全 文 ：陈义挺，张长和，陈婷，等．莆田豆梨ＧＰＸ基因克隆与生物信息学分析 ［Ｊ］．福建农业学报，２０１５，３０ （９）：８６８－８７３．
ＣＨＥＮ　Ｙ－Ｔ，ＺＨＡＮＧ　Ｃ－Ｈ，ＣＨＥＮ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＧＰＸ Ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｕｔｉａｎ　Ｐｅａｒ，Ｐｙｒｕｓｃａｌｌｅｒｙａｎａ　Ｄｅｃｎｅ ［Ｊ］．Ｆｕｊｉａｎ
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１５，３０ （９）：８６８－８７３．
莆田豆梨ＧＰＸ基因克隆与生物信息学分析
陈义挺１，张长和２，陈　婷１，陈招弟１
（１．福建省农业科学院果树研究所，福建　福州　３５００１３；２．福建省建宁县农业局，福建　三明　３５４５００）
收稿日期：２０１５－０７－１２初稿；２０１５－０８－１４修改稿
作者简介：陈义挺 （１９７２－），男，副研究员，博士，研究方向：果树分子生物学与遗传资源 （Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｙｉｔｉｎｇ＠１６３．ｃｏｍ）
基金项目：福建省科技计划项目———省属公益类科研院所基本科研专项 （２０１０Ｒ１０１６－３）；福建省财政专项———福建省农业科学院科技
创新团队建设项目 （ＣＸＴＤ２０１１－１９）；福建省财政专项 （２０１１、２０１２年）
摘　要：采用同源克隆ＲＴ－ＰＣＲ结合 ＲＡＣＥ技术，从福建省地方梨种质资源莆田豆梨中克隆出ＧＰＸ 基因的
ｃＤＮＡ全长序列分离克隆并运用生物信息学方法对序列进行分析。克隆得到福建省地方种质资源莆田豆梨ＧＰＸ
基因９３２ｂｐ的ｃＤＮＡ全长序列，分析表明，该序列的５′端和３′端的非编码序列长度分别为２０４ｂｐ和２２１ｂｐ，开
放阅读框为５０７ｂｐ，编码１６８个氨基酸。氨基酸序列与苹果、柑橘、龙眼、荔枝的同源性９０％以上。ＧＰＸ基因
在ＧｅｎＢａｎｋ上登录，登录号为ＪＱ０１１２７８。生物信息学分析表明：ＧＰＸ蛋白的分子量是２０　０８３．０Ｄａ，理论等电
点ｐＩ　５．６１，是不具跨膜结构域的亲水性胞质蛋白，不具有信号肽，细胞主要定位在细胞质上，有１个区域最有
可能形成卷曲螺旋，由２６．５８％的ａ螺旋，１９．２６％的延伸链和５４．１６％的不规则卷曲组成，磷酸化位点有１２个。
此外，还对ＧＰＸ酶分子三维立体结构等进行预测和分析。
关键词：地方种质资源；豆梨；ＧＰＸ基因；克隆；生物信息学分析
中图分类号：Ｓ　６６１．２ 文献标识码：Ａ
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＧＰＸＧｅｎｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｕｔｉａｎ　Ｐｅａｒ，Ｐｙｒｕｓｃａｌｌｅｒｙａｎａ　Ｄｅｃｎｅ
ＣＨＥＮ　Ｙｉ－ｔｉｎｇ１，ＺＨＡＮＧ　Ｃｈａｎｇ－ｈｅ２，ＣＨＥＮ　Ｔｉｎｇ１，ＣＨＥＮ　Ｚｈａｏ－ｄｉ　１
（１．Ｆｒｕｉｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｕｊｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５００１３，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｊｉａｎｎｉｎｇ　Ｃｏｕｎｔｙ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｂｕｒｅａｕ，Ｓａｎｍｉｎｇ，Ｆｕｊｉａｎ　３５４５００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｇｅｎｅ（ＧＰＸ）ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｐｕｔｉａｎ　ｐｅａｒ，ＰｙｒｕｓｃａｌｌｅｒｙａｎａＤｅｃｎｅ．
Ｔｈｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎｄ　ＲＡＣＥ　ｗｅｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ＧＰＸ．Ｔｈｅ　ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ
ｗａｓ　ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ　９３２ｂｐ　ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ａｎ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　ｏｆ　５０７ｂｐｗｉｔｈ　ｔｈｅ　５′－ａｎｄ　３′－ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ
２０４ｂｐ　ａｎｄ　２２１ｂｐ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈａｄ　１６８ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｇｒｅａｔｅｒ　ｔｈａｎ　９０％ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ
ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　Ｍａｌｕｓｐｕｍｉｌａ，Ｃｉｔｒｕｓ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ　Ｂａｎｃｏ，Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓｌｏｎｇａｎ　ａｎｄ　Ｌｉｔｃｈｉ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ
ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋｗｉｔｈ　ａ　ｃｏｄｅ　ｏｆ　ＪＱ０１１２７８．Ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＧＰＸ ｗｅｒｅ
ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈａｄ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　２０
０８３．０Ｄａ　ａｎｄａ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｐＩ　５．６１．Ｉｔ　ｗａｓ　ａ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｄ
ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｗａｓ　ｍａｉｎｌｙ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ　ａｔ　ａ　ｒｅｇｉｏｎ　ｍｏｓｔ　ｌｉｋｅｌｙ　ｔｏ　ｆｏｒｍ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
２６．５８％α－ｓｐｉｒａｌ，１９．２６％ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ　ｃｈａｉｎ　ａｎｄ　５４．１６％ｉｒｒｅｇｕｌａｒ　ｃｕｒｌ．Ａｎｄ，ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　１２ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ　ｏｎ
ｔｈｅ　ｃｅｌ．Ａ３－Ｄｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｗａｓ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｌｅｖａｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｒｅｇｉｏｎａｌ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ； Ｐｕｔｉａｎ　ｐｅａｒ （Ｐｙｒｕｓｃａｌｌｅｒｙａｎａ　Ｄｅｃｎｅ）；ＧＰＸ　ｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｅ；
ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
