全 文 ：核 农 学 报 2017，31(1):0051 ～ 0058
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2015-10-25 接受日期:2016-02-28
基金项目:江苏省农业科技自主创新资金项目［CX(15)1029］
作者简介:刘玲，女，主要从事草莓的遗传育种研究。E-mail:2013104023@ njau． edu． cn
* 通讯作者:乔玉山，男，教授，主要从事果树育种与生物技术研究。E-mail:qiaoyushan@ njau． edu． cn
文章编号:1000-8551(2017)01-0051-08
黄毛草莓叶片离体再生及其同源四倍体的诱导
刘 玲 葛春峰 王 涛 陈孟龙 乔玉山*
(南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095)
摘 要:为探究黄毛草莓叶片离体再生率及其同源四倍体的诱导效果，以黄毛草莓试管苗叶片和离体芽
尖为材料，研究了不同激素配比对叶片离体再生的影响以及不同秋水仙素浓度和处理时间对其染色体
的加倍效果。结果表明，黄毛草莓离体叶片在 MS +1. 0 mg·L －1 TDZ + 0. 1 mg·L －1 IBA的培养基上不
定芽的再生率最高，为 73. 19%;0. 15%秋水仙素处理草莓离体芽尖 48 h 诱导效果最佳，诱导率达
13. 33%，获得了经染色体计数确定为四倍体的株系 12 个，四倍体基因组 DNA含量发生了倍增，染色体
数量由 14(2n = 2x = 14)条增加到 28(2n = 4x = 28)条。与二倍体相比，四倍体黄毛草莓叶片更大更厚，
颜色更深，叶形指数减小，气孔变大，叶绿素含量升高，整体植株生长势较强。黄毛草莓同源四倍体株系
的获得为黄毛草莓的进一步研究奠定了基础。
关键词:黄毛草莓;离体再生;秋水仙素;同源四倍体
DOI:10． 11869 / j． issn． 100-8551. 2017. 01． 0051
草莓(Fragaria spp．)在世界范围内广泛栽培，除了
栽培草莓(F． × ananassa Duch．)外，还分布着丰富的
野生草莓资源［1］。部分野生草莓资源具有某些优良的
特性和广泛的适应性，例如抗逆性强，芳香味浓，维生素
含量高等，但是多数倍性较低，与普通栽培草莓杂交时
易出现不亲和或育性差等现象［2 － 4］。对低倍性野生草
莓进行加倍诱导以提高其倍性，有利于野生草莓资源的
利用。黄毛草莓(F． nilgerrensis)是原产我国云南、四
川、陕西、贵州、湖南、湖北和台湾的二倍体野生草莓［5］。
日本利用原产我国云南的黄毛草莓培育了 2 个十倍体
草莓品种，即久留米 IH1 号(Kurume IH No． 1)和桃薰
(Tokun)，在日本已获品种登录，成功将二倍体黄毛草莓
的优异性状导入到栽培品种［6 － 7］。Staudt［8］认为黄毛草
莓可能是四倍体西南草莓［F． moupinensis (Franch．)
Card．］的二倍体祖先，但尚未有直接证据。获得黄毛草
莓染色体加倍植株，对四倍体西南草莓的进化与遗传研
究有一定的帮助。
关于草莓多倍体的诱导，国内外已做了相关研究。
Hull［9］用秋水仙素处理栽培草莓(F． × ananassa
Duch． Missionory Premier，2n = 8x = 56)与智利草莓
(F． chiloensis (L．)Duch．，2n = 8x = 56)的杂交种子，
获得了十六倍体植株;高秀岩等［10］利用秋水仙素处理
得到了维斯塔尔草莓的十六倍体植株;张计育等［11］用
秋水仙素溶液处理栽培草莓雪蜜离体叶片得到了不同
倍性的变异植株;周宇等［12］也利用同样的方法成功获
得绿色草莓的四倍体试管苗。本研究建立了黄毛草莓
叶片离体再生体系，并利用秋水仙素诱导离体芽尖，创
建了黄毛草莓同源四倍体，以期为黄毛草莓的资源利
用研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
黄毛草莓试管苗(2 个株系，编号为 HM03 和
HM45)，通过茎尖培养获得，由南京农业大学果树生
物技术实验室保存，在 MS 培养基上每 20 ～ 30 d 继代
1 次。
1. 2 方法
1. 2. 1 叶片离体再生激素配比 设计激素 TDZ 与
IBA不同组合的再生培养基，TDZ 的浓度分别为 1. 0、
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核 农 学 报 31 卷
1. 5、2. 0、2. 5、3. 0 mg·L －1，IBA 浓度分别为 0. 1、0. 2、
