全 文 ：云南地不容指纹图谱和主要成分定量分析方法研究*
阎　红 , 马云淑△ , 程　欣 , 张晓雷
(云南中医学院中药学院 , 云南昆明　650200)　①　
　　摘　要:目的:探讨云南地不容 HPLC指纹图谱与其 4种主要生物碱成分的定量分析相结合的分析方法 , 以
评价药材的整体质量 。方法:Agilent Zorbax C18柱 (4.6mm ×250mm , 5μm), 甲醇—水—三乙胺系统为流动相梯
度洗脱 , 流速 1.0mL m in-1 , 柱温 30℃, 检测波长 282nm。结果:10批不同产地云南地不容 HPLC指纹图谱中
共确定 12个共有峰 , 各峰相对保留时间 RSD小于 1.90%. 10批样品相似度均大于 0.9;青风藤碱 、克班宁 、罗
默碱和千金藤碱的含量分别为 1.68% ～ 0.48%、 1.50% ～ 0.76%、 0.93% ～ 0.50%和 0.01% ～ 0.29%. 结论:
HPLC指纹图谱与主要成分含量测定相结合能更全面评价云南地不容整体质量 , 可用于云南地不容及其制剂的
研究 。
　　关键词:云南地不容;指纹图谱;含量分析;HPLC
　　中图分类号:R284 2　　文献标识码:A　　文章编号:1000— 2723(2007)03—0009— 06
　　云南地不容 (S tephan ia yunnanensis H. S.
Lo) 为 防 己科 (Menispermaceace) 千 金 藤属
(S tephania)植物 , 主要分布于云南 。研究表明云
南地不容含青风藤碱 (S inoacu tine)、 1-四氢巴马
汀 (1-tetrehydropa lmatine)、 千金藤碱 (S tepha-
nine)、 罗默碱 (Roeme rine)、 去氢克班宁 (de-
hydrocrebanine)、 克班宁 (C rebanine)等多种生物
碱类化合物 [ 1 ～ 2] 。由于地理环境 、 气候条件 、 采收
等因素影响 , 不同来源的同一药材质量多存在差
异 。因此在质量控制上仅以一种指标成分的定量
分析不能从整体上反映中药的内在质量。为了确
保药材质量 , 本文以云南地不容为研究对象 , 将
该药材化学指纹图谱分析与青风藤碱 、 克班宁 、
罗默碱和千金藤碱含量测定相结合 , 以指纹图谱
相似度和关键成分含量限度为指标评价该药的整
体质量 。
1　仪器与材料
仪器:Ag ilent1100高效液相色谱仪 , 二极管
阵列检测器 (DAD), Agilent色谱工作站 。试剂:
甲醇:色谱纯 (F isher), 三乙胺:(分析纯 , 上海
化学试剂有限公司), 水 (蒸馏水 )。对照品:所
有对照品均由云南中医学院中药化学教研室饶高
雄教授提供。所有对照品均经光谱鉴定 , HPLC法
检测无杂质干扰 。生药样品:均由本院药剂教研
室马云淑教授鉴定并提供。
2　色谱条件
色谱柱:Agilen t Zorbax C18 (4.6mm ×250mm ,
5μm)。流动相以 A和 B作梯度洗脱 , A为甲醇:
水:10%三乙胺甲醇液 (40∶60∶0.1), B为甲醇:
10%三乙胺甲醇液 (100∶0.5), 梯度洗脱程序:
0m in, 流动性比例 100∶0;10m in , 88∶12;15m in,
73∶27;45m in, 42∶58, 55m in, 42∶58。流速:
1.0mL m in- 1 , 检测波长:282nm , 柱温:30℃。
3　实验溶液制备
3.1　对照品溶液的制备
精密称取 4种对照品各适量 , 加甲醇制成
(0.95 ～ 1.45) mg /mL的溶液 , 作为储备液 , 分别
精密移取各对照品溶液 0.1 ～ 0.5mL置 10mL容量
瓶中 , 加甲醇稀释至刻度 , 摇匀 , 即得 。色谱图
见图 1 - a。
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第 30卷第 3期　　　　　　　　　　　　　　云南中医学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　Vo.l 30 No. 3
　 2007年 6月　 　　　　　　　　　　 Jou rnal of Yunnan Col lege of Trad itionalC h inese M edicine　　　　　　　　　　　　　 6. 2007　
① *基金项目:云南省自然科学基金重点项目 (NO:2002C0006Z)