　 　 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 （ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＧＰＸ）是含有巯基的过氧化物酶类，
它与过氧化氢酶 （ＣＡＴ）、抗坏血酸过氧化物酶
（ＡＰＸ）和超氧化物歧化酶 （ＳＯＤ）同样具有清除
活性 氧 （ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）的 作
用［１］。现在已经明确动物体内的 ＧＰＸｓ是清除
ＲＯＳ的主要防御酶，其清除ＲＯＳ的主要酶类是谷
胱甘肽过氧化物酶，根据其亚细胞定位、氨基酸序
福建农业学报３０（９）：８６８～８７３，２０１５
Ｆｕｊｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１００８－０３８４ （２０１５）０９－８６８－０６
列不同以及结合底物的特异性，它又可分为几种不
同 的 同 工 酶， 并 且 ＧＰＸ 多 数 以 ＧＳＨ
（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）作为底物催化分解生物体内产生的
Ｈ２Ｏ２。植物ＧＰＸ研究比较晚，直到最近几年，在
植物中才开展了ＧＰＸ功能研究，植物的这些酶在
结构、底物的特异性及植物组织的分布上与动物的
ＧＰＸ有很大的不同，但是对清除ＲＯＳ、抵御外界
胁迫起了很重要的作用［２－４］。目前研究人员已经从
龙眼、荔枝、柑橘、拟南芥、大白菜、菠菜、向日
葵、番茄、豌豆、水稻、烟草、丹参等植物中分离
到ＧＰＸ基因［５－１２］，但尚未见过在梨方面的报道。
福建背山面海，地形复杂，气候多样，尤其是
地处中亚热带南沿内陆的闽西北山区县市冬季气温
低、春季回温快、夏秋昼夜温差大，发展南方优质
早熟梨具有同一纬度区域难以具备的比较优势［１３］。
据２０１４年福建省统计年鉴统计，２０１３年全省梨种
植面积１．３８万ｈｍ２，年产量１０．７万ｔ，已成为闽
西北山区县 （市区）农业增效、农民增收的优势产
业。然而，福建气候高温高湿，梨栽培品种病虫害
易发生，抗逆性较差。豆梨属于蔷薇科梨属落叶乔
木，别名鹿梨、棠梨、野梨、鸟梨等，原产我国华
东、华南各地至越南，有若干变种，常野生于温暖
潮湿的山坡、沼地、杂木林中，抗逆性强，可用作
嫁接西洋梨、砂梨等的砧木。鉴于此，本研究首次
从福建省地方梨种质资源－莆田野生豆梨幼嫩叶片
里克隆ＧＰＸ 的ｃＤＮＡ全长，并对其编码的蛋白质
序列进行较详细的生物信息学分析，将为进一步研
究梨ＧＰＸ的功能以及比较全面了解梨抗氧化体系
打下基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
本试验以福建省莆田市大洋乡采集的野生豆梨
的幼嫩叶片作为试验材料。
１．２　试验方法
１．２．１　莆田豆梨ＲＮＡ的提取以及ｃＤＮＡ第一链
的合成　总ＲＮＡ提取按照改良的ＣＴＡＢ法并稍作
改进［１４－１５］；ｃＤＮＡ第一链的合成按Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公
司ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭＦｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ的试
剂盒说明书进行操作。
１．２．２　引物设计　检索 ＧｅｎＢａｎｋ上登录的 ＧＰＸ
ｍＲＮＡ或ｃＤＮＡ序列，设计保守区引物，设计时
重点关注亚热带果树类；根据保守区测序结果参考
已登录的其他物种的序列设计 ３′ＲＡＣＥ 以及
５′ＲＡＣＥ引物；根据拼接后的ｃＤＮＡ全长序列，在
起始密码子处和终止密码子处设计引物，用于扩增
ＧＰＸ的 ＯＲＦ 序列；引物设计、序列分析采用
ＤＮＡＭＡＮ软件。本研究中使用的引物序列见表
１，引物均委托上海生物工程技术公司合成。
表１　ＧＰＸ基因克隆及ＰＣＲ反应中使用到的引物序列
Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ＧＰＸａｓｓａｙｓ
引物 序列
Ｐ１　 ５′－ＧＴＣＡＡＴＧＴＴＧ　ＣＡＴＣＡＣＡＡＴＧ　ＴＧＧ－３′
Ｐ２　 ５′－ＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣ　ＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴ　ＣＡＡＴ－３′
