全 文 ：江苏农业学报(Jiangsu J． of Agr． Sci．) ，2013，29(4) :842 ～ 850
h ttp:/ /w ww． jsn y x b ． c o m
李 慧，丛 郁，常有宏，等． 豆梨磷转运蛋白质基因(PcPht1)的克隆、表达及启动子分析［J］． 江苏农业学报，2013，29(4) :
842-850．
doi:10． 3969 / j． issn． 1000-4440． 2013． 04． 027
豆梨磷转运蛋白质基因(PcPht1)的克隆、表达及启动
子分析
李 慧1，2， 丛 郁3， 常有宏1，2， 蔺 经1， 盛宝龙1
(1．江苏省农业科学院园艺研究所，江苏 南京 210014;2．国家农业科技华东(江苏)创新中心———高效园艺作物遗传改良实
验室，江苏 南京 210014;3．中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室，江苏 南京 210008)
收稿日期:2013-01-24
基金项目:国家自然科学基金项目(31101529) ;江苏省农业科技自
主创新基金项目［CX(12)5033］
作者简介:李 慧(1979-) ，女，广西贵港人，博士，副研究员，主要从
事果树分子生物学研究。(E-mail)lihui7904@ 163． com
通讯作者:常有宏，(E-mail)cyh@ jaas． ac． cn
摘要: 为明确梨砧木豆梨(Pyrus calleryana Dcne．)磷转运蛋白质基因的序列特点和表达模式，采用同源克
隆、RACE 技术和染色体步移法克隆获得 1 个 Pht 基因 PcPht1 的 cDNA、DNA 及启动子序列，并利用 RT-PCR 检测
在不同供磷水平下该基因在豆梨幼苗中的表达情况。结果表明 PcPht1 cDNA 序列编码区长 1 617 bp，编码 1 个由
538 个氨基酸组成的蛋白质，其相对分子质量为 5． 908×104。该基因编码区 DNA 序列没有内含子，其启动子除了
具有 TATA /CAAT-box外还包含防御与胁迫响应元件、光响应元件和茉莉酸甲酯响应顺式作用元件。PcPht1 所编
码蛋白质由 12 个疏水的跨膜区域组成，包括 H2PO4
－ /nH+共运体、糖转运体和 MFS通用底物转运体 3 个 Pht1 蛋白
质特征结构域。PcPht1 与大豆 GmPht1;7 和橡胶 HbPht1 间有较高的一致性(分别为 88． 0%和 87． 0%) ;与拟南芥
Pht1 蛋白质家族处于系统进化树的同一分支，并与 AtPht1;4 和 AtPht1;7 的亲缘关系最近。正常供磷条件下，
PcPht1 基因主要在根中表达，低磷时该基因的表达上调，提高供磷浓度其表达受到抑制，说明 PcPht1 的表达受环
境磷浓度调控。
关键词: 豆梨;磷转运蛋白质基因;分离;启动子;表达
中图分类号: S661． 2 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440(2013)04-0842-09
Cloning，expression and promoter analysis of a phosphate transporter
protein gene PcPht1 from Pyrus calleryana Dcne．
LI Hui1，2， CONG Yu3， CHANG You-hong1，2， LIN Jing1， SHENG Bao-long1
(1． Institute of Horticulture，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China;2． Efficient Horticulture Crop Genetic Improvement Labo-
ratory，National Agricultural Science and Technology Jiangsu Innovative Center，Nanjing 210014，China;3． State Key Laboratory of Soil and Sustainable
Agriculture，Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210008，China)
Abstract: This experiment was conducted to investigate the sequence characteristics and expression pattern of phos-
phate transporter protein (Pht)gene in bean pear (Pyrus calleryana Dcne．)． The cDNA，DNA and promoter sequences of
a PcPht1 gene were isolated from bean pear using homologous cloning，rapid amplification of cDNA ends (RACE)and ge-
nome walking method． At the same time，its expression in bean pear seedlings at different phosphate levels was analyzed by
semi-quantitative reverse transcription polymerase chain
reaction． PcPht1 cDNA coding region length is 1 617 bp，