收稿日期:2006— 12—06　　修回日期:2007— 01—11
作者简介:阎红 (1978 ～), 女 , 河南郑州人 , 本院 2004级研究生 , 研究方向中药资源开发与利用 。 △通讯作者:马
云淑 , E—mail:Yunshum a2@126. com
3.2　供试品溶液的制备
取样品粗粉约 0.4g, 精密称定 , 精密加入甲
醇 25mL, 称定重量 , 超声处理 40m in , 放置至室
温 , 再称定重量 , 用甲醇补足减失重量 , 摇匀 ,
以 0.45μm滤膜滤过 , 即得 。色谱图见图 1 - b。
图 1　对照品和供试品色谱图
a. 对照品　　b. 供试品　　1. 青风藤碱;2. 克班宁;3. 罗默碱;4. 千金藤碱
4　方法学考察
4.1　标准曲线及线性范围
取对照品溶液分别进样 1, 2, 5, 10, 12 ,
15μL, 以色谱峰面积为纵坐标 Y, 进样量 (μg)
为横坐标 X , 绘制标准曲线 , 青风藤碱 、 克班宁 、
罗默碱和千金藤碱的回归方程分别为:Y =
1250.49X +8.05　 r =0.9999;Y =3698.61X +
47.70　 r =0.99995;Y =2766.81X +8.34　 r =
0.99995;Y =4088.12X +2.11　 r=0.9999。分别
在 0.24 ～ 3.64μg, 0.29 ～ 4.39μg, 0.12 ～ 1.72μg,
0.012 ～ 0.18μg范围内与其峰面积呈良好的线性
关系。
4.2　精密度试验
精密吸取对照品溶液 10μL, 连续进样 6次 ,
测得峰面积 , 青风藤碱 、 克班宁 、 罗默碱和千金
藤碱 4种成分的 RSD分别为:0.91%、 0.77%、
0.76%、 0.92%.
4.3　重现性试验
精密称定同一份样品 , 按供试品制备的方法
分别制备 6份供试品溶液 , 分别测定 。结果青风藤
碱 RSD =1.92%、 克班宁 RSD =1.82%、 罗默碱
RSD=2.01%、 千金藤碱 RSD=2.23%.
4.4　稳定性试验
精密称定同一份样品 , 按供试品制备的方法
制备供试品溶液 , 分别于 0, 2, 4, 8, 12h进样
10μL, 测定。结果青风藤碱 RSD =0.64%、 克班
宁 RSD=0.41%、 罗默碱 RSD=0.49%、千金藤碱
RSD=1.36%.
4.5　回收率试验
精密称取已知含量的样品约 0.2g, 分别精密
加入一定量的对照品储备液 , 按 “ 3.2” 项下方法
制备 5份所需溶液 , 按 “ 2” 项下测定方法测定 ,
计算加样回收率。青风藤碱 、 克班宁 、 罗默碱和
千金藤碱加样回收率平均值分别为 99.7%、
99.6%、 103.2%、 104.1%, 加样回收率的 RSD
(%)分别为:1.9%、 1.3%、 1.3%、 3.3%. 可
见 , 加样回收率较为理想。
5　样品测定
取不同产地云南地不容药材 , 按 “ 3.2” 项下
方法制备所需溶液 , 按 “ 2.1” 项下测定方法测
定 , 每个产地样品平行 5次后取平均值 , 实验结果
见表 1。
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2007年　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　云南中医学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 30卷
表 1　药材中生物碱的含量测定结果 (%)
样品编号 来源 生物碱
sinoacu tine creban ine roem erine stephanine
S1 Y 1.333 1.499 0.677 0.058
S2 GM 0.927 1.174 0.672 0.144
S3 GS 1.102 1.169 0.534 0.033
S4 GP 1.198 1.159 0.606 0.061
S5 GPD 1.379 1.422 0.934 0.152
S6 GY 1.171 0.986 0.612 0.093
S7 GD 1.680 1.194 0.794 0.292
S8 GX 0.905 0.918 0.524 0.045
S9 GL 0.477 0.752 0.338 0.010
S10 LH 0.718 1.253 0.502 0.091
平均值 1.089 1.153 0.619 0.098
