物
种属 DNA 鉴定方法和剖分群落结构的分子生物学
方法. 为了与基于 DNA 序列的分子生物学方法接
轨 ,直接利用核苷酸序列进行分子遗传多样性和分
子系统学分析是恰当的. 但是 , rbcL 基因产物是蛋
白质 ,有氨基酸序列 ,而且基因分型、已有的系统学
分析都基于氨基酸序列. 因此 ,首先将核苷酸序列转
换成氨基酸序列再进行系统学分析.
核苷酸分析表明 , 除 PPJ ZS04、PPJ ZS28 和
PPJ ZS16 ; PPJ ZS02、PPJ ZS26、PPJ ZS20 和 PPJ ZS06
的核苷酸序列相同外 ,其它核苷酸序列完全不同. 将
核苷酸序列翻译成氨基酸序列后发现 PPJ ZS04、
PPJ ZS28、PPJ ZS16 和 PPJ ZS17 ; PPJ ZS22、PPJ ZS02、
PPJ ZS26、PPJ ZS20 和 PPJ ZS06 的氨基酸序列相同 ;其
它氨基酸序列完全不同. 氨基酸序列差异变化较大 ,
从 PPJ ZS01/ PPJ ZS23、PPJ ZS07/ PPJ ZS08、PPJ ZS12/
PPJ ZS22 间相差一个氨基酸到 PPJ ZS01/ PPJ ZS05
相差 71 个氨基酸 ,全部氨基酸序列的平均差异为
32 个氨基酸.
314 　 rbcL 基因系统学分析
由 MP、NJ 法得到的系统树拓扑结构大致相似
8261　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
图 4 　基于氨基酸序列用邻接法构建的系统树
Fig. 4 Phylogenetic tree based on reversely translated amino acid sequences of clones using neighbor2joining method.
重复 500 次计算 bootstrap 值 Bootstrap value was calculated from 500 repetitions. 下同 The same below.
(图 4、图 5) ,在 NJ 树中 , PPJ ZS05 和 PPJ ZS09 位于
Chlorophyta 类 群 , 而 在 MP 树 中 , 它 们 与
Chlorophyta 互为姊妹类群. 不论在哪种系统树中 ,
它们都属于 B 类群. 在两种系统树中 , PPJ ZS18 和
PPJ ZS25 位 于 Cryptophyta 类 群 , 而 PPJ ZS07、
PPJ ZS08、PPJ ZS11、PPJ ZS13、PPJ ZS21 和 PPJ ZS27
与 Cryptophyta 互为姊妹类群 ; PPJ ZS15 位于
Rhodophyta 类 群 ; PPJ ZS01、PPJ ZS12、PPJ ZS14、
PPJ ZS22 和 PPJ ZS23 位于 Haptophyta 类群. 所得
rbcL 基因序列属于 B、D 类 rbcL ,没有发现 A、C 类
rbcL 基因. 按类划分 ,B 类有 2 个 ,占 711 % ,D 类有
26 个 ,占 9219 %.
　　用氨基酸序列构建系统树是为了确定克隆所属
类型 ,并不能确定这些克隆代表何种物种. 为了确定
各克隆代表物种 ,在 GenBank 中进行氨基酸序列搜
寻 ,参考 Andersen[2 ]和 Freshwater[10 ]研究进行氨基
酸序列比较. 表明在种属水平上 RubisCo 大亚基氨
基酸序列十分保守. 在种内 ,全长或近似全长氨基酸
序列最大变异为 5 个氨基酸 (约 1 %) , PCR 引物界
定的长度内氨基酸序列最大变异为 2 个氨基酸 (约
014 %) ,最小变异为零. 同一地域内 ,种间最大变异
分别为 10 个氨基酸 (约 3 %) 、4 个氨基酸 (约
217 %) ,最小变异为零. Elsaied[9 ] 发现 ,同一 O TU
氨基酸序列 100 %相似. 由此可以认为 ,只有氨基酸
序列完全相似 ,才能确定序列代表的物种 ,否则 ,只
确定更高的分类阶元. 根据这一标准 ,将所得氨基酸
序列在 GenBank 中进行氨基酸2氨基酸 BLAST 分
析 (结果未列出 ) , 搜寻最相似物种. 发现只有
PPJ ZS15 与 Porphyra sp . B W T2000 C 氨基酸序列
100 %相似 ,其它氨基酸序列与最相似物种序列相似
性为 87～98 %. 因此 ,只确认 PPJ ZS15 代表物种为
Porphyra sp . BWT2000C. 但 是 , Porphyra sp .
BWT2000C为大型海藻 ,可能是采样过程中采集到
大型海藻的孢子所致. 对其它氨基酸序列 ,根据它与
92619 期 　　　　　　　　　　　　刘永健等 :胶州湾浮游植物 rbcL 基因分子遗传多样性研究 　　　　　　　　　　　
图 5 　基于物种全长 rbcL 基因氨基酸序列和 PCR 扩增的浮游植物 rbcL 基因氨基酸序列用最大相似性构建的系统树
Fig. 5 Phylogenetic tree constructed according to full2length amino acid sequences of known species and those deduced from amplified plankton rbcL gene
fragments.
