全 文 ： 红千层愈伤组织诱导及植株再生
伍成厚 1, 2 ,冯毅敏 1 ,叶振华 1 ,朱　纯 1 ,龙丽萍 1
( 1.广州市园林科学研究所 ,广东 广州 510405; 2.厦门大学生命科学学院 ,福建 厦门 361005)
摘　要: 以茎段、芽和叶片为材料 ,研究了红千层愈伤组织诱导及植株再生的方法。 结果表明: 红千层的茎
段、芽和叶片均可诱导出愈伤组织 ,通过继代培养愈伤组织可发育成绿色和粉红色 2种类型 ,其中绿色、致密
的愈伤组织可以分化出不定芽。培养基 1 /2M S+ 6-BA1. 0 mg /L+ N AA0. 1 mg /L适宜愈伤组织不定芽的诱
导 ,在培养基 1 /2M S+ IBA0. 25 mg /L上试管苗的生根率可达 95%。
关键词: 红千层 ;愈伤组织诱导 ;植株再生 ;组织培养
中图分类号: S685. 99; Q945. 52　 文献标识码: A 　文章编号: 1003- 8981( 2007) 03- 0011- 04
Callus Induction and Plant Regeneration in Callistemon rigidus
WU Cheng-hou1, 2 , FENG Yi-min1 , YE Zhen-hua1 , ZHU Chun1 , LONG Li-ping1
( 1. Guang zhou Institute o f Landscape and Garden, Guang zhou 510405, Guangdong , China;
2. Schoo l o f Life Science , Xiamen Univ er sity , Xiamen 361005, Fujian, China)
Abstract: Taken stem segment, bud and leaf as ma teria ls, the means o f callus induction and
plant reg ene ration in Callistemon rigidus R. Br. wer e studied. The r esults showed tha t callus
could be induced from all types of the ma teria ls, pink and g reen callus could be gain th rough
subculture, and adventitious buds could be induced fr om the compacted g r eens. Th e optimal
medium fo r inducing adventitious bud was 1 /2MS supplemented w ith 6-BA1. 0 mg /L and
NAA0. 1 mg /L, and the optimal one for test-tube plantlets ro o ting wa s 1 /2M S supplemented
with IB A0. 25 mg /L , in which the roo ting ra te could be up to 95% .
Key words: Callistemon rigidus R. Br. ; callus induction; plant reg ene ration; tissue cultur e
红千层 Call istemon rigidus R. Br.为桃金娘科红千层属常绿小乔木 ,原产于澳大利亚。树冠圆球形 ,株高 3
～ 5 m。花鲜红色 ,穗状花序生于近枝顶 ,形似瓶刷 ,盛开时红压枝头 ,极为美观 ,为近年来庭院观花、行道景观、
小区绿化的首选树种。 组织培养技术具有繁殖速度快、繁殖系数大、繁殖方式多、变异少、可获得无毒苗并可进
行周年工厂化生产等优点 ,已在多种经济林树种的快繁中得以应用 [1～ 5 ]。有关红千层的组织培养研究近年来有
所报道 ,并已经应用于种苗的快速繁殖 [6～ 10 ]。笔者通过茎段、芽和叶片培养来获得愈伤组织 ,来实现愈伤组织
的高频率再生 ,旨在为红千层的遗传转化和新品种培育打下基础。
1　材料与方法
1. 1　材　料
试验材料为广州市园林科学研究所新引进的垂枝型红千层 ,开花期 1～ 4月。
1. 2　方　法
1. 2. 1　愈伤组织的诱导
4～ 6月取当年生半木质化枝条 ,剪除叶片 (保留叶柄 )后置于烧杯中 ,用自来水冲冼干净。 在无菌条件下 ,