　　注:英文字母代表样品采集地 (Y:云县;GM:耿马
勐撒镇;GS:耿马十公里;GP:耿马四排山老寨;GPD:
耿马四排山东坡;GY:耿马贺派永安;GD:耿马大丫口
村;GX:耿马小黑江;GL:耿马贺派落阳;LH:粱河平
山 )。
由表 1可见不同产地的云南地不容药材中各生
物碱含量有一定差异 。 10批样品中克班宁含量高
于平均值的有 7批 , 在这 7批样品中青风藤碱含量
高于平均值的占其中的 6批 , 而罗默碱含量高于平
均值的仅有 4批 , 千金藤碱含量高于平均值的仅有
3批 , 说明后两者含量没有明显的规律 , 青风藤碱
和克班宁含量的高低在药材评价中起着重要的作
用 。参照 《中药新制剂开发与利用》制定青风藤
碱和克班宁的含量限度分别为 0.76%和 0.81%[ 3] 。
6　指纹图谱的建立
6.1　指纹图谱获取
照 “ 3.2” 项下方法制备供试品溶液 , 照 “ 2”
项下色谱条件记录色谱图 , 共测定 10批云南地不
容样品 (样品编号及来源参照 “5” 项)。经比较
分析有 12个峰是 10批样品共有的。选择克班宁
(S)为参照物 , 计算各共有指纹峰的相对保留时
间 (α=ti /t8)及峰面积比值 (AR =A i /A 8), 表 2
为 10批样品指纹图谱共有峰相对保留时间 , 表 3
为 10批样品指纹图谱共有峰峰面积比值。图 2为
耿马小黑江产云南地不容 (GX)的指纹图谱。
图 2　耿马小黑江产云南地不容 (GX)的指纹图谱
　　　　　　　S　参照物克班宁　　　　　
　　图 3　10批云南地不容指纹图谱
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第 3期 阎　红 , 等:云南地不容指纹图谱和主要成分定量分析方法研究 　
表 2　10批样品指纹图谱共有峰相对保留时间
样品
编号
共有峰相对保留时间
峰 1 峰 2 峰 3 峰 4 峰 5 峰 6 峰 7 峰 8 峰 9 峰 10 峰 11 峰 12
1 0.296 0.400 0.445 0.873 0.888 0.926 0.946 1.000 1.021 1.072 1.105 1.272
2 0.308 0.403 0.441 0.875 0.891 0.933 0.951 1.000 1.023 1.073 1.106 1.288
3 0.300 0.408 0.440 0.874 0.885 0.926 0.946 1.000 1.021 1.072 1.104 1.275
4 0.299 0.405 0.457 0.873 0.885 0.926 0.946 1.000 1.021 1.072 1.104 1.273
5 0.308 0.404 0.445 0.875 0.889 0.934 0.951 1.000 1.023 1.073 1.106 1.288
6 0.310 0.408 0.453 0.876 0.890 0.934 0.951 1.000 1.023 1.073 1.106 1.289
7 0.308 0.405 0.445 0.875 0.891 0.933 0.951 1.000 1.023 1.073 1.105 1.288
8 0.310 0.408 0.453 0.876 0.892 0.934 0.952 1.000 1.023 1.073 1.105 1.289
9 0.295 0.390 0.456 0.872 0.885 0.926 0.946 1.000 1.021 1.072 1.105 1.273
10 0.303 0.413 0.441 0.874 0.886 0.927 0.946 1.000 1.021 1.072 1.104 1.276
平均 0.304 0.404 0.448 0.874 0.888 0.930 0.949 1.000 1.022 1.072 1.105 1.281
RSD% 1.90 1.53 1.47 0.14 0.31 0.42 0.31 0.00 0.09 0.05 0.05 0.60
表 2说明 10批云南地不容的 HPLC图谱中 12个共　　有峰在图谱中的相对位置稳定。
表 3　10批样品指纹图谱共有峰峰面积比值
样品 共有峰峰面积比值
编号 峰 1 峰 2 峰 3 峰 4 峰 5 峰 6 峰 7 峰 8 峰 9 峰 10 峰 11 峰 12
1 0.134 0.420 0.006 0.102 0.010 0.008 0.000 1.000 0.002 0.290 0.011 0.000