which contains an open reading frame encoding a 5． 908×
104 protein consisting of 538 amino acids． Its DNA se-
quence has no intron． In addition to the TATA /CAAT-
box，its promoter contains some specific regulatory ele-
ments such as cis-acting element involved in defense and
248
stress responsiveness，light responsive element and cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness．
Twelve hydrophobic transmembrane regions constitute PcPht1 protein which has three feature domains，H2PO4
－ /nH+ trans-
porter，sugar transporter and the major facilitator superfamily (MFS)general substrate transporter． PcPht1 shared high
similarities (88． 0% and 87． 0%)with Glycine max GmPht1;7 and Hevea brasiliensis HbPht1，respectively． PcPht1 and
Arabidopsis Pht1 proteins belong to the same branch in Pht phylogenetic tree． PcPht1 has the closest relationship with At-
Pht1;4 and AtPht1;7． Semi-quantitative RT-PCR results revealed that PcPht1 gene was expressed mainly in root under
normal inorganic phosphate (Pi)conditions． Its expression was increased at low Pi levels，and was inhibited at high Pi lev-
el，suggesting PcPht1 expression was regulated by environmental phosphorus concentration．
Key words: Pyrus calleryana Dcne．;phosphate transport protein gene;isolation;expression;promoter
磷是植物生命过程中的重要营养元素，构成植
物细胞干重的 5%，它作为能量转移的物质，在活化
体内蛋白质，调控植物体的整个代谢过程，协调生长
和抗逆等方面发挥重要作用［1-3］。植物主要以无机
磷(Pi)形式吸收土壤中的磷，而土壤对磷的强烈吸
附使土壤溶液中植物可吸收的可溶性无机磷含量非
常低，通常小于 10 μmol /L［4］。因此，植物能否高效
吸收磷对植物生长有着至关重要的影响。植物对磷
的吸收是一个逆浓度的主动运输过程，主要依靠根
系细胞膜上的磷转运蛋白质家族来完成［5］，细胞膜
上磷转运蛋白质的数量和其对磷酸根(H2PO4
－)离
子的亲和性决定植物磷吸收效率。植物磷转运蛋白
质分为 Pht1、Pht2、Pht3、Pho1 和 Pho2 5 大家族，其
中 Pht1 基因家族属于 H2PO4
－ / nH+共运体，为高亲
和性的磷转运蛋白质，位于根系细胞膜上，通过利用
质膜上的氢离子浓度梯度来驱动植物对土壤溶液中
可溶性磷的吸收［6-8］。
梨树生产普遍采取砧木嫁接优良品种的方式，
而树体生长发育所需的磷主要从根系中吸收，因此，
研究砧木吸收土壤磷营养的分子机制，挖掘控制该
过程的功能基因，有着重要的实践意义。前人研究
结果表明，Pht1;1 基因的缺失极显著地削弱了植株
吸收磷酸盐的能力［6］，超表达 Pht1 基因家族成员可
以显著提高受体植物对无机磷的吸收能力［9-10］。鉴
于 Pht1 基因家族在植物磷吸收过程的重要作用，研
究梨砧木 Pht1 基因序列特点和表达调控方式有助
于通过生物技术手段来提高梨树的磷吸收效率，但
目前在蔷薇科植物中未见该类基因的相关报道，因
此，本研究以梨砧木豆梨为研究对象，开展 Pht1 基
因分离及表达方面的研究。根据植物 Pht1 基因的
保守性氨基酸序列设计简并引物，利用同源克隆、
RACE 技术和染色体步移法克隆 Pht1 基因 cDNA、
DNA及启动子序列，并研究不同供磷条件下该基因
的表达情况，为有针对性地解析其在豆梨磷吸收过
程中所起的生理功能提供理论依据。
1 材料和方法
1． 1 供试材料
2009 年 11 月于江苏省农业科学院砂梨种质资
源圃收集豆梨成熟种子，湿砂拌种贮藏在海尔冷藏
柜(4 ℃)中进行层积处理。2010 年 3 月将种子取
出，播种于光照培养箱盆钵内(以石英砂为基质) ，
培养温度(25±0. 5)℃，光照周期 14 h /10 h(光照 /
黑暗) ，光照度 3 000 lx。生长期间常规管理，并用
Hoagland完全营养液(H2PO4
－浓度为 1 mmol /L)浇
灌，待幼苗长至 4 片真叶时，选择长势一致的植株于