经济林研究　 2007, 25( 3): 11-14
Nonwood　 Forest　Research 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
收稿日期: 2007-03-07
基金项目: 广东省科技计划项目 ( 2004B60302006) ;广州市科技计划项目 ( 004Z3-E0361)。
作者简介: 伍成厚 ( 1968- ) ,男 ,湖南绥宁人。 讲师 ,博士 ,主要从事园林植物组织培养的研究与推广应用。
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1003 -8981. 2007. 03. 005
先用 70%酒精消毒 10 s,再用 0. 1%升汞消毒 8 min,以无菌水清洗 5～ 6遍后 ,将枝条切成 1～ 2 cm长的茎段作
为外植体接种到培养基上。 接种 30 d后统计愈伤组织的诱导率。
　　愈伤组织的诱导率= (产生愈伤组织茎段数 /外植体数 )× 100%
1. 2. 2　不定芽的诱导
愈伤组织每 30 d继代培养 1次。将继代 2～ 3次的愈伤组织转至分化培养基上进行不定芽的诱导 ,每个培
养基接种 5瓶 ,每瓶接种愈伤组织 10块 , 45 d后统计不定芽的诱导率和增殖倍数。
　　不定芽诱导率= (形成不定芽的愈伤组织块数 /接种愈伤组织块数 )× 100%
　　不定芽的增殖倍数= 不定芽数 /接种愈伤组织块数
1. 2. 3　试管苗的生根和移栽
将 2 cm长的无根苗切下 ,接种到生根培养基上进行不定根诱导 , 25 d后观察生根结果。炼苗 7～ 10 d,用自
来水冲洗干净根部的培养基后将试管苗移栽到托盘中 ,栽培基质为泥炭掺粗河沙 ( 1∶ 1)。 移栽 15 d后随机抽
查 100株统计移栽成活率 ,移栽成活率= (成活苗数 /统计苗数 )× 100% 。
1. 2. 4　培养基与培养条件
以 MS、 1 /2M S(大量元素减半 )为基本培养基 ,添加不同浓度的 6-BA、NAA、 IBA、椰乳 ( CM ) ,所有培养基
均含精制白砂糖 3% 、卡拉胶 0. 51% , pH值为 5. 8。培养温度 ( 26± 1)℃ ,光强 1 500 lx ,光照时间 10 h /d。
2　结果与分析
2. 1　愈伤组织的诱导
接种 10 d后 ,腋芽开始萌发 ,同时在茎段基部切口部位脱分化形成淡黄色的愈伤组织 ,随着培养时间延长
愈伤组织逐渐变成黄绿色 (图 1)。从表 1可以看出 ,在 MS培养基不添加生长素时不能诱导出愈伤组织。添加 0.
1～ 0. 5 mg /L的 NAA后茎段可以产生愈伤组织 ,在 3、 6、 7号培养基上愈伤组织的诱导率均可达到 100%。
茎段在不添加任何生长调节物质的 MS培养基上腋芽的萌发率最高 ,可达 37. 5%。将萌发的腋芽接种到 4
号培养基 ,在芽基部和接触培养基的基部叶片也可形成淡黄色至黄绿色、质地致密的愈伤组织 (图 2、 3) ,这类愈
伤组织与茎段诱导的愈伤组织在外观上没有明显差别。
图 1　茎段诱导的愈伤组织 图 2　芽基部诱导的愈伤组织 图 3　基部叶片诱导的愈伤组织
表 1　不同培养基对红千层茎段培养的影响
序号 培养基 外植体数
/块 产生愈伤组织茎段数 /块 愈伤组织诱导率 /% 萌芽数/个 萌芽率 /%
1 M S 56 0 0. 0 21 37. 5
2 M S+ N AA 0. 1 mg /L 24 18 75. 0 1 4. 2
3 M S+ N AA 0. 5 mg /L 20 20 100. 0 2 10. 0
4 M S+ 6-BA 1. 0 mg /L+ NAA 0. 1 mg /L 48 42 87. 5 1 2. 1
5 M S+ 6-BA 2. 0 mg /L+ NAA 0. 1 mg /L 47 33 70. 2 0 0. 0
6 M S+ 6-BA 0. 2 mg /L+ NAA 0. 5 mg /L 38 38 100. 0 4 10. 5
7 M S+ 6-BA 1. 0 mg /L+ NAA 0. 5 mg /L 43 43 100. 0 6 14. 0
8 M S+ 6-BA 2. 0 mg / L 26 0 0. 0 3 11. 5
12 经　　济　　林　　研　　究 第 25卷　
2. 2　植物生长调节物质对不定芽诱导的影响
通过继代培养 ,在 MS+ 6-BA 0. 2 mg /L+ N AA 0. 5 mg /L培养基上愈伤组织呈黄绿色、致密、颗粒状 ,在