2 0.042 0.119 0.001 0.182 0.006 0.013 0.000 1.000 0.016 0.319 0.050 0.006
3 0.047 0.252 0.001 0.182 0.008 0.014 0.002 1.000 0.025 0.261 0.022 0.004
4 0.008 0.480 0.014 0.191 0.064 0.142 0.012 1.000 0.074 0.429 0.105 0.023
5 0.178 0.385 0.041 0.074 0.048 0.040 0.003 1.000 0.029 0.645 0.211 0.015
6 0.018 0.364 0.002 0.070 0.044 0.063 0.004 1.000 0.032 0.490 0.039 0.013
7 0.088 0.641 0.021 0.120 0.244 0.106 0.044 1.000 0.065 0.536 0.334 0.020
8 0.057 0.429 0.004 0.147 0.064 0.108 0.005 1.000 0.031 0.363 0.043 0.059
9 0.024 0.275 0.005 0.046 0.014 0.065 0.004 1.000 0.023 0.181 0.019 0.004
10 0.028 0.354 0.030 0.136 0.023 0.061 0.003 1.000 0.007 0.214 0.041 0.014
平均 0.062 0.372 0.013 0.125 0.053 0.062 0.008 1.000 0.030 0.373 0.087 0.016
6.2　方法学考察
为考察分析方法的可靠性 , 以 GX产云南地不
容为供试品 , 对仪器的精密度 , 方法重复性以及
稳定性做相应考察。
6.2.1　精密度试验
取同一供试品溶液按 “ 2” 项下色谱条件连续
进样 6次 , 分别对共有峰的相对保留时间及峰面积
比值进行考察 , 结果各共有峰相对保留时间 RSD
小于 0.25%, 规定峰面积比值的各色谱峰峰面积
比值 RSD小于 2.73%, 符合指纹图谱分析要求。
6.2.2　重复性试验
取同一批次供试品 6份 , 按 “3.2” 项下方法
制备供试品溶液 , 按 “ 2” 项下色谱条件进行分
析 , 分别对共有峰的相对保留时间及峰面积比值
进行考察 , 结果各共有峰相对保留时间 RSD小于
0.21%, 规定峰面积比值的各色谱峰峰面积比值
RSD小于 2.77%, 符合指纹图谱分析要求。
6.2.3　稳定性试验
取供试品溶液按 “ 2” 项下色谱条件 , 分别于
0, 2, 4, 8, 12h进样测定 , 分别对共有峰的相对
保留时间及峰面积比值进行考察 , 结果各共有峰
相对保留时间 RSD小于 0.24%, 规定峰面积比值
的各色谱峰峰面积比值 RSD小于 2.48%, 符合指
纹图谱分析要求。
6.3　指纹图谱的分析与评价
在 10批云南地不容供试品的 HPLC图谱中 ,
12
2007年　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　云南中医学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 30卷
由相对保留时间 (α)比较稳定的色谱峰 (RSD <
3%), 可以确定的共有峰有 12个;同时以克班宁
峰的峰面积作为 1, 计算其他各共有峰面积的比值
(单峰面积占总峰面积小于 10%的共有峰其峰面积
比值不作要求)。指纹图谱相似度是中药材供试品
指纹图谱与对照指纹图谱共有模式的相似性的量
度 。相似度比较属模糊信息分析法的一种 , 可以
量化描述指纹图谱相似性 , 即客观的数字化描述 。
本文采用 “药典委员会的中药色谱指纹图谱相似
度评价系统” 评价不同批次产地样品指纹图谱相
似性 。该软件的使用包括图谱导入 、 设参照图谱 、
保留时间多点校正 、 谱峰自动匹配 、 生成对照图
谱和相似度计算等几个主要步骤 。根据峰匹配结
果 , 计算样品指纹图谱与对照指纹图谱的整体相
似度 , 计算结果见表 4。
表 4　样品的相似度结果
样品
编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
对照指
纹图谱
S1 1.000 0.926 0.975 0.974 0.904 0.940 0.862 0.946 0.981 0.988 0.960