0. 4、0. 6 mg·L －1，共 16 个处理(表 1)。基本培养基为
MS，附加 30 g·L －1蔗糖，5. 5 ～ 5. 8 g·L －1琼脂，pH 值
6. 0，培养基 121 ℃湿热灭菌 20 min。
1. 2. 2 外植体处理 从试管苗 HM03 上选取平整、幼
嫩的叶片，用剪刀沿垂直叶脉方向将叶片刻伤(不剪
断)，然后分别接种在不同激素组合的再生培养基上，
每处理 3 个平板。
表 1 不同植物激素配比组合对黄毛草莓 HM03 离体叶片不定芽再生的影响
Table 1 Effects of different plant growth regulator combination on adventitious shoots
regeneration from leaf in vitro of F． nilgerrensis HM03
植物激素配比组合
Plant growth regulator combination
TDZ /(mg·L －1) IBA /(mg·L －1)
愈伤组织诱导率
Callus rate /%
不定芽再生频率
Adventitious shoot
regeneration rate /%
平均每个外植体再生芽数
No． of regeneration shoots
per explant
1. 0 0. 1 95. 46ab 73. 19a 1. 56a
1. 0 0. 2 77. 22def 8. 32efg 0. 97a
1. 5 0. 1 100. 00a 18. 88cdef 1. 50a
1. 5 0. 2 97. 91a 17. 10cdefg 1. 31a
1. 5 0. 4 67. 73f 7. 48efg 1. 03a
1. 5 0. 6 85. 93bcd 6. 00fg 1. 23a
2. 0 0. 1 100. 00a 6. 64fg 1. 13a
2. 0 0. 2 100. 00a 56. 92b 1. 60a
2. 0 0. 4 97. 36ab 29. 44c 1. 40a
2. 0 0. 6 96. 60ab 28. 63c 1. 52a
2. 5 0. 2 93. 09abc 25. 38cd 1. 47a
2. 5 0. 4 72. 11ef 10. 04defg 1. 48a
2. 5 0. 6 83. 03cde 23. 03cd 1. 34a
3. 0 0. 2 100. 00a 20. 24cde 1. 61a
3. 0 0. 4 94. 12abc 11. 79defg 1. 09a
3. 0 0. 6 74. 00ef 5. 41g 1. 66a
注:不同小写字母表示在 0. 05 水平上差异显著。下同。
Note:Different small letters indicated significant difference at 0. 05 level． The same as following．
1. 2. 3 培养条件 叶片外植体接种后首先进行 2 周
暗培养，然后转移至光下培养，光周期为 16 /8 h，光强
为 2 000 lx，温度为 25 ± 1 ℃。
1. 2. 4 秋水仙素处理条件 取出长势一致的 HM03离
体芽尖(长度约 0. 5 cm)，分别放入装有无菌水及
0. 05%、0. 10%、0. 15%、0. 20%经孔径 0. 22 μm 的水系
滤头抽滤灭菌的秋水仙素液体三角瓶中，分别放置在
TH2 － C恒温振荡器(苏州培英实验设备有限公司)中
避光震荡培养36、48、60 h，转速120 r·min －1，温度25 ±1
℃。取出秋水仙素处理后的离体芽尖，无菌水冲洗 5
遍，接种于 MS培养基中，每个处理 10 瓶，每瓶 5 ～ 7 个
离体芽尖，每 20 d继代培养 1次。
1. 2. 5 黄毛草莓 HM45 的诱导 利用秋水仙素浓度
和处理时间的最佳组合对另一个黄毛草莓株系 HM45
进行加倍诱导。
1. 2. 6 四倍体的扩繁移栽 将诱导产生的四倍体离
体芽尖接种于增殖培养基(MS +0. 4 mg·L －1 6 － BA +
0. 1 mg·L －1 NAA)［13］中进行扩繁(每个离体芽尖增殖
后的植株视为一个株系)，继代培养 2 次，周期 30 d。
将形态正常的再生植株接种于生根培养基(1 /2 MS +
0. 2 mg·L －1 IBA)［13］中培养，25 d 后进行炼苗处理，然
后移栽到灭过菌的基质(草炭∶蛭石∶珍珠岩 = 9∶ 3∶ 1，
V /V /V)中生长。
1. 3 倍性鉴定
1. 3. 1 流式细胞仪鉴定 FACScan流式细胞仪(美国
BECKMAN公司)，激发光源为 15 mW 氩离子，激发波
