全 文 ：第４１卷　第２期
２０１３年２月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４１ Ｎｏ．２
Ｆｅｂ．２０１３
网络出版时间：２０１３－０１－１４　１６：３６
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１３０１１４．１６３６．０３１．ｈｔｍｌ
中国野生毛葡萄白粉菌诱导响应ＶｑＡＰ基因的
克隆及表达分析
　［收稿日期］　２０１２－０６－０７
　［基金项目］　国家自然科学基金项目（３０８７１７０１，３１０７１７８２）
　［作者简介］　牛　姣（１９８８－），女，陕西潼关人，在读硕士，主要从事果树种质资源与生物技术研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｉｕｊｉａｏ．２００９＠１６３．ｃｏｍ
　［通信作者］　王西平（１９６８－），男，陕西渭南人，教授，博士生导师，主要从事果树种质资源与生物技术研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｉｐｉｎｇ＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ
牛　姣１，２，王西平１，２
（１西北农林科技大学 园艺学院，农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点开放实验室，陕西 杨凌７１２１００；
２旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌７１２１００）
［摘　要］　 【目的】克隆中国野生毛葡萄“商－２４”天冬氨酸蛋白酶（ＡＰ）基因的ｃＤＮＡ序列，明确其在葡萄抗病防
御机制中的作用。【方法】在前期获得的中国野生毛葡萄株系“商－２４”ＡＰ基因（ＶｑＡＰ）ＥＳＴ序列的基础上，采用ＲＴ－
ＰＣＲ克隆ＡＰ基因的ｃＤＮＡ序列，对其序列及编码产物进行生物信息学分析，并通过实时定量ＰＣＲ和半定量ＰＣＲ，
分析ＶｑＡＰ 基因在白粉菌诱导不同时间（０，６，１２，２４，４８，７２，９６和１２０ｈ），不同激素（１００μｍｏｌ／Ｌ水杨酸，５０μｍｏｌ／Ｌ
乙烯和０．５ｇ／Ｌ茉莉酸甲酯）刺激及不同组织（嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须）中的表达情况。【结果】序列分析表明，
ＶｑＡＰ 基因序列长度为１　３７７ｂｐ，具有开放阅读框，编码４５８个氨基酸残基，相对分子质量为５０．４８ｋｕ，等电点为
８．７３。保守结构域分析表明，ＶｑＡＰ 编码产物含有２个保守的具有催化活性的天冬氨酸残基，位于 Ａｓｐ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ－Ｇｌｙ
（ＤＴ／ＳＧ）结构域，该基因编码的氨基酸序列属于植物天冬氨酸蛋白酶 Ａ１家族，为非典型的天冬氨酸蛋白酶。荧光
定量ＰＣＲ结果表明，接种白粉菌后６ｈ，ＶｑＡＰ 基因表达量为０ｈ的６倍多，之后迅速下调；不同激素处理后，该基因也
均诱导表达，这可能是由于ＶｑＡＰ 基因参与了植物早期的抗病反应，以及由不同激素诱导的发病相关基因的调节作
用。半定量ＰＣＲ结果表明，在葡萄嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同组织中ＶｑＡＰ 基因的表达量不同，这可能与它参
与了植物不同组织中功能蛋白的合成与降解有关。【结论】ＶｑＡＰ 的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的
调控，可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。
［关键词］　中国野生毛葡萄；天冬氨酸蛋白酶（ＡＰ）；ＶｑＡＰ 基因；表达分析
［中图分类号］　Ｓ６６３．１；Ｑ７８６ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１３）０２－０１０１－０７
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｐｏｗｄｅｒｙ　ｍｉｌｄｅｗ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ
ＶｑＡＰｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｌｄ　Ｖｉｔｉｓ　ｑｕｉｎｑｕａｎｇｕｌａｒｉｓ
ＮＩＵ　Ｊｉａｏ１，２，ＷＡＮＧ　Ｘｉ－ｐｉｎｇ１，２
（１　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ，
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ；２　Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ
Ｃｒｏｐ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ａｒｉｄ　Ａｒｅａｓ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ａｉｍｅｄ　ｔｏ　ｃｌｏｎｅ　ａ　ｃＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａｓｐａｒｔｉｃ　ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＡＰ）ｉｎ　Ｖｉｔｉｓ
ｑｕｉｎｑｕａｎｇｕｌａｒｉｓ‘Ｓｈａｎｇ－２４’ｔｏ　ｖｅｒｉｆｙ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ＡＰｇｅｎｅ　ｉｎ　ｇｒａｐｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．【Ｍｅｔｈｏｄ】
Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａ　ＥＳＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＡＰｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＳＳＨ）ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ
ｙｏｕｎｇ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｌｄ　Ｖｉｔｉｓ　ｑｕｉｎｑｕａｎｇｕｌａｒｉｓ　ｃｌｏｎｅ‘Ｓｈａｎｇ－２４’ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｕｎｃｉｎｕｌａ　ｎｅｃａｔｏｒ
（Ｓｃｈｗ．）Ｂｕｒｒ，ｗｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＡＰｇｅｎｅ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇ－
DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2013.02.027
ｎａｔｅｄ　ａｓ　ＶｑＡＰ，ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｉｔ　ｗｉｔｈ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａ－
ｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｒｅｎｄｓ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅｓ（０，６，
１２，２４，４８，７２，９６ａｎｄ　１２０ｈ），ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ（１００μｍｏｌ／Ｌ　Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ，５０μｍｏｌ／Ｌ　Ｅｔｈｙｌ－
ｅｎｅ　ａｎｄ　０．５ｇ／Ｌ　Ｍｅｔｈｙｌ　ｊａｓｍｏｎａｔｅ）ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ（ｌｅａｖｅｓ，ｓｔｅｍｓ，ｆｌｏｗｅｒｓ，ｐｅｒｉｃａｒｐｓ　ａｎｄ　ｔｅｎｄｒｉｌｓ）．
【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＯＲＦ　ｗａｓ　１　３７７ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ　４５８ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．
Ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｗａｓ　５０．４８ｋｕ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｐｏｉｎｔ　ｗａｓ　８．７３．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｄｏｍａｉｎｓ　ａｎａｌｙ－
ｓｉｓ　ｏｆ　ＶｑＡＰｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　ＶｑＡＰｈａｄ　ｔｗｏ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ａｓｐａｒｔｉｃ
ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　Ａｓｐ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（ＤＴ／ＳＧ）ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｔｗｏ　ｄｏｍａｉｎｓ　ａｎｄ　ｉｔ　ｗａｓ　ａｔｙｐｉｃａｌ　ａｓｐａｒｔｉｃ　ｐｒｏｔｅ－
