全 文 ：文章编号:1673-5021(2008)03-0074-04
野火球 RAPD反应体系优化研究初报
安晓珂1 , 2 ,赵来喜1 , ＊ ,郭树春3 ,李继平1 , 2
(1.中国农业科学院草原研究所 , 内蒙古　呼和浩特　010010;2.中国农业科学院研究生院 , 北京　100081;
3.内蒙古农业大学农学院 , 内蒙古　呼和浩特　010019)
　　摘要:为建立一个稳定的野火球 RAPD反应体系 , 对 RAPD 反应条件中模板 DNA 用量 、Taq DNA 聚合酶用
量 、随机引物浓度 、Mg2+浓度和 dN TP浓度等各项参数进行筛选比较 , 创建其最佳反应体系为:250μl反应体系中 ,
模板 DNA51ng , Taq DNA 聚合酶 0.5U , 引物浓度 0.32μmo l/ L , M g2+浓度 1.2mmo l/ L , dNTP 浓度 0.20mmol/ L ,
10×PCR Buffer 1.0μl , ddH2O19μl。
关键词:野火球;RAPD;条件;优化
中图分类号:S541.2　　　文献标识码:A
　　野火球(Tri f olium lupinaster L.)属豆科三叶
草属 ,原产我国 ,在我国东北 、华北 、西北都有野生
种;朝鲜 、日本 、蒙古 、俄罗斯(西伯利亚 、远东)等
地也有分布。作为一种优良牧草 ,因其抗旱 、抗寒
及对干旱 、寒冷地区的适应性均强于白三叶和红
三叶 ,所以既可以单独驯化利用 ,也可作为白三叶
和红三叶抗旱和抗寒育种的基因源加以利用 。此
外 ,由于花期较长 ,花色鲜艳 ,还可以作为观赏植
物和蜜源植物[ 1] 。国外对野火球的研究很少 ,国
内有对其营养价值[ 2] 及组织培养[ 3 , 4] 等方面的研
究 ,但分子方面的研究目前尚未见报道 。为了更
有效地了解其遗传背景及种质资源的多样性 ,为
合理开发利用提供条件 ,有必要对野火球进行更
深入的研究。
随机扩增多态性 DNA(Random amplified poly-
morphic DNA , RAPD)技术自 1990 年出现以来 ,
由于操作简便 、快速 、省时 、省力 、DNA 用量少 、多
态性检测效率高而受到人们的重视 , 被广泛应用
于遗传多样性的研究 。对三叶草属植物 RAPD的
优化国内已有报道[ 5 , 6] 。但是由于 RAPD重复性
较差 ,需对其反应条件进行优化 ,以确保结果的稳
定性 ,使实验能够顺利进行。本试验利用 RAPD
技术 ,以野火球为材料 ,探讨模板 DNA 用量 、Taq
DNA聚合酶的用量 、随机引物浓度 、Mg 2+浓度和
dNTP 浓度等因子对 RAPD扩增效果的影响 ,以期
初步建立一个稳定的野火球 RAPD反应体系 ,为
野火球遗传多样性的后续研究做准备 。试验完成
于内蒙古农科院生物技术中心 。
1　材料和方法
1.1　供试材料
本试验所用材料为野火球 ,其种子采集于内蒙
古呼伦贝尔市扎兰屯 ,由中国农业科学院草原研究
所资源育种室提供 。
1.2　试验药品及仪器
四种脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq DNA 聚合酶 、
100bp DNA Ladder M arker 、10 碱基的随机引物
(5AATCGGGCTG3)均购自 T aKaRa 公司 。所用
仪器有:DNA 扩增(PCR)仪(Eppendorf , 德国);电
泳系统(Pow er-PAC200 , 美国);电泳槽(BIO-RAD
mini-sub cel l GT , 美国);离心机(Microfuge 18
centrifuge , 美国);紫外分光光度计(DU-640 , 美
国);多通道分子成像系统(Fluor-Max , 美国)。
1.3　DNA提取
野火球发芽 2个月后 ,随机采集健康幼嫩的叶
片 ,利用植物基因组 DNA 提取试剂盒(天为时代)
提取基因组 DNA , 用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳 ,不
降解 、无杂质则用于扩增 ,提取样品保存于-20℃冰
箱中 。
＊通讯作者
收稿日期:2007-11-27;修回日期:2008-02-25
基金项目:国家科技基础条件平台建设项目(2005DKA21007)
作者简介:安晓珂(1982-), 男 , 河北石家庄人 , 在读硕士 , 主
要从事牧草遗传资源研究.