长为 488 nm，用于检测样品的 PI荧光激发强度。参考
于红梅等［14］的方法并略加改进。待组培苗长有 4 ～ 5
25
1 期 黄毛草莓叶片离体再生及其同源四倍体的诱导
片叶时，取植株嫩叶约 0. 1 g，并在装有 1. 0 mL 核提取
缓冲 液［15 mmol·L －1 Tris-HCl (pH 值 7. 5)，80
mmol·L －1 KCl，20 mmol·L －1 NaCl，20 mmol·L －1 EDTA-
Na2，2. 0% PVP，体积分数 0. 1%的 TritonX － 100］的培
养皿中切碎，孵育 5 min 后，400 目尼龙网过滤，得到细
胞核悬浮液。吸取细胞核悬浮液 300 uL，加入同等体积
的碘化丙啶染液(45 mg·L －1 ＲNase A，10 μg·mL －1 PI)，
混合摇匀后置于冰水混合物中避光染色 2 h 后上机测
定样品单个细胞核的 DNA含量。以二倍体黄毛草莓作
为对照，每测 10个样品即测定 1次对照样品。
1. 3. 2 染色体计数 将通过流式细胞仪初步鉴定为
四倍体的植株转移至生根培养基上生根。细胞学镜鉴
参考王春彦等［15］的方法并略有改进。9:00 － 11:00 取
黄毛草莓四倍体组培苗及对照植株的根尖，用蒸馏水
冲洗干净后置于冰水混合物中 20 ～ 24 h，然后用卡诺
固定液(无水乙醇 ∶ 冰醋酸 = 3 ∶ 1，v /v)固定24 h，用
1. 0 mol·L －1 HCl 在 60 ℃水浴锅中解离软化根尖 10
min，再放入蒸馏水中浸泡 2 min。以改良的卡宝品红
染色并常规压片［16］，染色体分散度良好的样片用
Zeiss光学显微镜(德国蔡司公司)观察并拍照，记录染
色体数目，每个样品观察分裂好的细胞 20 个。
1. 4 四倍体生物学特性观察
取同一时期(移栽后 30 d)的正常二倍体和四倍
体植株，选取每株中心展开叶往外数的第 3 叶，用直尺
测量叶片的长度和宽度，游标卡尺测量叶片厚度。每
个株系随机抽样 10 株，求平均值。取第 3 叶叶片的下
表皮(避开叶脉)，置于载玻片上，改良品红染色后于
显微镜下观察，用测微尺测量气孔的大小，随机测量
30 个气孔长度求出平均值。在晴天上午 9:00，同时取
二倍体和四倍体的相同部位，叶龄相同，成熟健壮的叶
片测量叶绿素含量，叶绿素含量测定参照王学奎［17］的
方法。
1. 5 统计方法与数据处理
愈伤组织形成率 =形成愈伤组织的外植体数 /接
种的外植体数 × 100%;叶片再生芽率 =具再生芽的叶
片数 /接种叶片数 × 100%;叶片再生芽数 =再生芽总
数 /再生芽叶片数;叶形指数 =叶长 /叶宽。试验结果
均采用 STST统计软件进行方差分析。
2 结果与分析
2. 1 不同植物激素配比对黄毛草莓 HM03 离体叶片
再生的影响
将刻伤的草莓叶片接种在不同激素配比的培养基
上，暗培养 2 周后，叶片开始膨大，颜色变浅，移到光照
培养室，1 周后在伤口处有白色愈伤组织形成。光照
下培养 1 个月后，在愈伤组织周边或叶片中间有绿色
嫩芽出现，在 60 d有大量不定芽形成。
在研究 MS 培养基上附加不同浓度的 TDZ 和 IBA
对黄毛草莓叶片不定芽再生的影响时，发现不同激素配
比对离体叶片愈伤组织的诱导率均较高，对每个外植体
的再生芽数影响不大，但是对不定芽的诱导率却存在显
著差异。TDZ和 IBA的最适浓度分别为 1. 0 mg·L －1和
0. 1 mg·L －1，其相应处理的愈伤组织诱导率达 95. 46%，
不定芽再生率达 73. 19%，平均每个外植体再生芽数为
1. 56个(表 1)。因此黄毛草莓 HM03 离体叶片不定芽
再生的最佳培养基为 MS +1. 0 mg·L －1 TDZ +0. 1 mg·
L －1 IBA。
2. 3 秋水仙素对黄毛草莓离体芽尖的诱导效果及倍
性鉴定
2. 3. 1 秋水仙素对黄毛草莓离体芽尖的诱导效果 由
表 2可知，在所有诱变处理中除对照未检测到多倍体
外，其余均出现多倍体，表明多倍体的发生是由秋水仙
素诱导形成，而不是在组织培养中因无性系变异产生。
总体上看，随着秋水仙素浓度的升高和处理时间的加
长，诱变植株的存活率呈下降趋势。从多倍体的诱导效
果来看，秋水仙素浓度在 0. 05% ～0. 20%的范围内均有
效。在处理 36 h时，随着秋水仙素浓度的增大，诱导率
呈上升趋势;处理 48 h和 60 h、秋水仙素浓度在 0. 05%
～ 0. 20%时，随浓度升高诱导率出现先上升后下降趋
势。在 0. 15%秋水仙素处理 48 h时诱导率达到最高值
为 13. 33%，相应的混倍体率也达到最大值(42. 22%)，
说明其诱导效果最佳。共处理 HM03 茎尖数 908 个，获