去离子水中饥饿 24 h 后，分别置于 H2PO4
－浓度为
0. 1 mmol /L、1. 0 mmol /L、10. 0 mmol /L 的 Hoag-
land营养液中处理 24 h，收获不同处理的豆梨叶片
与根，保存于－70 ℃冰箱待用。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 PcPht1 基因全长的克隆
1． 2． 1． 1 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成 取
0. 1 mmol /L H2PO4
－处理 24 h 的豆梨根，用 RNA-
plant plus 植物总 RNA 提取试剂(TIANGEN 公司产
品)提取总 RNA，经 DNase I (无 RNA 酶，TIANGEN
公司产品)消化后取 2 μg 总 RNA 用于 cDNA 第一
链的合成(TIANScript cDNA 第一链合成试剂盒，
TIANGEN公司产品) ，用 RNase A(无 DNA 酶和蛋
白酶，GenStar公司产品)消化 cDNA产物。
1． 2． 1． 2 豆梨 PcPht1 基因核心片段的扩增 根据
GenBank核酸数据库中不同植物 Pht1 基因保守氨
基酸序列 VLNALDV 和 AEIFPAR，设计简并引物
PcPht1-S1 (5-GTGCTNAATGCACTNGATGT-3)和
PcPht1-F1 (5-CCTDGCHGGGAAAATCTCNGC-3) ，
以 0． 1 mmol /L H2PO4
－处理 24 h的豆梨根 cDNA 为
348李 慧等:豆梨磷转运蛋白质基因(PcPht1)的克隆、表达及启动子分析
模板，用 Taq Plus DNA Polymerase(TIANGEN 公司
产品)扩增豆梨 PcPht1 基因核心片段。反应参数:
94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30
个循环;72 ℃ 10 min。
1． 2． 1． 3 3端和 5端序列的获得 采用 Invitrogen
公司 3 /5RACE System(Ver． 2． 0)试剂盒克隆基因
的末端序列，根据获得的基因核心片段设计 3 /5
基因特异引物。用两条正向嵌套引物 PcPht1-3-1
(5-TTGAAGCAGAGCCGCAGAAG-3)和 PcPht1-3-2
(5-TGGACTCACAAGGACAACCG-3) ，分别与通用
引物 3 AUAP(5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3)
进行巢式 PCR扩增。第 1 轮 PCR产物稀释 10 倍作
为模板进行第 2 轮巢式扩增。5端反转录特异引物
为 PcPht1-5-1 (5-CCAAGCAAGTGAAGTCCATG-
3) ，扩增特异引物为 PcPht1-5-2 (5-TCTGCG-
GCTCTGCTTCAATT-3)和 PcPht1-5-3 (5-AAGA-
CAGCGGCAATGAAAGC-3) ，分别与通用引物 5
AAP (5-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGI-
IGGGIIG-3)和 5 AUAP (5-GGCCACGCGTCGAC-
TAGTAC-3)进行巢式 PCR扩增。
1． 2． 1． 4 PcPht1 基因 cDNA序列的获得 比对、拼
接豆梨 PcPht1 基因核心片段、3末端和 5末端 3 个
序列片段，获得豆梨 PcPht1 基因的全长 cDNA 序列
信息，并设计编码区引物 PcPht1-ORF-S1(3-ATG-
GCTAGAGAGCAATTACAGG-5)和 PcPht1-ORF-F1
(3-CTACACAACTGGAACTGTCCTG-5) ，用高保真
耐热 DNA 聚合酶(Pfu DNA Polymerase，TIANGEN
公司产品)进行扩增。反应参数:94 ℃ 5 min;94 ℃
1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，30 个循环;72 ℃ 10
min。
1． 2． 1． 5 PcPht1 基因 DNA序列及启动子扩增 豆
梨总 DNA 提取采用 CTAB 法，采用编码区引物
PcPht1-ORF-S1 和 PcPht1-ORF-F1 扩增 DNA 序列，
反应参数同方法 1． 2． 1． 4。根据扩增出目的基因的
DNA序列设计扩增启动子的特异引物 SP1(5-
CAAAGACAGCGGCAATGAAAGCG-3)、 SP2 (5-
TCACCGCCAATACCAAACCCTAG-3)和 SP3 (5-
TCACCAAGCCAGCCAAAGAAGAG-3) ，按 照 Ge-
nome Walker Kit(TaKaRa 公司产品)原理和方法进
行染色体步移。
1． 2． 1． 6 目的片段的回收和克隆 扩增所得各轮
PCR特异产物按照琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIAN-
GEN公司产品)的使用说明进行回收后，与 pGM-T
克隆载体(TIANGEN公司产品)连接，转化 DH5α感
受态细胞(TIANGEN 公司产品) ，并进行蓝白斑筛
选，挑取白斑接种于 3 ml SOC(含 100 μg /L氨苄青
霉素)液体培养基中，37 ℃ 200 r /min 振荡培养过
夜。取 1 μl菌液用 pGM-T重组菌落 PCR鉴定试剂
盒(TIANGEN 公司产品)进行 PCR 扩增鉴定，琼脂