ａｓｅｓ　ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ　ｔｏ　ｃｌａｎ　Ａ１ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ａｓｐａｒｔｉｃ　ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ．ＱＲＴ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＶｑＡＰｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｘ　ｈｏｕｒｓ　ｌａｔｅｒ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｕ．ｎｅｃａｔｏｒ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｍａｙ　ｂｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ａｔ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｔ
ｍａｙ　ｂｅ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｓｏｍｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＶｑＡＰｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ｌｅａｖ－
ｅｓ，ｓｔｅｍｓ，ｆｌｏｗｅｒｓ，ｐｅｒｉｃａｒｐｓ　ａｎｄ　ｔｅｎｄｒｉｌｓ　ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｔｉｓｓｕｅｓ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】ＶｑＡＰ ｗａｓ　ａ　ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｉｔ　ｗａｓ　ｒｅｇｕｌａ－
ｔｅｄ　ｂｙ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｉｔ　ｍａｙ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｇｒａｐｅ　ｐａｔｈｏ－
ｇｅｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｌｄ　Ｖｉｔｉｓ　ｑｕｉｎｑｕａｎｇｕｌａｒｉｓ；ａｓｐａｒｔｉｃ　ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＡＰ）；ＶｑＡＰｇｅｎｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ
　　天冬氨酸蛋白酶（Ａｓｐａｒｔｉｃ　ｐｒｏｔｅａｓｅ，ＡＰ，Ｅ．Ｃ．
３．４．２３）是生物体中４种主要蛋白酶类之一，在动
物、植物、真菌和病毒中有着不同的生理功能［１－３］。
根据Ｂａｒｒｅｔｔ和Ｒａｗｌｉｎｇｓ所发明的 ＭＥＲＯＰＳ数据
库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｒｏｐｓ．ａｃ．ｕｋｑ）［４］，基于 ＡＰｓ的
氨基酸同源序列，可以将其分为１４个不同家族。根
据三维结构和进化关系，又可以将ＡＰｓ分为６个不
同的宗族。植物 ＡＰｓ主要分布在 ＡＡ 宗族中的
Ａ１、Ａ３、Ａ１１和Ａ１２家族以及ＡＤ宗族中的Ａ２２家
族［３］。大多数植物ＡＰｓ都属于Ａ１家族。与Ａ１家
族的其他成员一样，植物 ＡＰｓ在酸性条件下有活
性，且被胃蛋白酶特异性抑制，并且有２个催化活性
必需的天冬氨酸残基。根据植物ＡＰｓ的结构特征，
又可将其分为３大类：典型的天冬氨酸蛋白酶、ｎｕ－
ｃｅｌｉｎ－ｌｉｋｅ的天冬氨酸蛋白酶和非典型的天冬氨酸
蛋白酶［５］。典型的天冬氨酸蛋白酶的前体结构中包
含了１个被称作植物特异插入（ＰＳＩ）的额外的蛋白
域，其大小为５０～１００个氨基酸，这个结构域为植物
所特有，与动物和微生物中的 ＡＰｓ没有任何同源
性，但与ｓａｐｏｓｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［１］有高度的相似性，它
会在植物ＡＰｓ的成熟过程中被去除。ｎｕｃｅｌｉｎ－ｌｉｋｅ
ＡＰｓ可以编码１种类似于在大麦核细胞中检测到的
ｎｕｃｅｌｉｎ蛋白［６］。非典型的天冬氨酸蛋白酶的特征
介于前两者之间。
研究证明，植物ＡＰｓ参与了不同植物器官中蛋
白的合成与降解，植物胁迫、衰老、细胞繁殖以及程
序性死亡等过程［３］。拟南芥 （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉ－
ａｎａ）ＰＣＳ１编码的天冬氨酸蛋白酶在细胞的胚胎
发育和繁殖过程中起决定作用［７］。小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ
ａｅｓｔｉｖｕｍ）种子中的２个天冬氨酸蛋白酶 ＷＡＰ１和