得 19个四倍体株系，145个混倍体株系。用上述最佳诱
导方法处理 HM45茎尖数 54个，获得四倍体株系 3 个，
混倍体 9个，进一步说明该方法的有效性。
2. 3. 2 倍性鉴定 在同一参数下，二倍体植株在荧光
强度 100 处出现 1 个主峰(图 1 － A)，四倍体植株在荧
光强度 200 处出现 1 个主峰(图 1 － B)，四倍体植株的
DNA相对含量是二倍体的 2 倍。在流式细胞仪鉴定
中，除发现有 2x、4x 外，还检测到较多的混倍体(图 1
－ C)。为进一步验证黄毛草莓试管苗的倍性，将对照
和处理的植株通过根尖染色体细胞计数鉴定植株倍
性，结果表明二倍体染色体为 2n = 2x = 14(图 1 － D)，
四倍体染色体 2n = 4x = 28(图 1 － E)。四倍体 HM03
经驯化移栽后，获得 9 个株系，编号为 DF03 － 01 ～
DF03 － 09;获得 HM45 四倍体株系 3 个，编号为 DF45
－ 01 ～ DF45 － 03。
35
核 农 学 报 31 卷
表 2 秋水仙素浓度和处理时间对黄毛草莓 HM03 离体芽尖诱导多倍体的影响
Table 2 Effects of colchicine concentrations and duration on polyploidy induction of shoots in vitro of F． nilgerrensis HM03
处理时间
Duration of
treatment /
h
秋水仙素
浓度
Concentration
of colchicine /
%
处理芽尖数
No． of shoots
treated
成活数
No． of
alive
成活率
Ｒate of
alive /%
诱导株数
No． of
induction
诱导率
Ｒate of
induction /%
未加倍
株数
No． of
undoubled
未加倍率
Ｒate of
undoubled /
%
混倍体
株数
No． of
mixoploids
混倍体
比率
Ｒate of
mixoploids /
%
36 0． 00 60 60 100． 00 0 0． 00 60 100． 00 0 0． 00
0． 05 66 56 84． 85 0 0． 00 45 80． 36 11 19． 64
0． 10 61 48 78． 69 1 2． 08 38 79． 17 9 18． 75
0． 15 66 47 71． 21 1 2． 13 34 72． 34 12 25． 53
0． 20 58 41 70． 69 2 4． 88 24 58． 54 15 36． 59
48 0． 00 60 56 93． 33 0 0． 00 56 100． 00 0 0． 00
0． 05 59 50 84． 75 1 2． 00 34 68． 00 15 30． 00
0． 10 63 48 76． 19 2 4． 17 35 72． 92 11 22． 92
0． 15 62 45 72． 58 6 13． 33 20 44． 44 19 42． 22
0． 20 59 41 69． 49 2 4． 88 22 53． 66 17 41． 46
60 0． 00 60 54 90． 00 0 0． 00 54 100． 00 0 0． 00
0． 05 61 49 80． 33 1 2． 04 41 83． 67 7 14． 29
0． 10 58 43 74． 14 2 4． 65 31 72． 09 10 23． 26
0． 15 58 39 67． 24 1 2． 56 30 76． 92 8 20． 51
0． 20 57 33 57． 89 0 0． 00 22 66． 67 11 33． 33
总计 Total 908 710 78． 19 19 2． 68 546 76． 90 145 20． 42
注:成活率 =成活数 /处理芽尖数 × 100%;诱导率 =诱导株数 /成活数 × 100%;未加倍比率 =未加倍株数 /成活数 × 100%;混倍体率 =混倍体株
数 /成活数 × 100%。
Note:Ｒate of alive = No． of alive /No． of shoots treated × 100% ． Ｒate of induction = No． of induction /No． of alive × 100% ． Ｒate of undoubled = No． of
undoubled /No． of alive × 100% ． Ｒate of mixoploids = No． of mixoploids /No． of alive × 100% ．