糖凝胶电泳检测插入片段的大小。序列测定由上海
美吉生物医药科技有限公司完成。
1． 2． 2 PcPht1 基因序列分析 PcPht1 基因核苷酸
翻译采用 BioXM 软件，并使用 ProtParam tool(ht-
tp:/ /www． expasy． ch / tools /protparam． html)分析氨
基酸基本成分。蛋白质跨膜区和亚细胞定位预测分
别通过 TMpred (http:/ /www． ch． embnet． org / soft-
ware /TMPRED_form． html)和 PSORT(http:/ /psort．
ims． u-tokyo． ac． jp / form． html)完成。在 InterPro(ht-
tp:/ /www． ebi． ac． uk / InterProScan)上分析结构域。
PcPht1 基因氨基酸序列比对和系统进化树构建采
用 DNAMAN软件完成，所用 Pht 蛋白质序列来自
http:∥www． ncbi． nlm． nih． gov 和 http:/ /www． arabi-
dopsis． org。利用生物学数据库 PlantCARE(http:/ /
bioinformatics． psb． ugent． be /webtools /plantcare /ht-
ml /)进行启动子元件的预测分析。
1． 2． 3 PcPht1 基因表达研究 经 DNase I(无 RNA
酶，TIANGEN公司产品)消化后，取各处理样品的 2
g总 RNA 逆转录成 cDNA 第一链(TIANScript cD-
NA第一链合成试剂盒，TIANGEN 公司产品) ，用
RNase A(无 DNA酶和蛋白酶，GenStar公司产品)消
化 cDNA 产物。通过 PcPht1 基因的特异性引物
PcPht1-BD-S1(5-TTGAAGCAGAGCCGCAGAAG-3)
和 PcPht1-BD-F1(5-AGAAGTTGACCACACCCAGC-
3) ，用 2×HotMaster PCR MasterMix (TIANGEN公司
产品)进行半定量 RT-PCR。反应参数:94 ℃ 5 min;
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，28 个循环;72 ℃
10 min。选用豆梨肌动蛋白质 Actin 基因为内参
照［11］，在相同的条件下进行扩增，比较研究不同供
磷条件下 PcPht1 基因的表达情况。
2 结果与分析
2． 1 PcPht1 基因克隆
以 0． 1 mmol /L H2PO4
－ 处理 24 h 的豆梨
根 cDNA 为模板，用 PcPht1-S1 和 PcPht1-F1 为引
448 江 苏 农 业 学 报 2013 年 第 29 卷 第 4 期
物，进行豆梨 Pht1 基因核心片段的 PCR 扩增，获得
与预期片段(1 275 bp)大小一致的条带(图 1) ;以
引物 PcPht1-3-1 和 PcPht1-3-2 分别与通用引物 3
AUAP 结合，对核心片段的 3末端进行巢式 PCR扩
增，得到 1 条 676 bp的片段(图 1) ;以引物 PcPht1-
5-2 和 PcPht1-5-3 分别与通用引物 5 AAP 和 5
AUAP 结合，对核心片段的 5末端进行巢式 PCR 扩
增，得到 1 条 518 bp的片段(图 1)。这 3 个片段依
次有一段重叠区域，证明它们为同一基因的不同位
置片段。用 DNAMAN 软件比对、拼接核心片段、3
末端和 5末端片段，获得 cDNA全长序列信息，并设
计编码区引物 PcPht1-ORF-S1 和 PcPht1-ORF-F1，
进行 RT-PCR扩增，获得 1 条 1 617 bp条带(图 1) ，
测序结果与拼接序列预测的编码区完全一致，将其
命名为 PcPht1 基因。
利用引物 PcPht1-ORF-S1 和 PcPht1-ORF-F1 对
豆梨基因组 DNA进行扩增，获得 1 条 1 617 bp条带
(图 1) ，测序结果与 cDNA 编码区序列完全一致。
利用 PcPht1 基因组 DNA 序列设计的特异引物
SP1、SP2 和 SP3 进行染色体步移，经过 3 轮巢式
PCR，获得 1 条 1 547 bp条带(图 1) ，测序后发现该
序列与 PcPht1 基因组 DNA 序列有一段重叠区域，
确认所得到的片段为 PcPht1 基因的上游启动子序
列。
A:PcPht1 核心片段;B:3RACE扩增产物;C:5RACE扩增产物;D:PcPht1 编码区 cDNA扩增产物;E:PcPht1 编码区 DNA 扩增产物;F:
PcPht1 启动子扩增产物;M1:DL2000TM DNA marker;M2:250 bp DNA ladder marker。
图 1 豆梨 PcPht1 基因的 PCR扩增结果
Fig． 1 The PCR amplification results of PcPht1 gene of Pyrus calleryana Dcne．
2． 2 PcPht1 基因序列特点
PcPht1 基因 cDNA 序列全长 1 865 bp，其中
编码区 1 617 bp，编码 1 个含有 538 个氨基酸残
基的蛋白质(图 2) ，预测的等电点(pI)为 8. 08，
估计的相对分子质量为 5 ． 908 × 104，分子式
为 C2732H4159N679O733S26。PcPht1 基因编码区 DNA
序列与 cDNA序列完全一致，表明 PcPht1 基因无内
含子，符合植物 Pht1 基因家族特点。
利用 TMpred软件对 PcPht1 进行蛋白质跨膜区