MS+ 6-BA 1. 0 mg /L+ N AA 0. 5 mg /L培养基上愈伤组织为黄绿色 ,质地松软 ,在 MS+ 6-BA2. 0 mg /L+
N A A0. 5 mg /L培养基上愈伤组织接触培养基处逐渐变黑 ,愈伤组织表面呈黄褐色。在这 3种培养基上愈伤组织
均会形成表面湿润、光滑、颗粒状的粉红色愈伤组织 ,这类愈伤组织继续培养后逐渐变松软 ,不能诱导出不定芽。
图 4　伸长的不定芽丛
　　在 M S+ 6-BA 0. 3 mg /L+ N AA 0. 1 mg /L培养基上 ,愈伤组织绿
色、松软 ,少量致密 , 50块愈伤组织仅能诱导出 1棵小植株 ,诱导率 2. 5% 。
在 MS+ 6-BA1. 0 mg /L+ N AA0. 1 mg /L培养基上 ,愈伤组织呈绿色致
密颗粒状 ,不定芽的诱导率 100% ,增殖倍数 6. 7倍 ,在此培养基上不定芽
还可伸长生长成无根苗 (图 4)。
2. 3　大量元素和椰乳对不定芽诱导的影响
在 MS+ 6-BA 1. 0 mg /L+ N AA 0. 1 mg /L培养基上 ,愈伤组织再生
的丛生芽可以正常伸长 ,但木质化程度低。在 1 /2M S+ 6-BA1. 0 mg /L+
N A A0. 1 mg /L培养基上 ,愈伤组织不定芽的诱导率也可达到 100% ,增
殖倍数 7. 2倍 ,形成的丛生芽木质化程度较高 (图 5, B) ,在其它条件不变
的情况下 ,仅将 CaCl2· 2H2O的用量提高 1倍 ,即 440 mg /L,愈伤组织即
大量褐化 ,不定芽的增殖倍数仅 1. 7倍 (图 5, A) ,在此培养基中加入体积分数为 10%的椰乳 ,不定芽的分化也不
能明显改善 (图 5, C)。
图 5　大量元素和椰乳对不定芽诱导的影响
( A. 1 /2 M S; B. CaCl2· 2H2O为 440 mg /L ,其它条件同 A培养基 ; C. B培养基加入 10%的椰乳 )
2. 4　生根诱导与试管苗移栽
无根苗在生根培养基上培养 10 d即开始长出白色的根 ,当 MS培养基不添加生长素时 ,培养 25 d生根率
20. 5% 。培养基中添加生长素可以提高无根苗的生根率 ,但同时也在无根苗的基部诱导出愈伤组织 ,生长素质
量浓度越高诱导的愈伤组织量也越多。适宜生根的生长素质量浓度 NAA是 0. 2 mg /L, IBA是 0. 25 mg /L,超
过此质量浓度 ,生根率随着生长素质量浓度的提高反而下降。在生长素质量浓度相同的条件下降低培养基大量
元素的质量浓度有利于红千层试管苗生根 , 1 /2 M S+ IBA0. 25 mg /L培养基最适于生根 ,培养 25 d平均根数 2.
9条 ,生根率 82. 5% (表 2)。在此培养基上培养 40 d,生根率在 95%以上 (图 6)。
图 6　生根的试管苗 图 7　移植成活的试管苗
13第 3期 伍成厚等:红千层愈伤组织诱导及植株再生
表 2　培养基对红千层生根的影响†
序号 培养基 总苗数/棵 长根数/条 生根率 /% 平均根数/条 长愈数/块 长愈率 /%
1 M S 88 18 20. 5 1. 3± 0. 5 0 0
2 M S+ IBA 0. 10 mg / L 103 26 25. 2 1. 2± 0. 4 99 96
3 M S+ IBA 0. 20 mg / L 78 24 30. 8 1. 6± 0. 8 78 100
4 M S+ IBA 0. 25 mg / L 94 30 31. 9 1. 5± 0. 7 94 100
5 M S+ IBA 0. 50 mg / L 76 20 26. 3 1. 7± 0. 8 76 100
6 M S+ N AA 0. 10 mg /L 81 20 24. 7 1. 5± 0. 6 81 100
7 M S+ N AA 0. 20 mg /L 83 26 31. 3 1. 4± 0. 6 83 100
8 M S+ N AA 0. 25 mg /L 83 20 24. 1 1. 3± 0. 5 83 100
9 M S+ N AA 0. 50 mg /L 62 5 8. 1 1. 4± 0. 6 83 100
10 1 /2 MS+ IBA 0. 25 mg /L 80 66 82. 5 2. 9± 1. 4 80 100
11 1 /2 MS+ NAA 0. 25 mg /L 93 32 34. 4 1. 4± 0. 7 93 100