2. 4 生物学特性观察
组织培养早期，在同一生长条件(MS + 30 g·L －1
蔗糖 + 6 g·L －1琼脂)及相同时间下，通过观察试管苗
发现，经秋水仙素处理的试管苗形态与对照植株有较
明显的区别。处理的试管苗生长缓慢，叶片大多呈卷
曲状态;而对照植株生长较快，叶片平展。组织培养
60 d后发现四倍体株系的生长速度加快，植株健壮，
叶色浓绿。选取编号 DF03 － 06 和 DF45 － 02 株系进
行田间苗观察，发现与二倍体相比，四倍体表现出叶片
变大变厚、叶形指数减小等特征。同时通过观察叶片
下表皮细胞发现，黄毛草莓二倍体与四倍体的保卫细
胞大小存在显著差异:四倍体的保卫细胞明显增大，保
卫细胞密度减少(表 3)。
对二倍体和四倍体的叶绿素含量分析发现，黄毛
草莓四倍体叶片的叶绿素 a、叶绿素 b 及叶绿素总量
较高。由表 3 可知，HM03 四倍体的叶绿素 a、叶绿素
b、总叶绿素含量比二倍体的分别高 15. 31%、
10. 95%、14. 18%，不同倍性间差异显著;而 HM45 四
倍体的叶绿素 a、叶绿素 b、总叶绿素含量较二倍体的
分别高 15. 08%、6. 28%、12. 53%，两者之间叶绿素 a
含量差异显著。
3 讨论
3. 1 黄毛草莓叶片的离体再生
TDZ与 IBA激素的不同浓度组合都能不同程度地
诱导黄毛草莓离体叶片愈伤组织和不定芽的发生，其中
以 1. 0 mg·L －1 TDZ 与 0. 1 mg·L －1 IBA组合效果最好。
不同的草莓品种离体叶片再生适宜的激素配比可能不
同，如马崇坚等［18］认为丰香草莓叶片再生最佳培养基
是 0. 5 mg·L －1 6 － BA 与 0. 1 mg·L －1 NAA。向发云
等［19］研究认为不同种类和浓度的植物生长调节剂诱导
叶片不定芽再生时，生长素类 IBA ＞ NAA ＞ 2，4 － D，细
胞分裂素类 TDZ活性强于 BA，这主要是由于 TDZ有较
高的细胞分裂活性，可诱导细胞分裂素的合成，抑制内
源激素的降解［20］，这也正是本研究选用 TDZ的原因。
45
1 期 黄毛草莓叶片离体再生及其同源四倍体的诱导
注:A:二倍体 DNA相对含量;B:四倍体 DNA相对含量;C:混倍体 DNA相对含量;D:二倍体染色体数;E:四倍体染色体数。
Note:A:The relative content of DNA of diploid． B:The relative content of DNA of tetraploid． C:The relative content of DNA of
mixoploid． D:The chromosome of diploid． E:The chromosome of tetraploid．
图 1 黄毛草莓同源四倍体倍性鉴定图
Fig． 1 Identification of autotetraploid of F． nilgerrensis
表 3 二倍体和四倍体黄毛草莓生物学特性比较
Table 3 Comparison of biological characteristics between diploid and tetraploid of F． nilgerrensis
生物学特性
Biological characteristics
株系 Lines
HM03 DF03 － 06 HM45 DF45 － 02
叶长 Length of leaf /cm 1． 867 ± 0． 233b 2． 500 ± 0． 310a 1． 900 ± 0． 130b 2． 333 ± 0． 162a
叶宽 Width of leaf /cm 1． 533 ± 0． 167b 2． 100 ± 0． 260a 1． 767 ± 0． 213b 2． 310 ± 0． 320a
叶厚 Thickness of leaf /mm 0． 467 ± 0． 133b 0． 703 ± 0． 193a 0． 470 ± 0． 120b 0． 647 ± 0． 221a
叶形指数 Leaf index 1． 218 1． 190 1． 086 1． 010
保卫细胞长度 Length of guard cells /μm 8． 71 ± 1． 76b 13． 39 ± 3． 51a 8． 08 ± 1． 19b 11． 95 ± 1． 27a
保卫细胞宽度 Width of guard cells /μm 6． 38 ± 1． 34b 9． 73 ± 2． 45a 5． 48 ± 1． 40b 8． 63 ± 1． 33a
叶绿素 a Chlorophyll a /(mg·g － 1) 1． 561 ± 0． 011b 1． 800 ± 0． 003a 1． 605 ± 0． 004b 1． 847 ± 0． 009a