分析，发现 PcPht1 由 12 个疏水的跨膜区域(TM)组
成，符合磷转运蛋白质的基本特征［12］，每个跨膜结
构域由 17 ～ 25 个氨基酸残基组成螺旋，二级结构为
“6-环-6”结构，即包括 6 个 N 端的跨膜区以及 6 个
C端的跨膜区，中部(TM6 和 TM7 之间)由 1 个中央
亲水环(Hydrophilicloop)分隔，并且 PcPht1 蛋白质
的 N端、C端和中间的大环都分布在细胞质中(图
3)。PcPht1 蛋白质包括 H2PO4
－ /nH+共运体、糖转
运体和 MFS 通用底物转运体 3 个结构域。通过在
线软件 PSORT 进行亚细胞定位预测，发现 PcPht1
蛋白质位于细胞质膜上的几率最大。
利用 DNAMAN 软件进行多重比对(Multiple a-
lignment) ，结果表明 PcPht1与大豆 GmPht1;7蛋白质
(FJ797407)和橡胶 HbPht1 蛋白质(HM015901)间有
较高的一致性(分别为 88. 0%和 87. 0%) (图 4)。磷
转运蛋白质 Pht家族系统进化树(图 5)显示，PcPht1
蛋白质与 Pht1 家族位于同一发育分支上，与拟南芥
的 AtPht1;4(NM_129452)、AtPht1;7(NM_115327)亲
缘关系最近，并与番茄 LePT1(AF022873)、马铃薯
StPT1(X98890)的亲缘关系较近。
总的来说，本研究所克隆 PcPht1 基因的氨基酸
序列特征表明了该基因属于植物高亲和性磷转运蛋
白质 Pht1 家族。
548李 慧等:豆梨磷转运蛋白质基因(PcPht1)的克隆、表达及启动子分析
* 代表终止密码子;N-糖基化位点用方框标注;蛋白激酶 C和酪蛋白激酶介导的磷酸化位点分别用下划线和椭圆标注。
图 2 豆梨 PcPht1 基因编码区序列及其编码的氨基酸
Fig． 2 PcPht1 coding region and deduced amino acid sequences of Pyrus calleryana Dcne．
跨膜区模型采用 TOPO2 软件(http:/ /www． sacs． ucsf． edu /TOPO2 /)绘制，数字表示跨膜区编号。
图 3 PcPht1 跨膜区域预测结果
Fig． 3 The predicted result of PcPht1 transmembrane region
648 江 苏 农 业 学 报 2013 年 第 29 卷 第 4 期
2． 3 PcPht1 基因启动子分析
对 PcPht1基因进行染色体步移后获得的 1 547
bp条带(图 1F)包括一段与其基因组 DNA序列重叠
的区域，去除该区域后，获得长度为 1 269 bp 的启动
子序列。启动子的转录起始位点 G位于翻译起始位
点 ATG上游－30 bp处(将转录位点定义为 0)。通过
生物学数据库 PlantCARE(http:/ /bioinformatics． psb．
ugent． be /webtools /plantcare /html /)对得到的启动子
进行预测分析，发现存在大量顺式作用元件。其中启
动子基本作用元件 TATA-box位于转录起始位点上游
－93 bp、－ 143 bp、－ 436 bp 及 － 804 bp 处，增强子
CAAT-box位于转录起始位点上游－119 bp、－340 bp、
－364 bp及－482 bp处。在该启动子还存在着防御与
胁迫响应元件(TC-rich repeats，－69 bp 和－127 bp)、
光反应元件(Box I，－360 bp)、热胁迫响应元件(HSE，
－565 bp)和茉莉酸甲酯响应顺式作用元件(TGACG-
motif，－516 bp) (图 6)。
GmPht1;7:大豆(FJ797407)。HbPht1:橡胶(HM015901)。LePT1:
番茄(AF022873)。LePT2:番茄(AF022874)。PcPht1:豆梨(本研
究获得)。PhPht1;1:矮牵牛(EF564180)。PtrPht1;7:杨树(XM_
002306809)。StPT1:马铃薯(X98890)。StPT2:马铃薯(X98891)。
图 4 PcPht1推测的氨基酸与其他植物 Pht1蛋白质同源性分析
Fig． 4 Homology analysis of PcPht1 deduced amino acid se-
quence and several Pht1 proteins from other plants
AtPht1;1:拟南芥(NM_123701)。AtPht1;2:拟南芥(NM_123703)。AtPht1;3:拟南芥(NM_123702)。AtPht1;4:拟南芥(NM_129452)。At-
Pht1;5:拟南芥(NM_128843)。AtPht1;6:拟南芥(NM_123700)。AtPht1;7:拟南芥(NM_115327)。AtPht1;8:拟南芥(DQ446267)。AtPht1;
9:拟南芥(NM_106293)。AtPht2;1:拟南芥(NM_113565)。AtPht3;1:拟南芥(NM_121407)。AtPht3;2:拟南芥(NM_114744)。AtPht3;3:拟
南芥(AK227300)。AtPht4;1:拟南芥(NM_128519)。AtPht4;2:拟南芥(NM_129362)。AtPht4;3:拟南芥(NM_001035747)。AtPht4;4:拟南
芥(NM_116261)。AtPht4;5:拟南芥(NM_122045)。AtPht4;6:拟南芥(NM_123804)。LePT1:番茄(AF022873)。LePT2:番茄(AF022874)。