ＷＡＰ２，参与了种子萌发中储存蛋白的水解过程和
种子成熟的胚胎发育过程［８］。烟草叶绿体ＣＮＤ４１
编码的天冬氨酸蛋白酶的积累与核酮糖二磷酸羧化
酶及光系统Ⅱ中ＱＢ蛋白的积累呈负相关［９］。豇豆
ＶｕＡＰ１在细胞衰老过程中大量积累，可能参与了细
胞衰老过程［１０］。迄今为止，已有很多研究表明，植
物天冬氨酸蛋白酶还参与了植物抵御多种病原菌侵
染的应激反应。Ｓｃｈａｌｅｒ和Ｒｙａｎ［１１］研究发现，当番
茄叶片受到伤害或用茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）处理叶片
时，ＡＰ基因均被诱导表达，这可能是由于番茄 ＡＰ
参与了植物胞间蛋白循环作用，其通过增加氨基酸
数量来合成特异的抗病相关蛋白以及水解入侵病原
菌所分泌的蛋白，从而使植株对病原菌产生抗性。
马铃薯叶片中的ＡＰ也被证实对病原菌和有害昆虫
具有抗性［１２－１３］。Ｘｉａ等［１４］报道，当植物受到病原菌
侵染时，由ｎｕｃｅｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ＡＰ基因编码的天冬氨酸蛋
白酶含量不断增加，证明这种 ＡＰ可能通过产生１
个信号肽来激活抗性。
关于植物 ＡＰ 的研究在水稻、拟南芥中较
多［１５－１６］，而有关葡萄 ＡＰ的研究却鲜有报道。本研
究以中国野生毛葡萄品种“商－２４”为材料，在前期利
用抑制消减杂交技术（ＳＳＨ）获得的ＡＰ 基因ＥＳＴ
２０１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
序列的基础上，克隆其ｃＤＮＡ序列，对其进行序列
分析；并对ＡＰ基因在白粉菌液诱导不同时间、不同
激素刺激（水杨酸（ＳＡ）、乙烯（Ｅｔｈ）和茉莉酸甲酯
（ＭｅＪＡ））及不同组织（嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须）
中的表达特点进行分析，以期明确ＡＰ基因在葡萄
抗病防御机制中的作用。
１　材料与方法
１．１　材料与处理
供试品种高抗葡萄白粉病的中国野生毛葡萄品
种“商－２４”，取自西北农林科技大学葡萄种质资源
圃。选取感染白粉病的欧洲葡萄品种“佳利酿”叶
片，用压片法接种该病原菌于正常生长的“商－２４”，
分别于接种后０，６，１２，２４，４８，７２，９６和１２０ｈ取样，
同时设未接种病原菌的“商－２４”幼叶为对照，叶片采
摘后迅速置于液氮罐中带回实验室，于－８０℃冻
存。
将水杨酸 ＳＡ （１００μｍｏｌ／Ｌ）、乙烯 Ｅｔｈ（５０
μｍｏｌ／Ｌ）和茉莉酸甲酯 ＭｅＪＡ（０．５ｇ／Ｌ）３种激素溶
液，分别用喷壶均匀喷洒于正常生长的“商－２４”叶片
表面，同时以喷蒸馏水为对照，分别于喷洒后０，
０．５，１，３，６，１２，２４及４８ｈ采样，将采集的叶片迅速
放入液氮罐中带回实验室，于－８０℃冻存。
采集正常生长的中国野生毛葡萄“商－２４”嫩叶、
嫩茎、花、果皮、卷须等组织，迅速置于液氮罐中带回
实验室，于－８０℃冻存。
１．２　总ＲＮＡ的提取与ｃＤＮＡ第１链的合成
葡萄叶片总ＲＮＡ的提取参照张今今等［１７］的改
良ＳＤＳ酚法，ＲＮＡ的纯化参照王西平［１８］的方法进
行。取葡萄叶片总ＲＮＡ　１μＬ（１μｇ／μＬ），１０ｇ／Ｌ琼
脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 的完整性。其中用于
ＲＴ－ＰＣＲ技术的第１链ｃＤＮＡ的合成按照ＴａＫａＲａ
公司的反转录试剂盒进行。
１．３　中国野生毛葡萄ＡＰ基因的克隆
以前期获得的中国野生毛葡萄“商－２４”ＳＳＨ 文
库中的ＥＳＴ序列为探针，对ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋ中的欧
洲葡萄（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）的ｄｂＥＳＴ数据库进行Ｂｌａｓｔ
分析，获得与信息探针一致的基因序列。根据该序
列的开放阅读框，用Ｐｒｉｍｅｒ　５．０软件设计引物（ＡＰ－
Ｆ１：５′－ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＴＴＴＴＡＣＴＡＣＴＴＴ－
ＧＣＴ－３′，ＡＰ－Ｒ１：５′－ＧＧＴＡＣＣＣＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴ－
ＧＴＴＧＴＣＧＧ－３′），以白粉菌诱导６ｈ的中国野生毛
葡萄叶片ｃＤＮＡ第１链为模板进行ＰＣＲ。ＰＣＲ扩
增体系：模板１μＬ，１０×Ｔａｑ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５
μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１．５μＬ，上、下游引物（１０
μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，Ｔａｑ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．３μＬ，无菌水