叶绿素 b Chlorophyll a /(mg·g － 1) 0． 548 ± 0． 017b 0． 608 ± 0． 009a 0． 653 ± 0． 013a 0． 694 ± 0． 014a
总叶绿素含量 Chlorophyll content /(mg·g － 1) 2． 109 ± 0． 004b 2． 408 ± 0． 025a 2． 258 ± 0． 024a 2． 541 ± 0． 008a
3. 2 秋水仙素诱导浓度和时间
秋水仙素是常用的植物多倍体诱导剂，因对外植
体有毒害作用，若处理不恰当，容易导致所处理材料死
亡而影响诱导率。一般来说，不同植物、组织、器官等
对秋水仙素的敏感度有所差异。陈绪中等［21］用
0. 5%的秋水仙素处理鄂柿 1 号离体叶片 4 d，发现多
倍体诱导效果最好;王娜等［22］发现冬枣和酸枣用 50
mg·L －1秋水仙素处理 40 d，四倍体诱导率分别达到
36. 37%和 26. 67%;Petrov 等［23］用 1. 0%秋水仙素水
溶液处理四倍体东方草莓(F． orientalis Los．)的萌发种
子 46 h得到了八倍体植株;雷家军等［24］研究发现黄
毛草莓茎尖在含 200 mg·L －1秋水仙素的固体培养基
上培养 20 d以上几乎完全致死。本试验选用一定浓
度的秋水仙素溶液浸泡草莓离体芽尖的途径来获得多
倍体，其中 0. 15%秋水仙素处理 48 h时的诱导效果最
好，诱导率为 13. 33%。所有处理获得的黄毛草莓经
55
核 农 学 报 31 卷
注:Ⅰ:二倍体和四倍体叶片(从左到右依次是 HM03，DF03 － 06，HM45，DF45 － 02);Ⅱ:HM45 的二倍体和四倍体植株(左为二倍体，右为四
倍体);Ⅲ:HM03 的二倍体植株;Ⅳ:HM03 的四倍体植株．Ⅴ:二倍体的保卫细胞;Ⅵ:四倍体的保卫细胞。
Note:Ⅰ:Leaves of diploid and tetraploid plants(from left to right successively is HM03，DF03 － 06，HM45，DF45 － 02)． Ⅱ:Diploid and tetraploid
plants of HM45(left is diploid，right is tetraploid)． Ⅲ:Diploid plant of HM03． Ⅳ:Tetraploid plant of HM03． Ⅴ:Guard cells of diploid plant． Ⅵ:
Guard cells of tetraploid plant．
图 2 黄毛草莓二倍体与四倍体形态学与表皮细胞特征
Fig． 2 The characteristic of morphology and epidermic cells between diploid and tetraploid of F． nilgerrensis
染色体计数为四倍体的株系有 12 个，创新了草莓属植
物的种质资源，而如何进一步提高加倍率需要继续探
讨。
3. 3 嵌合体的出现
在秋水仙素诱导植物多倍体时，经常发现只有一
小部分细胞被加倍而出现很多嵌合体即混倍体的现
象。如童俊等［25］用秋水仙素诱导 3 种紫薇多倍体、王
红娟等［26］用秋水仙素处理茅苍术幼芽、张蜀敏等［27］
用秋水仙素和 2%DMSO 处理新疆雪莲种子、胚根、茎
段，均获得了大量嵌合体;崔广荣等［28］发现蝴蝶兰试
管苗叶片在较高浓度秋水仙素长时间处理下未产生嵌
合体，但在短时间、低浓度的秋水仙素处理下可检测到
嵌合体的存在。本研究中，秋水仙素无论较高浓度还
是较低浓度、处理较长时间还是较短时间，都不同程度
地出现混倍体，且无规律，与上述有关蝴蝶兰试管苗叶
片诱导加倍体观察到的现象不一致，这可能与诱导材
料的种类、秋水仙素作用部位以及处理环境等因素有
关，具体原因有待进一步探索。
3. 4 多倍体的鉴定
多倍体的鉴定方法有形态鉴定法、染色体敲片计
65
1 期 黄毛草莓叶片离体再生及其同源四倍体的诱导
数、气孔大小鉴定、叶绿体计数法［29］以及流式细胞仪
分析法［14］等。在试管苗阶段，植株生长缓慢，形态学
变化不明显，难以分辨是否加倍成功。草莓叶片革质、
密被绒毛、染色体较小，气孔鉴定、叶绿体计数以及染
色体计数等都比较费时费力，而流式细胞仪能够快速
检测出植株的相对 DNA 含量，且对鉴定材料要求不
高［30］。本研究先采用流式细胞仪对诱变材料进行倍
性快速测定，作为初步筛选;对初选对象再运用根尖染
色体计数鉴定，准确高效的确定诱变后的四倍体植株，
大大缩短了试验时间。
4 结论