1.4　RAPD反应程序及其优化条件
反应的基本体系为 25μl 反应体系 ,其中包括
2.0μl(34ng/μL)模板 DNA , 0.4μl(5U/μL)T aq
—74—
第 30 卷　第 3 期　　　　　　　　　　中　国　草　地　学　报　　　　　　　　　　2008 年 5 月
　　Vo l.30　No.3　　　　　　　　　　Chinese Journal of G ra ssland 　　　　　　　　　 May　2008　　
DNA 聚 合 酶 , 0.2μl (20μmol/ L)引 物 , 1.0μl
(30mmol/L)Mg2+ , 2.0μl(2.5mmo l/L)dNT P ,
1.0μl 10×PCR Buffe r , 18.4μl ddH 2O 。RAPD 反
应条件优化包括模板 DNA 用量 、Taq DNA 聚合酶
用量 、随机引物浓度 、Mg 2+浓度 、dNTP 浓度等因
子。在其他 4个因子保持不变的条件下 ,按照一定
梯度变化单一因子筛选最优条件组合。各因子的浓
度梯度处理见表 1。PCR 反应程序为 96℃4min ,
36℃50s , 72℃1min45s , 1 个循环;94℃50s , 36℃
50s , 72℃1min45s , 42个循环;94℃50s , 36℃50s ,
72℃2min30s , 1 个循环 , 4℃保存[ 7] 。对扩增产物
上样电泳 ,利用多通道分子成像系统成像 ,观察记录
电泳结果 。
表 1　试验因子处理
Table 1　Each treatment of experimental factors
试验因子
E xperim ental factors
因子处理
Treatments of experimental factors
1 2 3 4 5 6 7
模板 DNA(ng) 17 34 51 68 85 102 119
Taq DNA聚合酶(U/ 25μL) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 -
引物(μm ol/ L) 0.08 0.16 0.24 0.32 0.40 - -
M gCl2(mmol/ L) 0.3 0.6 0.9 1.2 1.8 2.4 3.0
dNTP (mmol/ L) 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
2　结果与分析
2.1　模板 DNA用量
　　从图 1 可以看出 , 7个处理中均有扩增条带出
现 ,即模板 DNA在 17 ～ 119ng 范围内均能扩增出
泳道 1～ 7分别代表模板 DNA 用量 17 、34 、51 、68 、85 、102 、119ng
Lane 1 to 7 are f rom 17 to 119ng tem plate DNA
图 1　不同用量的模板 DNA 扩增结果
Fig.1　Amplifica tion by template DNA
w ith different concentrations
条带 ,但各处理的条带数目有差异 ,处理 4 、5各有一
条 ,其余处理各两条 ,处理 1 、2条带较为模糊。
2.2　Taq DNA聚合酶用量
试验对 Taq DNA聚合酶的浓度设置6个处理 ,其
浓度梯度为0.5～ 3.0U/25μL。由图 2可知 ,在 6个处
理中均有扩增条带产生 ,当 Taq 酶用量为 0.5U时扩增
条带最丰富清晰;用量为 1.0 ～ 3.0U时扩增条带的一
致性较好 ,但条带较为模糊且数目下降。
泳道 1～ 6分别代表 Taq DNA 聚合酶浓度
0.5 、1.0 、1.5 、2.0 、2.5 、3.0U/ 25μL
Lane 1 to 6 are from 0.5 to 3.0U/25μL Taq DNA polymerase
图 2　不同浓度的 Taq DNA聚合酶扩增结果
F ig.2　Am plification by Taq DNA polymera se
with diffe rent concentra tions
2.3　引物浓度
本试验对引物设定了 5 个梯度 ,由图 3可以看
出 ,当引物浓度低于 0.24μmol/L 时没有扩增条带
出现;当引物浓度为 0.32 ～ 0.40μmol/L 时有扩增
条带出现 ,且以浓度为 0.32μmol/L 时扩增条带清
晰且多态性丰富。
泳道 1～ 5分别代表引物浓度 0.08、0.16、0.24、0.32、0.40μmol/ L
Lane 1 to 5 are from 0.08 to 0.40μmol/ L random primer
图 3　不同浓度的引物扩增结果
Fig.3　Amplification by r andom primers with
different concentra tions
—75—
安晓珂　赵来喜　郭树春　李继平　　野火球 RAPD反应体系优化研究初报
2.4　Mg2+浓度
在本试验的 6个处理中 , Mg2+的浓度在 0.9 ～
1.8 mmol/ L 范围内有扩增条带出现 , 浓度为
1.2mmol/L 时扩增条带清晰且多态性较好 ,浓度低
于0.9mmol/ L 或高于1.8mmol/ L 均无扩增条带产
生。因此 Mg2+浓度以 0.9 ～ 1.8mmol/L 为宜。
泳道 1～ 7分别代表 Mg2+浓度
0.3 、0.6 、0.9 、1.2 、1.8 、2.4 、3.0 mmol/ L
Lane 1 to 7 are f rom 0.3 to 3.0 mm ol/ L M g2+
图 4　不同浓度的 Mg 2+扩增结果