补足至２５μＬ。扩增程序为：９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０
ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃６０ｓ，２５个循环；７２℃５ｍｉｎ，４
℃保存。将ＰＣＲ产物在１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶中电泳
检测，凝胶成像分析系统进行拍照及分析。采用
Ｏｍｅｇａ公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目的片
段，并将纯化的片段连接到ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ载体上
进行克隆测序。
１．４　ＶｑＡＰ 基因序列的分析
将获得的序列用 Ｂｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．
ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）程序在 ＮＣＢＩ网站上进行
同源性比对，验证基因的完整性，同时进行保守结构
域分析。用ＰｒｏｔＰａｒａｍ 程序预测克隆基因编码蛋
白质 的 一 级 结 构、分 子 质 量 和 等 电 点。利 用
ＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｈｔｔｐ：／／ａｌｉｇｎ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）
在线分析软件构建不同物种的ＡＰ基因，并进行进
化树分析。
１．５　ＶｑＡＰ 基因的表达分析
根据ＶｑＡＰ 的ｃＤＮＡ序列设计定量ＰＣＲ引物
（ＡＰ－Ｆ２：５′－ＧＧＡＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＴＴＴ－３′，
ＡＰ－Ｒ２：５′－ＣＴＣＴＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＡＣＴＣＣＴ－３′）。分别
取不同诱导时间（０，６，１２，２４，４８，７２，９６和１２０ｈ）的
叶片组织总ＲＮＡ各１μｇ为模板，反转录成ｃＤＮＡ，
ｃＤＮＡ 合成按照 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＴＭ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ
（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）的说明书操作。利用荧光染料
法进行荧光定量 ＰＣＲ 反应，以葡萄 Ａｃｔｉｎ 基因
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＡＹ６８０７０１）作为内参，其引物为
Ａｃｔｉｎ－Ｆ：５′－ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　ＧＴＧ
ＡＧＴ－３′和 Ａｃｔｉｎ－Ｒ：５′－ＧＡＣ　ＡＡＴ　ＴＴＣ　ＣＣＧ　ＴＴＣ
ＡＧＣ　ＡＧＴ－３′。采用２０μＬ　ＰＣＲ反应体系：１０μＬ
２×ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍｉｘ，１μＬ　ｃＤＮＡ，上、下游引物（１０
μｍｏｌ／Ｌ）各０．８μＬ，补无菌水至总体积２０μＬ。
ＰＣＲ反应程序为９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，６０℃３０
ｓ，７２℃６０ｓ，４０个循环；７２℃５ｍｉｎ，４℃保存。操
作步骤参照ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ
Ｔｉｍｅ）（ＴａＫａＲａ公司）的操作说明书进行，每个样品
设３次重复。通过 ＡＢＩ　７５００Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ的ＳＤＳＳｈｅｌ．ｅｘｅ分析系统，分析ＶｑＡＰ 基
因在病原菌诱导处理时的相对表达量。不同激素诱
导处理时ＶｑＡＰ 基因的相对表达量方法同上。
１．６　ＶｑＡＰ 基因在毛葡萄“商－２４”不同组织中的表
达分析
　　以１．５中的 ＡＰ－Ｆ２和 ＡＰ－Ｒ２引物为条件，取
３０１第２期 牛　姣，等：中国野生毛葡萄白粉菌诱导响应ＶｑＡＰ 基因的克隆及表达分析
中国野生毛葡萄“商－２４”的嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷
须等不同组织总ＲＮＡ各１μｇ作为模板，反转录成
ｃＤＮＡ，ｃＤＮＡ合成按照ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＴＭ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ
Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）的说明书操作。以１．５中