Ｐ３　 ５′－ＣＡＣＡＡＴＧＴＧＧＣＴＴＧＡＣＴＡＡＴＴＣ－３′
Ｐ４　 ５′－ＣＴＡＣＡＣＡＧＡＧＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＧＴＡＴ－３′
Ｐ５　 ５′－ＣＡＡＡＣＡＧＴＣＣ　ＡＣＣＣＴＴＧＣＴＣ　ＧＡＣＴＴＣ－３′
Ｐ６　 ５′－ＧＣＣＴＴＧＡＡＧＣ　ＧＡＧＴＧＣＡＧＧＣ　ＡＡＡＣＴＣ－３′
Ｐ７　 ５′－ＴＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＧＡＴＣＧ－３′
Ｐ８　 ５′－ＴＣＡＴＧＣＡＡＴＣＣＣＣＡＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴ－３′
ＡＵＡＰ　 ５′－ＧＧＣ　ＣＡＣ　ＧＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴＡＧＴ　ＡＣＴ－３′
１．２．３　目的片段扩增　ＰＣＲ反应体系为：１．０μＬ
ｃＤＮＡ，１μＬ上游引物 （１０μｍｏｌ·Ｌ
－１），１μＬ下
游引物 （１０μｍｏｌ·Ｌ
－１），２．５μＬ　１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ
（含 Ｍｇ２＋），２μＬ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ（２．５ｍｍｏｌ·Ｌ
－１），
０．２μＬ　Ｔａｑ　ＥＸ（５Ｕ·μＬ
－１），补Ｈ２Ｏ至总体积为
２５μＬ。ＰＣＲ扩增程序为：在９４℃预变性５ｍｉｎ，
然后９４℃变性１ｍｉｎ、ＴＭ ℃退火４０ｓ、７２℃延
伸ｔ　ｓ，共３５个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ
扩增试剂由ＴａＫａＲａ公司出品。３′ＲＡＣＥ的ｃＤＮＡ
合成方法同１．２．１。以３′ＲＡＣＥ的ｃＤＮＡ为模板进
行第１轮ＰＣＲ扩增，将扩增产物稀释１００倍作第２
轮ＰＣＲ扩增的模板。
５′ＲＡＣＥ 参 照 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 的 ５′ＲＡＣＥ
Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ，
Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０的试剂盒说明书，以 ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒
为基础进行５＇－ＲＡＣＥ试验。其基本过程主要包括：
ｃＤＮＡ第一链的合成，ｃＤＮＡ第一链加同聚物尾，
在加尾的基础上进行ｃＤＮＡ第二链的合成，之后
产物用于ＰＣＲ扩增。以逆转录得到的ｃＤＮＡ第二
链为模板用引物ＡＵＡＰ和Ｐ５进行第１轮ＰＣＲ反
应，再以此扩增产物稀释１０　０００倍为模板，用
ＡＵＡＰ和Ｐ６进行第２轮ＰＣＲ反应。
莆田豆梨ＧＰＸ 的 ＯＲＦ克隆是以１．２．１中的
ｃＤＮＡ为模板，采用引物Ｐ７和Ｐ８进行ＰＣＲ扩增。
１．２．４　目的片段的回收、克隆和测序 　 采用
ＴａＫａＲａ公司ＰＣＲ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　Ｋｉｔ回收目
９６８第９期 陈义挺等：莆田豆梨ＧＰＸ基因克隆与生物信息学分析
的片段。制得Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α感受态细胞，
以ＴａＫａＲａ公司的ｐＭＤ－１８Ｔ为载体对回收片段转
化和克隆，对鉴定正确含有目的片段的大肠杆菌菌
株阳性克隆子送上海生物工程技术公司进行测序。
１．２．５　序列分析及生物信息学分析　已有序列检
索使用 ＧｅｎＢａｎｋ的 Ｂｌａｓｔ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／），引物设计、序列拼接及
分析、内含子分析采用 ＤＮＡＭＡＮ软件。获得的
ｃＤＮＡ全长序列登录ＧｅｎＢａｎｋ。序列推测蛋白的理
化性质预测采用 ＥｘＰＡＳｙ　ＰｒｏｔＰａｒａｍ （ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）；跨膜结
构预测与分析采用 Ｔｍｐｅｒｅｄ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．
ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｅｐｒｅｄ－ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）；亚细胞
定位预测与分析采用ＰＳＯＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．
ａｃ．ｊｐ／）；蛋白质二级结构预测采用Ｊｐｒｅｄ程序
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／）；蛋白卷
曲螺旋结构的预测与分析采用 Ｃｏｉｌｓ（ｈｔｔｐ：／／／
ＣＯＩＬＳ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）；磷酸化位点预测与分析采用
ＮｅｔＰｈｏｓ２．０Ｓｅｒｖｅ （．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＰｈｏｓ／）；
功能的预测与分析采用Ｇｅｎｅ　Ｏｎｔｏｌｏｇｙ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ
（．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／）；分子系统进化预测与分
析采用ＤＮＡＭＡＮ６．０软件中 Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ。
２　结果与分析
２．１　莆田豆梨叶片总ＲＮＡ的提取
本试验所提取的总ＲＮＡ样品没有呈胶状，色
泽近白色说明大多数酚类、多糖、蛋白质等物质已
被较彻底去除。电泳检测显示，分离得到的总
ＲＮＡ质量较好，２８Ｓ和１８Ｓ的条带比较完整，２８Ｓ
ＲＮＡ亮度约１８ＳＲＮＡ　２倍 （图１）；紫外分光测
定、分析的结果显示，提取分离得到的总 ＲＮＡ，
其Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ为１．９４、ＯＤ２６０／ＯＤ２３０为
２．１２，可以看出经典的Ｔｒｉｚｏｌ法提取的ＲＮＡ质量
好、纯度较高，适于后续的 ＲＴ－ＰＣＲ 和 ＲＡＣＥ
试验。
２．２　莆田豆梨ＧＰＸ基因的ｃＤＮＡ的保守区的克隆
根据 ＧｅｎＢａｎｋ 上 已 有 ＧＰＸ 的 ｃＤＮＡ 或
ｍＲＮＡ序列，在最保守的区域设计引物Ｐ１和Ｐ２，
以Ｏｌｉｇｏ－ｄＴ１２－１８引物进行逆转录获得的ｃＤＮＡ为
模板，用ＧＰＸ的１对上下游引物进行ＰＣＲ扩增，
获得了１条与预期目标片段相符大小约４００ｂｐ的
ＤＮＡ片段 （图２）。测序的结果表明，该特异扩增
产物的实际大小３８７ｂｐ，这个序列的核苷酸和氨
基酸序列分别在ＧｅｎＢａｎｋ上经ＢＬＡＳＴ，均与数据
库中已有的 ＧＰＸ核苷酸和氨基酸序列高度同源，
图１　豆梨叶片总ＲＮＡ琼脂糖电泳
Ｆｉｇ．１　Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｐ．
ｃａｌｌｅｒｙａｎａ
注：１，２为豆梨叶片组织总ＲＮＡ电泳图，其中２条亮带分别是
２８ＳｒＲＮＡ和１８ＳｒＲＮＡ；Ｍ为 Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００，分子大小从上往
下分别为２　０００、１　０００、７５０、５００、２５０、１００ｂｐ。
其中与苹果、柑橘、龙眼、荔枝的核酸序列同源性
分别有９３％、９２％、９０％、８９％，氨基酸序列同
源性分别为９９％、９６％、９５％、９２％，初步推断
此片段为福建省地方梨种质资源———莆田豆梨
ＧＰＸ 的 ｃＤＮＡ 保 守 区 部 分 序 列。本 基 因 在
ＧｅｎＢａｎｋ上登录，登录号为ＪＱ０１１２７８。
图２　豆梨叶片中ＧＰＸ保守区扩增产物
Ｆｉｇ．２　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ＧＰＸｆｒｏｍ
Ｐ．ｃａｌｌｅｒｙａｎａｌｅａｖｅｓ
注：Ｍ为 Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　２　０００，分子大小从上往下分别为２　０００、
１　０００、７５０、５００、２５０、１００ｂｐ。
２．３　莆田豆梨ＧＰＸ 基因的ｃＤＮＡ的３′／５′－ＲＡＣＥ
扩增
根据已获得的莆田豆梨ＧＰＸ 基因保守区设计