PcPht1:豆梨(本研究获得)。StPT1:马铃薯(X98890)。StPT2:马铃薯(X98891)。
图 5 Pht蛋白质家族系统进化树
Fig． 5 Phylogenetic tree of Pht protein family
748李 慧等:豆梨磷转运蛋白质基因(PcPht1)的克隆、表达及启动子分析
TATA-box:启动子基本作用元件;CAAT-box:增强子;TC-rich repeats:防御与胁迫响应元件;BoxⅠ:光反应元件;HSE:热胁迫响应元件;
TGACG-motif:茉莉酸甲酯响应顺式作用元件。
图 6 豆梨 PcPht1 基因启动子序列分析
Fig． 6 Sequence analysis of PcPht1 gene promoter of Pyrus calleryana Dcne．
2． 4 PcPht1 的表达模式
为了研究 PcPht1在不同供磷条件下的表达情况，
以不同浓度 H2PO4
－处理 24 h 的豆梨叶片和根 cDNA
为模板，进行半定量 RT-PCR扩增。结果表明，正常供
磷(H2PO4
－ 1. 0 mmol /L)条件下，PcPht1 在叶片和根
中均有表达，根中表达量高于叶片，叶片中仅能检测到
微弱的表达信号;低磷(H2PO4
－ 0. 1 mmol /L)能够强烈
诱导 PcPht1在根中的表达，增加 PcPht1在叶片中的表
达，并且根中表达量远大于叶片;提高供磷浓度
(H2PO4
－ 10. 0 mmol /L)，直接导致 PcPht1在根中的表
达受抑制，在叶片中无表达(图 7)。
3 讨 论
磷是植物生长所需的重要矿质元素，磷缺乏会
1:0． 1 mmol /L H2PO4
－;2:1． 0 mmol /L H2PO4
－;3:10． 0
mmol /L H2PO4
－。
图 7 不同供磷条件下豆梨 PcPht1 基因的表达分析
Fig． 7 Expression of PcPht1 gene in Pyrus calleryana Dcne． un-
der different inorganic phosphate concentrations
对细胞代谢产生较大的影响［9］。在缺磷条件下，植
物主要通过以 Pht1 家族为代表的高亲和性磷转运
系统吸收土壤中的有效磷［13-14］。该家族的大部分
848 江 苏 农 业 学 报 2013 年 第 29 卷 第 4 期
成员在序列结构上都有着高度保守性，它们具有固
定的磷酸化及糖基化位点来进行转录后的加工修
饰，以此调节蛋白质相互作用，从而执行吸收和转运
磷的功能。本研究克隆的豆梨 PcPht1 基因 cDNA
序列所编码的氨基酸序列与大豆和橡胶等高亲和性
Pht1 磷转运蛋白质有着较高的一致性，并且 PcPht1
具备 Pht1 家族成员的主要特征:位于细胞质膜上，
编码蛋白质大小相似(相对分子质量约为 5． 8×
104) ，含 520 ～ 550 个氨基酸残基，由 12 个亲脂的
跨膜域(TM)组成，被一个亲水性的大环(TM6 和
TM7 之间)分成 2 组;在氨基酸序列中存在 N-连接
的保守糖基化位点，蛋白激酶 C 和酪蛋白激酶介导
的磷酸化位点［10，12，15-18］。综合上述特点，可以初步
确定 PcPht1 为豆梨的高亲和性磷转运蛋白质基因。
现有的研究发现 Pht1 主要在植物根部表达，如
拟南芥 Pht1 家族中有 8 个基因在根部表达［19-20］，而
水稻的 13 个 Pht1 家族成员中有 10 个在根部表
达［21］。正常供磷(H2PO4
－ 1 mmol /L)条件下，豆梨
PcPht1 在根部和叶片均有表达，而根中的表达丰度
显著高于叶，叶片中仅能检测到该基因的微弱表达
信号，表明该基因与其他植物 Pht1 家族大多数成员
相似，其表达主要集中在根部。
Pht1 家族磷转运蛋白质基因的调控主要在转
录水平上进行，大部分高亲和性磷转运 Pht1 基因受
低磷诱导表达［22-24］。豆梨 PcPht1 基因在低磷
(H2PO4
－ 0. 1 mmol /L)条件下，叶片和根中的表达
量均显著上调，在高磷(H2PO4
－ 10 mmol /L)条件下
显著下调，即本研究所克隆获得的 PcPht1 基因具备
Pht1 家族基因表达特点。Pht蛋白质家族系统进化
树分析结果表明，PcPht1 与拟南芥 Pht1 家族中 At-
Pht1;4 和 AtPht1;7 的遗传距离最近，与马铃薯和番
茄高亲和性磷转运蛋白质 Pht1 家族的 4 个成员
StPT1、StPT2、LePT1 和 LePT2 也属于同一进化分
支。Misson等［25］研究了拟南芥 AtPht1;4 基因缺失
体，发现 AtPht1;4 基因的缺失极显著地降低了植株
在低磷介质中对磷的吸收，但并不影响高磷供应条
件下磷的利用，这表明低磷条件可以诱导 AtPht1;4
基因的大量表达。与 AtPht1;4 基因类似的是，在缺
磷的环境中 StPT2 基因和 LePT2 基因的表达也主要
限于植株的根部［22，26-28］，这与 PcPht1 基因的表达特
点很相似。而 StPT1 基因和 LePT1 基因在缺磷或不
缺磷的根部和地上部均大量表达［22，26-28］，这与
PcPht1 基因的表达模式有所区别，推测 StPT1、
LePT1 与 PcPht1 的功能有所差异。
参考文献:
［1］ BUCHER M． Functional biology of plant phosphate uptake at root
and mycorrhiza interfaces［J］． New Phytologist，2007，173(1) :
11-26．