葡萄Ａｃｔｉｎ基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＡＹ６８０７０１）作为
内参进行校正。采用２０μＬ　ＰＣＲ反应体系：９．８μＬ
ＰＣＲ　Ｍｉｘ，１μＬ　ｃＤＮＡ，上、下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各
０．８μＬ，补无菌水至总体积２０μＬ。ＰＣＲ反应程序
为：９４℃３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，
２５个循环；７２℃５ｍｉｎ，４℃保存。
２　结果与分析
２．１　中国野生毛葡萄ＡＰ基因的克隆及序列分析
根据前期获得的中国野生毛葡萄 ＡＰ 基因
ＥＳＴ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＪＫ２６６８７６），在 ＮＣＢＩ
葡萄ｄｂＥＳＴ数据库进行Ｂｌａｓｔ比对分析，选择与该
ＥＳＴ序列一致的欧洲葡萄“黑比诺”的ＡＰ 基因序
列，设计特异ＰＣＲ引物，以白粉菌诱导６ｈ的中国
野生毛葡萄叶片ｃＤＮＡ为模板，采用 ＲＴ－ＰＣＲ，获
得１条约１　４００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段。测序结果表明，
该序列长度为１　３７７ｂｐ，具有完整的开放阅读框，编
码４５８个氨基酸残基（图１），编码蛋白的相对分子
质量为５０．４８ｋｕ，等电点为８．７３，命名为ＶｑＡＰ。
多重比对分析显示，ＶｑＡＰ 与其他植物中ＡＰ 基因
的相似性低于４１％，其中与拟南芥（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）
ＡＰ基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＮＰ＿５６６９６６．１）的相似
性最高，为４１％，与紫茉莉（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ　ｊａｌａｐａ）ＡＰ
基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＡＣＬ８１１６５．１）的相似性最
低，为２９％（图２和图３）。图２表明，ＶｑＡＰ 编码产
物含有２个保守的具有催化活性的天冬氨酸残基，
位于Ａｓｐ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ－Ｇｌｙ（ＤＴ／ＳＧ）这２个结构域，该
基因编码的氨基酸序列属于天冬氨酸蛋白酶 Ａ１家
族，为非典型的天冬氨酸蛋白酶。
图１　中国野生毛葡萄“商－２４”ＡＰ基因的开放阅读框及其编码的氨基酸序列
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ＯＲＦ　ｏｆ　ＶｑＡＰａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
４０１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
图２　不同植物ＡＰ基因氨基酸序列的多重比较
ＲｃＡＰ（ＸＰ＿００２５２３８６９．１）、ＺｍＡＰ（ＮＰ＿００１１４７０２２．１）、ＡｔＡＰ（ＮＰ＿５６６９６６．１）、ＡｌＡＰ（ＸＰ＿００２８７７８６７．１）、
ＦｅＡＰ（ＡＡＳ４８５１０．２）、ＭｊＡＰ（ＡＣＬ８１１６５．１）、ＮａＡＰ（ＢＡＦ９８９１５．１）分别代表蓖麻、玉米、拟南芥、
拟南芥Ｌｙｒａｔａ亚种、荞麦、紫茉莉、猪笼草中的天冬氨酸蛋白酶。图３同
Ｆｉｇ．２　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＡＰｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｌａｎｔｓ
ＲｃＡＰ（ＸＰ＿００２５２３８６９．１），ＺｍＡＰ（ＮＰ＿００１１４７０２２．１），ＡｔＡＰ（ＮＰ＿５６６９６６．１），ＡｌＡＰ（ＸＰ＿００２８７７８６７．１），ＦｅＡＰ（ＡＡＳ４８５１０．２），
ＭｊＡＰ（ＡＣＬ８１１６５．１），ＮａＡＰ（ＢＡＦ９８９１５．１）ｓｔａｎｄ　ｆｏｒ　ａｓｐａｒｔｉｃ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｆｒｏｍＲｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ，Ｚｅａ　ｍａｙｓ，Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ，
Ａ．ｌｙｒａｔａ　ｓｕｂｓｐ．Ｌｙｒａｔａ，Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ，Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ　ｊａｌａｐａ，Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ　ａｌａｔａ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　Ｆｉｇ．３