S2 0.926 1.000 0.980 0.909 0.924 0.958 0.849 0.953 0.944 0.945 0.963
S3 0.975 0.980 1.000 0.957 0.909 0.954 0.854 0.959 0.981 0.987 0.973
S4 0.974 0.909 0.957 1.000 0.913 0.940 0.889 0.940 0.956 0.973 0.960
S5 0.904 0.924 0.909 0.913 1.000 0.976 0.947 0.960 0.873 0.888 0.969
S6 0.940 0.958 0.954 0.940 0.976 1.000 0.929 0.988 0.929 0.938 0.992
S7 0.862 0.849 0.854 0.889 0.947 0.929 1.000 0.936 0.827 0.855 0.924
S8 0.946 0.953 0.959 0.940 0.960 0.988 0.936 1.000 0.933 0.949 0.986
S9 0.981 0.944 0.981 0.956 0.873 0.929 0.827 0.933 1.000 0.992 0.944
S10 0.988 0.945 0.987 0.973 0.888 0.938 0.855 0.949 0.992 1.000 0.959
由表 4知 10批样品指纹图谱与对照指纹图谱
比较 , 其相似度均大于 0.9, 表明 10批样品的相
似度较高。 S7与 S1、 S2、 S3、 S4、 S9和 S10相比
较相似度均小于 0.9, 表明 S7样品与其他品相似
度较低 , 说明不同产地的云南地不容存在一定的
差异。
7　讨论
中药的药效是多种成分共同作用的结果 , 具
有整体性 , 仅用单一成分或分析方法难以全面控
制中药的质量。指纹图谱分析体现多成分谱峰的
量比关系 , 含量测定则是准确定量的反映主要成
分的限度 , 两者相结合即是在一定相似度水平和
含量限度内考察药材质量。本文以云南地不容为
对象探讨了含量测定与指纹图谱相结合的分析方
法 , 这样的指纹图谱有定性和定量的双重意义 。
我们研究的云南地不容指纹图谱具有较好的稳定
性和重复性 , 10批样品的指纹图谱的相似度均大
于 0.9, 符合国家药典委员会颁布的 “中药注射剂
色谱指纹图谱实验研究技术指南 ” 的要求。但是
耿马大丫口村出产的云南地不容与其他产地的样
品存在一定的差异。同时各批样品指纹图谱与其 4
种主要成分的含量相比较不完全一致。以峰面积
相对较大的克班宁为例 , 云县产样品 (编号 S1)
克班宁含量最高 1.499%, 而耿马贺派永安产样品
(编号 S6)克班宁含量为 0.986%, 但是 S1样品的
相似度 0.960明显低于 S6样品的相似度 0.992,
说明仅以含量指标考察药材质量可能得出片面的
结论 。经实验确证峰 2、 4、 5、 10、 11、 12分别为
青风藤碱 、 荷包牡丹碱 、 suknodiam ine、 罗默碱 、
千金藤碱和去氢克班宁 。
色谱条件的优化①流动相的选择:试验中先
后选择了甲醇 —水 、 甲醇—水—三乙胺 、 乙腈 —
水—三乙胺流动相系统 , 甲醇—水系统难以实现
分离 , 甲醇—水—三乙胺系统和乙腈 —水 —三乙
胺系统分离效果相差不大 , 考虑到实验成本最终
选定甲醇 —水 —三乙胺系统 。 ②检测波长的选择:
采用二极管阵列 200 ～ 400nm扫描 , 综合考虑云南
地不容中各主要成分的吸收光谱 , 使各被测组分
均有较大的吸收 , 选用 282nm为检测波长。
实验中以甲醇为提取溶剂 , 考察了超声提取 、
回流提取 2种方式 , 结果色谱图中峰数强度相近。
超声提取操作简便 , 故选取超声提取方式。选择甲
13
第 3期 阎　红 , 等:云南地不容指纹图谱和主要成分定量分析方法研究 　
醇 、 60%甲醇为提取溶剂 , 超声 40m in, 色谱图以甲
醇提取所得峰数目较多 、 峰强度较大 , 故选择甲醇
作为提取溶剂。以甲醇为提取溶剂 , 分别超声提取
20, 40, 60m in, 结果 60m in时间点提取效果与
40m in基本相同 , 故选择提取时间为 40m in。
[参考文献 ]
[ 1] 陈嬿 , 方圣鼎 , 梁栋 , 等. 云南地不容生物碱的研究
[ J]. 植物学报 , 1989, 31 (4):296.