了特异的３′ＲＡＣＥ的引物，经过２轮ＰＣＲ扩增，得
到了６００ｂｐ左右的单一条带（图３－Ａ），与预期片段
０７８ 福建农业学报 第３０卷
大小基本相符。第１次ＰＣＲ产物不理想，条带模
糊、弥散，说明扩增的效率不高，可能是３′ＲＡＣＥ第１
轮上游引物设计的不理想，存在一些非特异的扩增；
而经过第２轮的扩增后，发现扩增的量明显提高，而
且扩增的效果远比第１次好，说明扩增的特异性极
大地提高了。测序的结果显示，３′ＲＡＣＥ的长度为
５８１ｂｐ，将该片段克隆、测序后，测序结果含有设计
的上下游引物，且与原有的片段具有２４３ｂｐ的重叠
区，有３０ｂｐ的ｐｏｌｙ（Ａ）结构，表明所克隆的片段正
是莆田豆梨ＧＰＸ基因的３′末端。
以ＧＰＸ－５′ＲＡＣＥ－１为特异引物进行ｃＤＮＡ第
一链合成。采用ＡＵＡＰ和Ｐ５、ＡＵＡＰ和Ｐ６分别
用于第１、２轮的特异扩增。第１轮扩增获得比较
模糊、弥散的条带，第２轮用第１轮的ＰＣＲ产物
稀释１００倍后再做引物扩增得到了一条特异性好，
且较稳定５００ｂｐ的条带 （图３－Ｂ）。从测序回来的
结果可以看出，测序共加了３７个Ｔ碱基，说明试
验中加的Ｔ尾较为成功。
图３　豆梨叶片中 ＧＰＸｃＤＮＡ 的３′／５′－ＲＡＣＥ 第２轮
ＰＣＲ扩增结果
Ｆｉｇ．３　Ｓｅｃｏｎｄ　ｒｏｕｎｄ　ＰＣＲ　ｏｆ　３′ＲＡＣＥ　ａｎｄ　５′ＲＡＣＥｏｆ　ＧＰＸ
ｆｒｏｍＰ．ｃａｌｌｅｒｙａｎａｌｅａｖｅｓ
注：Ａ为豆梨叶片中ＧＰＸｃＤＮＡ的３′ＲＡＣＥ第２轮ＰＣＲ扩增结
果，Ｂ为豆梨叶片中ＧＰＸｃＤＮＡ的５′ＲＡＣＥ第２轮ＰＣＲ扩增结
果。Ｍ为 Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　２　０００，分子大小从上往下分别为２　０００、
１　０００、７５０、５００、２５０、１００ｂｐ。
２．４　莆田豆梨ＧＰＸ基因全长序列的扩增
为了验证经过保守区，３′ＲＡＣＥ和５′ＲＡＣＥ
扩增的福建省地方梨种质资源莆田豆梨ＧＰＸ 的
ｃＤＮＡ全长序列，本试验还进行了ＧＰＸＯＲＦ的扩
增，结果显示为５００多ｂｐ明亮的特意条带 （图
４），经过克隆测序表明此片段与拼接的ｃＤＮＡ全
长序列的相应部分全部重叠，是莆田豆梨ＧＰＸ 的
ＯＲＦ克隆，同时也证明了拼接序列的正确性。
图４　豆梨叶片组织ＧＰＸＯＲＦ的扩增结果
Ｆｉｇ．４　ＯＲＦ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧＰＸｆｒｏｍＰ．ｃａｌｅｒｙａｎａｌｅａｖｅｓ
注：Ｍ为 Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　２　０００，分子大小从上往下分别为２　０００、
１　０００、７５０、５００、２５０、１００ｂｐ。
根据获得的５＇端序列和上述保守区、３′端序
列，采用 ＤＡＮＭＡＮ６．０软件进行拼接。结果表
明：莆田豆梨 ＥＣ中ＧＰＸ 的ｃＤＮＡ 全长为９３２
ｂｐ，５＇ＵＴＲ为２０４ｂｐ，３＇ＵＴＲ为２２１ｂｐ，有终止
子ＴＡＧ，区域还含有典型的加尾信号ＡＡＴＡＡ和
３０个ｐｏｌｙ （Ａ）尾。拼接后的福建省地方梨种质
资源莆田豆梨ＧＰＸ　ｃＤＮＡ全长序列与翻译的氨基
酸序列见图５。
图５　莆田豆梨ＧＰＸ　ｃＤＮＡ全长序列与翻译的氨基酸序列
Ｆｉｇ．５　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃＤＮＡ　ｌｅｎｇｔｈ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｏｒ　ＧＰＸｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｐｕｔｉａｎ　ｐｅａｒ
注：方框表示加尾信号，＊号表示终止子。
１７８第９期 陈义挺等：莆田豆梨ＧＰＸ基因克隆与生物信息学分析
２．５　莆田豆梨ＧＰＸ的生物信息学分析
应用生物信息学软件对莆田豆梨ＧＰＸ 基因的
核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析。结果表明：
ＧＰＸ蛋白的分子量是２０　０８３．０Ｄａ，理论等电点ｐＩ
５．６１，是不具跨膜结构域的亲水性胞质蛋白，不具
有信号肽，细胞主要定位在叶绿体基质上，有１个
区域最有可能形成卷曲螺旋；蛋白质二级结构预测
表明：无规则卷曲结构为主，所占 的 比 例 为
５４．１６％，其次为α螺旋结构２６．５８％，而延伸构
象占的比例较少，仅为１９．２６％。磷酸化位点有１２