５０１第２期 牛　姣，等：中国野生毛葡萄白粉菌诱导响应ＶｑＡＰ 基因的克隆及表达分析
图３　不同植物ＡＰ基因氨基酸序列的同源进化树分析
Ｆｉｇ．３　Ｐｈｙｏｌｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＡＰｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｌａｎｔｓ
２．２　白粉菌诱导后抗病葡萄“商－２４”中ＶｑＡＰ 基因
的表达分析
　　高抗葡萄白粉病的中国野生毛葡萄“商－２４”接
种白粉菌后，ＶｑＡＰ基因表达分析结果（图４）表明，
接菌后６ｈＶｑＡＰ 基因表达量为０ｈ的６倍多，之后
迅速下调。这可能是因为在接种６ｈ后，ＡＰ开始参
与病程相关蛋白的降解过程，调控这些胁迫诱导蛋
白的生物功能，从而抵抗病害的侵染。
２．３　不同激素处理后抗病葡萄“商－２４”中ＶｑＡＰ 基
因的表达分析
　　实时定量结果（图５）表明，ＳＡ、Ｅｔｈ、ＭｅＪＡ　３种
激素均能调节ＶｑＡＰ 基因的表达，呈现出先上升后
下调的表达趋势，且以ＳＡ处理的变化最明显，在处
理１２ｈ后表达量达到０ｈ的３５倍，ＭｅＪＡ处理３ｈ
后，诱导表达最高，为０ｈ的５倍多，而Ｅｔｈ处理６ｈ
达到０ｈ的１０倍多。可见水杨酸、乙烯和茉莉酸甲
酯３种激素刺激均能诱导ＡＰ基因的表达。
２．４　ＶｑＡＰ 基因在葡萄不同组织中的表达分析
半定量ＰＣＲ结果（图６）表明，ＶｑＡＰ 基因在嫩
叶、嫩茎、花、果皮、卷须５个不同组织中均呈组成型
表达，但表达量各不相同，以在嫩茎中的表达量最
高，在果皮中表达量很弱。这可能与其参与不同组
织蛋白的合成与代谢有关。
图４　接种白粉菌后抗病毛葡萄“商－２４”中
ＶｑＡＰ 基因的表达分析
Ｆｉｇ．４　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＶｑＡＰｇｅｎｅ　ｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ
ｌｉｎｅ‘Ｓｈａｎｇ－２４’ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　Ｕｎｃｉｎｕｌａ　ｎｅｃｔｏｒ
图５　不同激素处理后抗病毛葡萄“商－２４”中
ＶｑＡＰ 基因的表达分析
Ｆｉｇ．５　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ＶｑＡＰｇｅｎｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ
Ｅｔｈ，ＳＡ，ａｎｄ　ＭｅＪＡ　ｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｌｉｎｅ“Ｓｈａｎｇ－２４”
图６　ＶｑＡＰ 基因在毛葡萄“商－２４”
不同组织中的表达分析
Ｆｉｇ．６　Ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＶｑＡＰｉｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｆｒｏｍＶ．ｑｕｉｎｑｕａｎｇｕｌａｒｉｓ　ｃｌｏｎｅ“Ｓｈａｎｇ－２４”
３　讨　论
本试验克隆得到了具有完整开放阅读框的天冬
氨酸蛋白酶基因ＶｑＡＰ，ＶｑＡＰ 基因编码产物具有
多数天冬氨酸蛋白酶类都含有的２个保守的天冬氨
酸残基，该基因编码的氨基酸序列为第３类非典型
的天冬氨酸蛋白酶，即 Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓｉｎ－ＡＰ。目前，关
于第３类中ＡＰ的生物功能尚无明确界定。研究发
现，拟南芥中ＣＤＲ１（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
１）参与抗病信号途径［１４］；Ｐｒａｓａｄ等［１９－２０］研究发现，
水稻中编码天冬氨酸蛋白酶的ＯｓＣＤＲ１基因能够
诱导植物系统抗性反应的发生。ＰＣＳ１蛋白被认为
参与植物胚细胞的发育与再生［７］。烟草中的天冬氨
酸蛋白酶ＮｔＣＮＤ４１被证明与叶绿体的ＤＮＡ结合
和蛋白活性相关［９］。
６０１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
为了明确ＶｑＡＰ 基因是否受白粉病侵染的诱
导，本研究利用实时荧光定量 ＰＣＲ技术，分析接种
白粉病菌后不同时间ＶｑＡＰ 基因在转录水平上的
表达变化，结果表明，接种白粉菌后６ｈ，ＶｑＡＰ 基因
的表达量为０ｈ的６倍多，之后迅速下调，这表明病
原菌侵染后，ＶｑＡＰ 基因被诱导表达。Ｒｏｄｒｉｇｏ
等［２１－２２］研究也发现，番茄叶片和烟草叶片分别受柑
橘裂皮类病毒（ＣＥＶ）和烟草花叶病毒（ＴＭＶ）侵染
时，其ＡＰ基因被诱导表达，这可能是由于ＡＰ通过
参与病程相关蛋白的降解过程，调控这些胁迫诱导
蛋白的生物功能，从而抵抗病害的侵染。有研究表
明，茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）、水杨酸（ＳＡ）和乙烯（Ｅｔｈ）
等信号分子也参与了天冬氨酸蛋白酶介导的抗性诱