Ⅱ、Ⅲ型 RubisCo 作为终端类群 Form Ⅱand Form Ⅲ rbcL were used as outgroups.
其最相似物种之间的相似性及其在 NJ 、MP 系统树
中所处的位置 , 确定其分类地位. 结果表明 ,
PPJ ZS05 和 PPJ ZS09 代表克隆属于 Chlorophyta ;
PPJ ZS04、PPJ ZS16、PPJ ZS17、PPJ ZS28、PPJ ZS19、
PPJ ZS24、PPJ ZS10、PPJ ZS03 属 于 Stramenopiles ;
PPJ ZS23、PPJ ZS01、PPJ ZS02、PPJ ZS22、PPJ ZS26、
PPJ ZS20、 PPJ ZS06、 PPJ ZS12、 PPJ ZS14 属 于
Haptophyta ; PPJ ZS15 属 于 Rhodophyta ; PPJ ZS18、
PPJ ZS25 属于 Cryptophyta ,虽然 PPJ ZS08、PPJ ZS07、
PPJ ZS11、PPJ ZS21、PPJ ZS13、PPJ ZS27 为 PPJ ZS18、
PPJ ZS25 的姊妹类群 , 但根据其与最相似物种
Guillardia theta 的相似性 (87 %～95 %) 可初步确
认为属于 Cryptophyta .
春季胶州湾近岸海域只有少量 B 类 rbcL 代表
的浮游植物 ,属于 Chlorophyta ;优势种群为 D 类
rbcL 代表的浮游植物 ,且遗传多样性丰富 ,分属
Cryptophyta、S t ramenopiles、Haptophyta 和 Rhodo2
phyta , 优势类群为 Cryptophyta、S t ramenopiles、
0361　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷
Haptophyta ,分别占 2816 %、3211 %和 2816 %. 根
据各操作分类单元丰度计算的分子遗传多样性指数
为 2185 ,根据逆翻译成的氨基酸序列计算的序列多
样性为 0120.
4 　讨 　　论
Ⅰ型 rbcL 氨基酸序列与 Ⅱ、Ⅲ型差异很大 ,各
型之间 rbcL 氨基酸序列的相似性只有 25 %～
30 %[20 ,28 ] . 引物序列是根据 Ⅰ型 rbcL 保守氨基酸
序列设计的 ,不能覆盖 Ⅱ型和 Ⅲ型. 因此 ,对胶州湾
海域浮游植物 rbcL 基因分子遗传多样性的描述只
针对 Ⅰ型 rbcL 代表的浮游植物 ,不涉及具有 Ⅱ、Ⅲ
型 rbcL 代表的浮游生物.
在胶州湾发现了 B 和 D 两类 ,且 B 类 rbcL 数
量极少 (约 711 %) ,未发现 A、C 类 rbcL ,可能是我
们采用 0122μm 膜过滤 ,而 A 和 C 类 rbcL 主要是
原细菌 ,属微微型浮游生物 ,个体直径小于 0122
μm ,过滤收集不到.
核苷酸序列变异较氨基酸序列大. 当分析物种
进化关系较近时 ,核苷酸序列能更好地反映物种之
间的系统学关系. 当要分析的物种进化关系比较远
时 ,由于密码子存在简并性 ,氨基酸序列也许能更好
地反映物种之间的系统学关系. Daugbjerg 等[5～7 ]认
为 ,密码子第三位核苷酸是不能反映进化关系 ,因此
在用核苷酸序列进行分析时 ,删除密码子第三位核
苷酸 ,只用密码子第一和第二位核苷酸提供的信息
构建系统树. 本研究试图研究自然海水中浮游植物
的多态性 ,因此将 1 ,52二磷酸核酮糖羧化/ 氧化酶
核苷酸序列逆翻译成蛋白质序列 ,再进行数据分析.
用分子生物学手段描述生物多样性是在基因水
平上进行的. rbcL 基因位于叶绿体基因组中 ,而一
个细胞可能含有多个叶绿体. 实际上 ,本研究的分析
单位就是叶绿体. 传统描述方法是在个体水平上进
行的 ,以个体为单位 ,直接反映各物种数量. 因此 ,用
叶绿体为单位描述浮游植物多样性 ,可能与以物种
个体为单位的分析结果不一致.
不同海水层、不同地点浮游生物构成及数量存
在差异. 本研究只取了不同站位表层水混合进行分
析.如果需要分析浮游植物分子遗传多样性与海洋
环境间的关系 ,样品采集应多位点、多层次 ,以准确
反映浮游植物的多态性. 拟在分子遗传多样性分析
的基础上 ,建立海洋浮游植物群落结构剖分的分子
生物学技术 ,并用于大规模海洋环境与浮游生物群
落结构相关性的研究.
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作者简介 　刘永健 ,男 ,1977 年出生 ,硕士生 ,主要从事海洋
浮游植物多态性方面的研究 ,发表论文 2 篇. Tel : 05322
2031636 ; E2mail :liuyongjian007 @hotmail. com
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2361　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　15 卷