个，其中Ｓｅｒ：７个，Ｔｈｒ：１个；Ｔｙｒ：４个 （图
６）。对莆田豆梨胚性愈伤的ＧＰＸ结构和功能进行
上述的预测，可以推测福建省地方梨种质资源莆田
豆梨ＧＰＸ属于谷胱甘肽过氧化物酶家族，有着非
常保守的结构域，参与氧化还原和氧化应激反应的
生物过程，参加活性氧的清除，应对胁迫等方面发
挥重要的作用。此外，还对ＧＰＸ酶分子三维立体
结构等进行了预测和分析，从图中７可以看出，豆
梨ＧＰＸ三维结构主要由不规则卷曲构成，在结构
中间有一个较大的凹陷，这可能是此豆梨ＧＰＸ的
催化活性部位，通过这个中心，酶与底物接触。用
ＤＮＡＭＡＮ　６．０软件中 Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ程序对
莆田豆梨与苹果、柑橘、龙眼、荔枝等其他１３种
不同物种的ＧＰＸ氨基酸序列进行分子系统进化分
析，结果如图见图８。从图８可以看出，１３种植物
１２种植物聚成一大组，豆梨和苹果都属于一个科，
即蔷薇科，亲缘关系较近，在进化上也靠得最近，
首先聚在一起。从系统分子系统发生树还可以看
出，植物之间的亲缘关系都很近，同源率在７９％
以上，此结果对判断物种间的亲缘关系具有一定的
借鉴意义。
图６　豆梨ＧＰＸ氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测
Ｆｉｇ．６　Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ　ｉｎ　ＧＰＸａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
图７　豆梨ＧＰＸ蛋白预测的三级结构预测
Ｆｉｇ．７　Ｐｒｏｐｏｓｅｄ　３－Ｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＧＰＸ　ｅｎｚｙｍｅ
ｏｆ　Ｐ．ｃａｌｌｅｒｙａｎａｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＳＷＩＳＳ－Ｍｏｄｅｌ
图８　豆梨ＧＰＸ与其他物种的系统进化关系
Ｆｉｇ．８ 　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ＧＰＸ　ｆｒｏｍ　Ｐ．
ｃａｌｌｅｒｙａｎａａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ
３　讨　论
目前，不少研究者已在多种植物上进行了
ＧＰＸ各种同工酶基因的分子克隆，但多集中在草
本植物上，木本植物由于遗传背景较复杂，至今得
到ＧＰＸ基因全长的相对较少。本试验根据已有其
他植物ＧＰＸ 保守区序列设计１对引物，用 ＲＴ－
ＰＣＲ扩增出特异片段，在此序列信息的基础上，
再设计了半嵌套引物，以３′／５′－ＲＡＣＥ扩增成功获
得ｃＤＮＡ全长，经过进一步的序列分析发现该序
２７８ 福建农业学报 第３０卷
列推导的理论编码产物与已登录蛋白质数据库的其
他植物 ＧＰＸ 有很高的同源性。今后，通过基于
ＥＳＴ库信息或基于已有ＧＰＸ 的ｃＤＮＡ 序列，可
以进一步探讨分离ＧＰＸ其他的家族成员。
植物ＧＰＸ对清除ＲＯＳ和抵御外界胁迫起了很
重要的作用［１］。植物体内也存在类似于哺乳动物的
ＧＰＸｓ家族，在拟南芥中谷胱甘肽过氧化物酶就存
在８种同工酶类ＡｔＧＰＸ１２８，认为植物谷胱甘肽过
氧化物酶ＧＰＸｓ为非组成性表达，而是由环境胁迫
的诱导才进行 ＧＰＸｓ的表达，ＧＰＸ及相关酶类活
性的提高，可增强植物对各种环境胁迫的抗
性［１６－１８］。
经过３年的试验观察，采用的材料－莆田豆梨
在野生状态下全树无病斑，叶片光滑、明亮、翠
绿，抗逆性强 （抗病、抗涝、抗冻与抗旱），在１０
月份中旬之前没有落叶现象［１９］。此外，利用生物
信息学对莆田豆梨的ＧＰＸ 的结构和功能进行预
测，推测出莆田豆梨ＧＰＸ属于谷胱甘肽过氧化物
酶家族，有着非常保守的结构域，参与的生物过程
为氧化还原和氧化应激反应，在活性氧的清除等应
对逆境胁迫方面发挥重要的作用，为下一步在真核
表达系统中表达和ＧＰＸ 基因相关功能的研究提供
了理论依据，还可将ＧＰＸ 基因转入中间载体后，
进行转基因植物的研究，探讨外源或内源ＧＰＸ基
因表达对莆田豆梨抗性影响，为梨或其他植物发育
调控等方面的遗传改良提供良好的目的基因资源。
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（责任编辑：柯文辉）
３７８第９期 陈义挺等：莆田豆梨ＧＰＸ基因克隆与生物信息学分析