［2］ 王敬丽，杨美燕，杨秀珍，等．磷营养对独本菊生长及开花的影
响［J］．江苏农业科学，2012，40(9) :156-159．
［3］ 牛慧样，吴沿友，朱咏莉，等．磷胁迫下根系分泌物中苹果酸含
量测定及特征分析［J］． 江苏农业科学，2012，40(10) :286-
288．
［4］ RAGHOTHAMA K G，KARTHIKEYAN A S． Phosphate acquisi-
tion［J］． Plant and Soil，2005，274(1-2) :37-49．
［5］ LIU J Y，VERSAW W K，PUMPLIN N，et al． Closely related
members of the Medicago truncatula PHT1 phosphate transporter
gene family encode phosphate transporters with distinct biochemical
activities［J］． Journal of Biological Chemistry，2008，283(36) :
24673-24681．
［6］ CATARECHA P，SEGURA M D，FRANCO-ZORRILLA J M，et
al． A mutant of the Arabidopsis phosphate transporter PHT1;1 dis-
plays enhanced arsenic accumulation［J］． Plant Cell，2007，19
(3) :1123-1133．
［7］ MIAO J，SUN J H，LIU D，et al． Characterization of the promoter
of phosphate transporter TaPHT1． 2 differentially expressed in
wheat varieties［J］． Journal of Genetics and Genomics，2009，36
(8) :455-466．
［8］ PREUSS C P，HUANG C Y，GILLIHAM M，et al． Channel-like
characteristics of the low-affinity barley phosphate transporter
PHT1;6 when expressed in Xenopus oocytes［J］． Plant Physiology，
2010，152(3) :1431-1441．
［9］ SHIN H，SHIN H S，DEWBRE G R，et al． Phosphate transport
in Arabidopsis:Pht1;1 and Pht1;4 play a major role in phosphate
acquisition from both low- and high-phosphate environments［J］．
Plant Journal，2004，39(4) :629-642．
［10］ PARK M R，BAEK S H，DELOSREYES B G，et al． Overexpres-
sion of a high-affinity phosphate transporter gene from tobacco(Nt-
PT1)enhances phosphate uptake and accumulation in transgenic
rice plants［J］． Plant and Soil，2007，292(1-2) :259-269．
［11］ 李 慧，丛 郁，常有宏，等． 豆梨半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因
的克隆及胁迫表达［J］． 西北植物学报，2011，31(5) :861-
867．
［12］ WU Z，ZHAO J，GAO R，et al． Molecular cloning，characteriza-
tion and expression analysis of two members of the Pht1 family of
phosphate transporters in Glycine max［J］． PloS ONE，2011，6
(6) :e19752．
［13］ SCHUNMANN P H D，RICHARDSON A E，VICKERS C E，et
al． Promoter analysis of the barley Pht1;1 phosphate transporter
gene identifies regions controlling root expression and responsive-
948李 慧等:豆梨磷转运蛋白质基因(PcPht1)的克隆、表达及启动子分析
ness to phosphate deprivation［J］． Plant Physiology，2004，136
(4) :4205-4214．
［14］ NAGY R，VASCONCELOS M J，ZHAO S，et al． Differential reg-
ulation of five Pht1 phosphate transporters from maize (Zea mays
L．) ［J］． Plant Biology (Stuttg) ，2006，8(2) :186-197．
［15］ KAI M，TAKAZUMI K，ADACHI H，et al． Cloning and charac-