本研究获得了黄毛草莓叶片离体再生的最佳培养
基为MS +1. 0 mg·L －1 TDZ +0. 1 mg·L －1 IBA，不定芽诱
导率达 73. 19%;利用秋水仙素对黄毛草莓离体芽尖进行
染色体加倍诱导，以 0. 15%秋水仙素处理 48 h的效果最
好，四倍体株系变异率最高，共获得了经染色体计数确定
为四倍体的株系 12个，其中 9个来自于HM03黄毛草莓，
3个来自于HM45黄毛草莓;部分四倍体株系表现为叶片
变大加厚，保卫细胞增大，叶色深绿。叶绿素 a、叶绿色 b
及总叶绿素含量均有所提高。黄毛草莓四倍体株系的获
得创新了草莓属植物种质资源，为进一步研究野生草莓
倍性进化，特别是为探讨西南草莓是否由黄毛草莓加倍
而来提供了材料基础;同时，黄毛草莓离体叶片再生体系
的建立，为其遗传转化奠定了方法基础。
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75
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2017，31(1):0051 ～ 0058
In vitro Ｒegeneration From Leaf of Fragaria nilgerrensis
and Autotetraploid Induced by Colchicine
LIU Ling GE Chunfeng WANG Tao CHEN Menglong QIAO Yushan*
(College of Horticulture，Nanjing Agriculture University，Nanjing，Jiangsu 210095)
Abstract:In order to explore in vitro regeneration rate and autoteraploid inducing effeciency，the leaves of Fragaria
nilgerrensis plantlet were used for studying the influences of different combinations of plant growth regulator on shoot
regeneration，and the shoots were employed to investigate the effects of colchicines at different concentrations and
treatment times on chromosome doubling． The results showed the best medium for in vitro F． nilgerrensis shoot
regeneration was MS + 1. 0 mg·L －1 TDZ +0. 1 mg·L －1 IBA on which the shoot regeneration was up to 73. 19%，the
highest mutation rate was 13. 33% under treatment with 0. 15% colchicines for 48 h，12 autotetraploid lines were
identified by chromosome counting． The genomic DNA content of autotetraploid lines was doubled and their chromosome
number increased from 14 (2n = 2x = 14)to 28 (2n = 4x = 28)as well． Compared to diploid plants，the autotetraploid
lines showed stronger growth vigor with bigger，thicker and darker leaves，smaller leaf index，bigger stomas，and more
chlorophyll． The obtainment of autotetraploid lines laid a foundation for further utilization research on Fragaria
nilgerrensis．
Keywords:Fragaria nilgerrensis，in vitro regeneration，colchicine，autotetraploid
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