[ 2] 马云淑 , 王方材. 云南地不容有效成分的分离与鉴定
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生出版社 , 2002. 314.
(编辑:岳胜难 )
Stud ies on F ingerprint and Quantitative AnalysisM ethod ofM ain
Componets ofS tephania yunnanensis
YAN Hong, MA Yun-shu, CHENG X in, ZHANG X iao-le i
(Pharm acy Facu lty of TCM , Yunnan C ollege o f TCM , Kunm ing Yunnan 650200, China)
ABSTRACT:Ob jec tive:To study the quantitative me thod of S inoacutine, C reban ine, Roemerine,
S tephanine and the HPLC fingerprints fo r eva luating the quality of Chinese he rb S tephania yunnanensis. Methods:
The experimental conditions of the HPLC method we re as fo llow s-A gilen t Zorbax C18 (4.6mm ×250mm , 5μm).
Themob ile phase w asmethano l-water-triethy lam ine system w ith gradient e lu tion. The f low ra te w as 1.0m l m in- 1
w ith DAD de tected a t 282nm. The column tepe ratu re w as m aintained a t 30℃. Resu lts: In the finge rprin ts, 12
common peaks in S tephania yunnanensis were confirmed from 10d ifferen t samp les. The RSD of the re lative reten-
tion time we re less than 1.90%. The sim ilarities of 10 different samples exceeded 0.9. The con tents of S inoacu-
tine, C rebanine, Roeme rine and Stephan ine in S tephan ia yunnanensis we re 1.68 ～ 0.48%, 1.50 ～ 0.76%,
0.93 ～ 0.50% and 0.01 ～ 0.29%. C onclusion:Theme thod w ithHPLC fingerprint and quantitativemeasuremen t
ofm ain componen ts can be used scientifica lly and effective ly to eva luate the quality of S tephania yunnanensis and
its preparation.
KEYWORDS:S tephan ia yunnanensis;Fingerprint;Quan tita tive Ana ly sis;HPLC
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指导了后世临床实践 。咳嗽虽是临床一症状 , 但
引起咳嗽的原因很多 , 文中论述了脏腑之疾可致
咳 , 提出了 “五脏六腑皆令人咳 ” 的至理名言 ,
从而对咳证作了辨证分型。五脏咳是五脏有疾又
生咳嗽 , 治五脏为主;六腑咳是久咳不愈 , 兼见
其它病证 , 以治咳为主。在脏腑咳的论述中 , 既
可体会到咳证类型的鉴别诊断 , 又让我们明确
“标本缓急 ” 在临证中的指导意义。我们常说 , 主
证是辨析病机的主要依据 , 笔者试从脏腑咳的主
证兼证有别 , 病机先后不同入手 , 欲阐明 《内经》
本来含意 。
(编辑:李　平 )
N ew Probe Into “Ne iJ ing K elun”
XU Zhi-m ing
(Yunnan Co llege of TCM , Kunm ing Yunnan　650200, China)
ABSTRACT:Among many medical literatures of TCM , “N eiJ ing Kelun” is though t of as one of the
best by many medical researches. A cording to some lea rne rs o fTCM , the cough from five zang organs indicates the
pre lim inary stage o f the disease;while cough from six fu o rgansmeans the d isease has transferred from the zang or-
agns to the fu o rgans, Because o f various op in ions about the d isease, the au tho rw ants to express his ow n ideas in
a different w ay.
KEYWORDS:Ne lJing;Kelun
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2007年　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　云南中医学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 30卷