全 文 ：果树学报 2016，33（2）: 137-147
Journal of Fruit Science
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.20150281
野生毛葡萄芪合成酶基因双向启动子活性分析
和 静 1，2，3，李瑞民 1，2，3，王跃进 1，2，3*
（1西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100；2旱区作物逆境生物学国家重点试验室，陕西杨凌 712100；
3农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点试验室，陕西杨凌 712100）
摘要：【目的】研究中国野生毛葡萄‘丹凤-2’（Vitis quinquangularis‘Danfeng-2’）芪合成酶（stilbene synthase）基因双向
启动子的启动活性与差异。【方法】通过染色体步移技术克隆中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因双向启动子，并与
UidA基因（β-葡萄糖苷酶基因，GUS）融合，利用真空渗透法在葡萄叶片中瞬时表达，组织化学染色和GUS蛋白定量法
分别检测白粉菌接种、温度处理、茉莉酸甲酯、脱落酸和水杨酸处理对双向启动子活性的影响。以毛葡萄‘丹凤-2’和
欧洲葡萄‘赤霞珠’不同成熟时期果实的 cDNA为模板，通过荧光实时定量 PCR的方法分析 VqSTS12/VvSTS31和
VqSTS33/VvSTS32的表达情况。【结果】PvqDSTS12受到白粉菌、茉莉酸甲酯、高温和低温的诱导后，启动活性增强，对水
杨酸和脱落酸处理不敏感；PvqDSTS33在茉莉酸甲酯处理下启动活性增强，在高温和低温的处理下启动活性降低，对
水杨酸、脱落酸和白粉病处理不敏感。荧光实时定量PCR结果显示，在果实发育的6个时期中，‘丹凤-2’VqSTS12和
VqSTS33的表达量均高于‘赤霞珠’VvSTS31和VvSTS32。4个基因的基本表达趋势为：浆果转色期之前持续增长，转色
后期下降，浆果半熟期达到最高峰，浆果成熟期表达降低。其中毛葡萄‘丹凤-2’VqSTS12的表达量在转色后期并未降
低且增加到上一时期的2.3倍；欧洲葡萄VvSTS32基因在成熟期表达量升高为前一时期的1.42倍。【结论】双向启动子
活性的研究为利用植物天然双向启动子提供依据。
关键词：中国野生毛葡萄；芪合成酶；双向启动子；GUS
中图分类号：S663.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980(2016)02-0137-11
Expression analysis of the bidirectional promoter of the stilbene synthase
gene from the Chinese wild Vitis quinquangularis
HE Jing1，2，3，LI Ruimin1，2，3，WANG Yuejin1，2，3*
(1College of Horticulture，Northwest A&F University，Yangling 712100，Shaanxi，China；2State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Ar⁃
id Areas，Yangling 712100，Shaanxi，China；3Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Ministry of Agri⁃
culture，Yangling 712100，Shaanxi，China)
Abstract:【Objective】To learn of the activities and differences of bidirectional stilbene synthase promot⁃
ers from the Chinese wild V. quinquangularis‘Danfeng-2’. As the position of the 48 genes of the stilbene
synthase family from V. vinifera has been reported，we analyzed and found that the stilbene synthase
genes VvSTS31 and VvSTS32 space 1 737 bp，and started expressing in the opposite direction. We noted
that the sequence between these two genes is a bidirectional promoter. As China is one of the original ar⁃
eas for the grape，it is filled with extensive resistance germplasm resources. Among them，V. quinquangu⁃
laris‘Danfeng-2’not only has good resistance，but also a high content of resveratrol. Since the genomic
DNA sequences of Chinese wild V. quinquangularis have a high degree of similarity with V. vinifera，pro⁃
moters，cloning of bidirectional stilbene synthase from Chinese wild V. quinquangularis‘Danfeng-2’can
provide a novel resistance gene resource for the grapes.【Methods】Bidirectional stilbene synthase promot⁃
ers from wild V. quinquangularis‘Danfeng-2’were cloned by genome walking. The sequences of bidirec⁃
tional stilbene synthase promoters from‘Danfeng-2’were submitted to the promoter prediction website
收稿日期：2015-06-25 接受日期: 2015-11-17
基金项目：国家自然科学基金（No.31372039）
作者简介：和静，女，硕士，主要从事果树育种及生物技术研究。Tel: 15981887590，E-mail: hj19910101@163.com
􀆽通信作者 Author for correspondence. Tel: 029-87082522, E-mail: wangyj@nwsuaf.edu.cn
果 树 学 报 第33卷
PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，and the corresponding cis-act⁃
ing elements were obtained and marked on the sequences. In order to analyze the promoter activity of bidi⁃
rectional stilbene synthase promoters，they were fused with a UidA gene (β-glucuronidase，GUS). Recom⁃
binant plasmid PvqDSTS31::GUS and PvqDSTS32::GUS were transient transformed into grape leaves us⁃
ing Agrobacterium-mediated vacuum infiltration. The expression patterns of GUS in grape leaves under
different stress treatments，including powdery mildew，high temperature，low temperature，MeJA，ABA
and SA，were analyzed using histochemical staining and GUS quantification. Treatment of the biotic and
abiotic stresses were conducted as follows: (1) Powdery mildew treatment: grape powdery mildew were in⁃
oculated from infected leaves to test leaves which were infiltrated after 48 h using the friction extrusion
method，and then placed in an illumination incubator for 24 h. (2) Salicylic acid (SA) treatment: grape
leaves in vitro infiltrated after 48 hours were sprayed with 1 mmol·L-1 SA solution，and afterwards were
incubated in the same conditions as the powdery mildew treatment. (3) Methyl jasmonic (MeJA) acid treat⁃
ment: 100 μmol·L-1 MeJA solution prepared by 10 mmol·L-1 MES solution using the culture method was
the same as above. (4) Abscisic acid (ABA) treatment: the treatment concentration of ABA is 100 μmol·L-1.