导反应［１４］。本试验结果表明，茉莉酸甲酯（ＭｅＪＡ）、
水杨酸（ＳＡ）和乙烯（Ｅｔｈ）均能诱导ＶｑＡＰ 的表达，
且以ＳＡ诱导最为明显，这可能是由于ＶｑＡＰ 参与
了ＳＡ诱导植物产生的系统获得性抗性中蛋白基因
的表达过程，进而调节植物的抗病反应。ＭｅＪＡ处
理后ＶｑＡＰ 基因表达先上调后下调，推测ＶｑＡＰ可
能参与了胞间蛋白循环以增加氨基酸数量，用来合
成特异的病程相关蛋白并水解入侵病原菌所分泌的
蛋白，从而对病原菌产生抗性。乙烯既是衰老调控
的重要调节因子，又能调控下游防卫基因的表达，乙
烯处理下ＶｑＡＰ 基因的诱导表达是参与了植物防
卫反应还是启动了衰老进程的表达，抑或是这２种
途径的重叠，这仍需进一步验证。本研究结果表明，
ＶｑＡＰ 基因在中国野生毛葡萄“商－２４”不同组织中
表现出差异性表达，这可能与其参与了植物不同组
织中各个功能蛋白的合成与降解有关。
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（下转第１１６页）
７０１第２期 牛　姣，等：中国野生毛葡萄白粉菌诱导响应ＶｑＡＰ 基因的克隆及表达分析
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ｅｎｅｒｇｙ－ｓａｖｉｎｇ　ｓｏｌａｒ　ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ　ｉｎ　Ｌｉａｏｎｉｎｇ　ｐｒｏｖｉｎｃｅ［Ｊ］．Ｌｉａ－
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ｂｒｉｃｋ－ｃｌａｙ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｗａｌ　ｈｅａｔ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｏｌａｒ
ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ　ｉｎ　Ｎｉｎｇｘｉａ　ａｒｉｄ－ｓａｎｄｓｔｏｒｍ　ａｒｅａ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌ－
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Ｇｕｏ　Ｊ　Ｑ，Ｗａｎｇ　Ｘ　Ｊ，Ｗｅｉ　Ｃ　Ｚ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｍｐａｃｔｓ　ｏｆ　ｌｉｇｈｔ－ｔｅｍｐｅｒａ－
ｔｕｒｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍａｔｕｒｉｔｙ　ｆｒｕｉｔ　ｓｅｔｔｉｎｇ　ｏｎ　ｔｏｍａｔｏ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
ｑｕａｌｉｔｙ　ｉｎ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｏｍｅｔｅｏｒｏｌｏｇｙ，
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Ｇｕｏ　Ｊ　Ｐ，Ｇａｏ　Ｓ　Ｈ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ＣＯ２
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｃｏ－
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２００２，１０（１）：１７－２０．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ

）
（上接第１０７页）
［１９］　Ｐｒａｓａｄ　Ｂ　Ｄ，Ｃｒｅｉｓｓｅｎ　Ｇ，Ｌａｍｂ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ
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［２０］　Ｐｒａｓａｄ　Ｂ　Ｄ，Ｃｒｅｉｓｓｅｎ　Ｇ，Ｌａｍｂ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓ－
ｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＯｓＣＤＲ１，ａ　ｒｉｃｅ　ａｓ－
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ｃｏ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｍｅｃｈａ－
ｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ
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６１１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