　　† 根长 0. 2 cm才计数。
　　炼苗 7 d,将试管苗从培养瓶中取出 ,自来水冲洗干净后移栽到托盘中 ,保湿遮阴 , 90%以上的移栽植株能
够成活 (图 7)。
3　结论与讨论
( 1)红千层的茎段、芽和叶片均可诱导出愈伤组织 ,在培养基 MS+ 6-BA0. 2 mg /L+ N AA0. 5 mg /L和培
养基 MS+ 6-BA1. 0 mg /L+ N AA0. 5 mg /L上 ,红千层愈伤组织的诱导率均可达 100% ;培养基 1 /2M S+ 6-BA
1. 0 mg /L+ N AA0. 1 mg /L较适宜愈伤组织不定芽的诱导 ;在培养基 1 /2M S+ IBA0. 25 mg /L上 ,试管苗的
生根率最高。
( 2)前人报道红千层无根苗基部 [ 6～ 8]和叶片 [8, 9 ]可以诱导出愈伤组织 ,本试验结果表明红千层的茎段和芽
基部的叶片也是很好的愈伤组织诱导材料。愈伤组织通过继代培养可以产生粉红色和绿色 2种颜色的愈伤组
织。在刚果 12号桉 Eucalyptus 12A BL组织培养中 ,红色愈伤组织可以分化出不定芽 [11 ] ,本试验中红千层的粉
红色愈伤组织继续培养后逐渐变松软不能诱导出不定芽 ,绿色致密的愈伤组织则可大量诱导出不定芽。
( 3)前人报道红千层的愈伤组织在 MS+ 6-BA1. 0 mg /L+ N AA0. 1 mg /L培养基上产生的丛生芽因木质
化程度低 ,需要经过壮苗培养才可用于生根诱导 [6, 7, 10 ] ,本试验中通过降低培养基大量元素的质量浓度即可获
得较高木质化程度的从生芽 ,较好地解决了这一难题。
( 4)试验中若 CaCl2· 2H2O的质量浓度未变 ,仅降低其他大量元素的质量浓度反而会抑制不定芽的再生 ,
因此红千层愈伤组织的再分化过程中 CaCl2· 2H2 O的作用值得注意。在蝴蝶兰 Phalaenopsis愈伤组织培养中 ,
椰乳对愈伤组织的再分化有促进作用 [12 ] ,而在红千层愈伤组织再分化过程中椰乳却未能产生类似的效果。
参考文献:
[1 ]　何志祥 ,曾艳玲 ,谭晓风 .翠冠梨茎段组织培养的研究 [ J] .中南林学院报 , 2006, 26( 1): 66- 68.
[2 ]　姜镇荣 ,韩文忠 ,姜镇华 ,等 .欧洲花楸试管苗移栽技术 [ J]经济林研究 , 2006, 24( 3): 56- 58.
[3 ]　李小川 ,张华通 ,周丽华 ,等 .迷迭香带芽茎段的组织培养技术 [ J].经济林研究 , 2006, 24( 3): 15- 20.
[4 ]　欧菊泉 ,陈雪香 ,丁利华 ,等 .杖愈伤组织的诱导及其白藜芦醇形成初探 [ J].中南林学院学报 2006, 26( 3): 24- 27.
[5 ]　金晓玲 ,何　平 ,张日清 .大果榉未成熟胚愈伤组织的诱导和植株再生 [ J] .中南林学院学报 , 2006, 26( 5): 98- 101.
[6 ]　龚　伟 ,宫渊波 ,胡庭兴 ,等 .红千层的组织培养与快速繁殖 [ J].四川农业大学学报 , 2003, 21( 4): 259- 360.
[7 ]　龚　伟 ,宫渊波 ,胡庭兴 ,等 .红千层离体培养和植株再生 [ J].植物生理学通讯 , 2004, 40( 1): 66.
[8 ]　江洪如 ,余发新 ,刘腾云 .红千层的离体培养及快速繁殖 [ J] .园艺学报 , 2005, 32( 3): 541- 543.
[9 ]　商宏莉 ,汪卫星 ,向素琼 ,等 .利用组织培养技术进行红千层多倍体诱导 [ J].西南农业大学学报: 自然科学版 , 2003, 25( 5): 396- 399.
[10]　瞿素萍 ,熊　丽 ,屈云慧 ,等 .红千层组培苗的工厂化生产技术 [ J] .中国种业 , 2004, ( 4): 32- 33.
[11]　谭德冠 ,庄南生 ,黄华孙 .刚果 12号桉愈伤组织的诱导与再生植株快繁体系的构建 [ J].热带作物学报 , 2005, 26( 3): 24- 29.
[12]　 Ishii Y, Takamura T, Goi M , et al . Ca llus induction and soma tic embryogenesis o f Phalaenopsis [ J]. Plant Cell Rep, 1998, 17: 446- 450.
[本文编校:闻　丽 ]
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