Fig.4　Amplification by Mg2+ with different concentrations
2.5　dNTP浓度
由图 5可以看出 ,在 7 个处理中只有 2 个处理
有条带产生 ,说明 dNTP 浓度过低或过高都会影响
RAPD 扩增 , dN TP 选用的浓度范围为 0.20 ～
0.25mmo l/L 较为适宜。
泳道 1～ 7分别代表 dN TP 浓度
0.05 、0.10 、0.15 、0.20 、0.25 、0.30 、0.35mmol/ L
Lane 1 to 7 are f rom 0.05 to 0.35mmol/ L dNTP
图 5　不同浓度的 dNTP扩增结果
Fig.5　Amplification by dNTP with different concentrations
3　讨论
3.1　模板 DNA浓度对扩增结果的影响
模板 DNA 是指待研究或分离的基因组 DNA ,
为 RA PD反应所必需。模板 DNA的浓度会对结果
产生直接的影响 ,DNA 浓度不同 ,其扩增产物的丰
度亦不同 。DNA浓度太低时 ,目的序列与引物结合
效率低 ,扩增产物不稳定或者不会出现扩增产物;
DNA 含量过高时 ,又有可能导致错误配对[ 8] 。本试
验的结果表明 ,模板 DNA 在 17 ～ 119ng 的范围内
都会有扩增产物出现。本试验最终采用的模板用量
为 51ng 。
3.2　Taq DNA聚合酶和Mg2+对扩增结果的影响
Taq酶催化反应 ,促进产物的合成 。Taq DNA
聚合酶在 PCR中的用量受到反应体积 、酶的活性 、
酶的耐热性等因素的制约[ 9] 。当其用量少时 DNA
反应不够完全 ,扩增强度较弱 ,产物含量低;用量过
多时又会引起非特异性扩增。所有的热稳定 DNA
聚合酶都要求游离的二价阳离子 ,常用的是 Mg2+。
Mg
2+是 Taq酶的激活剂 ,由于 dN TP 和寡聚核苷
酸都能结合 Mg2+ ,因而反应体系中阳离子的浓度
必需超过 dN TP 和引物来源的磷酸盐基团的摩尔
浓度[ 9] ,但 Mg2+浓度对 RAPD 反应的特异性和扩
增的效率都有影响 ,其含量过低时 ,产物含量下降 ,
浓度过高时又会影响酶的活性。因此 , Taq DNA 聚
合酶用量以 0.5U 效果较好 , 相应的 Mg2+浓度为
1.2mmol/L 时效果最佳 。
3.3　引物浓度对扩增结果的影响
DNA 聚合酶在合成一条新的 DNA 链时都不
能从头合成 , 必需有一段引物 。引物是与目的
DNA3′端和 5′端特异性结合的寡聚核苷酸片段 ,模
板相同时引物浓度不同 ,扩增效果也会有差异。引
物浓度低时与模板结合的几率低 ,结合的位点少 ,从
而影响扩增;引物浓度过高时会增加碱基错配的几
率 ,产生非特异性条带 。本试验最终确定的引物用
量为 0.32μmol/L。
3.4　dNTP对扩增结果的影响
dN TP 包含四种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷
酸 ,提供反应必需的 PO 4 3-。在 PCR 热循环过程
中 ,每种 dNTP 的终浓度为 20 ～ 200μmol/ L 时产物
量高 ,特异性 、忠实性较好[ 8] ,浓度过低会影响扩增
的强度 ,浓度过高会对扩增有抑制作用[ 9 , 10] 。在本
试验中 , dN TP 的浓度以 0.20mmol/L 最为清晰 。
4　结论
综上所述 ,野火球 RAPD扩增反应的最佳反应
体系是在 25μl 反应体系中 , 模板 DNA51ng , T aq
—76—
中国草地学报　2008年　第 30 卷　第 3 期
DNA 聚合酶 0.5U ,引物浓度 0.32μmol/L ,Mg2+浓
度 1.2mmol/L , dNT P 浓度 0.20mmo l/L , 10 ×
PCR Buffer1.0μl , ddH2O19μl。该体系可作为野火
球 RAPD反应的参考体系 。
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Mongol ia Agricultural Universi ty , Hohhot 010019 , China)
Abstract:The gradient tests on the concentration of template DNA , Taq DNA po lymerase , random prim-
ers , Mg2+ , and dN TPs we re conducted to set up a stable react ion sy stem of RAPD fo r Tri folium lup inas-
ter L.An optim ized RADP sy stem w as set up:the to tal volume w as 25μl , including 51ng template DNA ,
0.5U Taq DNA po lymerase , 0.32μmol/L random prime rs , 1.2mmol/L M g2+ , 0.20mmol/L dNTPs ,
1.0μl 10×PCR Buf fer , 19μl ddH 2O.
Key words:Tri f ol ium lupinaster L.;RA PD;Condition;Optimizat ion
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安晓珂　赵来喜　郭树春　李继平　　野火球 RAPD反应体系优化研究初报