terization of four phosphate transporter cDNAs in tobacco ［J］．
Plant Science，2002，163(4) :837-846．
［16］ MING F，LU Q，WANG W，et al． Cloning，expression and func-
tion of phosphate transporter encoded gene in Oryza sativa L． ［J］．
Science in China Series C-Life Sciences，2006，49(5) :409-413．
［17］ 汤银辉，何 鹏．巴西橡胶树磷转运蛋白基因的克隆及生物信
息学分析［J］． 热带作物学报，2010，31(5) :758-766．
［18］ 马彩艳，刘冬成，阳文龙，等． 短柄草磷转运蛋白家族基因的克
隆及表达分析［J］． 分子植物育种，2011，9(4) :482-490．
［19］ KARTHIKEYAN A S，VARADARAJAN D K，MUKATIRA U T，
et al． Regulated expression of Arabidopsis phosphate transporters
［J］． Plant Physiology，2002，130(1) :221-233．
［20］ MUDGE S R，RAE A L，DIATLOFF E，et al． Expression analy-
sis suggests novel roles for members of the Pht1 family of phosphate
transporters in Arabidopsis［J］． Plant Journal，2002，31(3) :
341-353．
［21］ PASZKOWSKI U，KROKEN S，ROUX C，et al． Rice phosphate
transporters include an evolutionarily divergent gene specifically
activated in arbuscular mycorrhizal symbiosis［J］． Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America，
2002，99(20) :13324-13329．
［22］ GORDON-WEEKS R，TONG Y P，DAVIES T G E，et al． Re-
stricted spatial expression of a high-affinity phosphate transporter in
potato roots［J］． Journal of Cell Science，2003，116(15) :3135-
3144．
［23］ RAE A L，CYBINSKI D H，JARMEY J M，et al． Characterization
of two phosphate transporters from barley;evidence for diverse
function and kinetic properties among members of the Pht1 family
［J］． Plant Molecular Biology，2003，53(1-2) :27-36．
［24］ 刘芳朋，张立军，谷俊涛，等． 小麦磷转运蛋白基因 TaPT4 的
克隆和表达分析［J］． 河北农业大学学报，2012，35(3) :1-7．
［25］ MISSON J，THIBAUD M C，BECHTOLD N，et al． Transcription-
al regulation and functional properties of Arabidopsis Pht1;4，a
high affinity transporter contributing greatly to phosphate uptake in
phosphate deprived plants［J］． Plant Molecular Biology，2004，
55(5) :727-741．
［26］ LIU C M，MUCHHAL U S，RAGHOTHAMA K G． Cloning and
characterization of high affinity phosphate transporter homologs
from tomato uthappa mukatira［J］． Plant Physiology，1996，111
(2) :436-436．
［27］ ROSEWARNE G M，BARKER S J，SMITH S E，et al． A lycop-
ersicon esculentum phosphate transporter (LePT1) involved in
phosphorus uptake from a vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus
［J］． New Phytologist，1999，144(3) :507-516．
［28］ RAUSCH C，DARAM P，BRUNNER S，et al． A phosphate trans-
porter expressed in arbuscule-containing cells in potato［J］． Na-
ture，2001，414(6862) :462-466．
(责任编辑:张震林)
058 江 苏 农 业 学 报 2013 年 第 29 卷 第 4 期