(5) Low temperature (or high temperature): the grape leaves in vitro infiltrated in Agrobacterium liquid af⁃
ter 48 h at room temperature were transferred to a 4 ℃ (or 40 ℃) incubator for 24 h. In order to under⁃
stand the gene expression promoted by bidirectional stilbene synthase promoters，the fruit cDNA of differ⁃
ent mature periods from V. quinquangularis‘Danfeng- 2’and V. vinifera‘Cabernet Sauvignon’were
used as templates. The expression of VqSTS12/VvSTS31 and VqSTS33/VvSTS32 were analyzed by using
the quantitative real-time PCR method.【Results】In order to understand the homologous sequences of V.
vinifera bidirectional stilbene synthase promoters in the transcription initiation of VvSTS31 and VvSTS32
in V. quinquangularis‘Danfeng-2’，the sequences of VvSTS31 and VvSTS32 were blasted in NCBI. The
results showed that the homologous sequence of VvSTS31 was VqSTS12 (Genbank accession No.
JQ868686) with a similarity rate of 98.47%; the homologous sequence of VvSTS32 was VqSTS33 (Genbank
accession No. JQ JQ868665) with a similarity rate of 92.71%. Predictive analysis of the bidirectional stil⁃
bene synthase promoters from‘Danfeng-2’was made on the promoter prediction website PlantCARE.
From the cis-acting elements，promoters contained many regulatory elements associated with stress-in⁃
ducible，wherein，Box-W1 is a fungal elicitor responsive element in Petroselinum crispum; TGACG-mo⁃
tif is a cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness of Hordeum vulgare; ABRE is
a cis-acting element involved in the ABA responsiveness of Arabidopsis thaliana and Oryza sativa; MBS is
a MYB binding site involved in drought-inducibility in A. thaliana，acting on the binding of MYB tran⁃
scription factors and DNA; GCN4_motif and Skn-1_motif are required for endosperm expression; SORLIP
responds to light; and SITEIIATCYTC is involved in cell DNA polymerization. Predictive analysis results
showed that“Danfeng-2”stilbene synthase gene bidirectional promoter may have an important role in the
defensive reaction to various stresses. By comparing the bidirectional stilbene synthase promoter of three
V. quinquangularis lines‘Danfeng-2’‘83-4-96’and‘Shang-24’as well as three V. vinifera varieties
‘Cabernet Sauvignon’‘Chardonnay’and‘Riesling’，we found that the bidirectional promoter sequence
of V. quinquangularis is 491 bp shorter than V. vinifera. By removing the missing 491 bp，the other se⁃
quence similarity rate is 98.81%. At the six development periods of grape fruits，VqSTS12 and VqSTS33
started by bidirectional stilbene synthase promoter of‘Danfeng-2’had a higher expression level than
VvSTS31 and VvSTS32 which were started by the bidirectional stilbene synthase promoter of‘Cabernet
Sauvignon’. The basic expression trends of the four genes are: Before the turning-color period of the ber⁃
ries，the expression of the four genes increased sustainedly until late veraison，after a dropping period，
the gene expression reached a peak at the half- ripe stage with berries with inter mediate Brix values，
138
第2期
葡萄（Vitis L.）是多年生浆果类果树，有很高的
经济学和生物学效益。芪合成酶（stilbene synthase）
是苯丙氨酸途径中的催化合成白藜芦醇的关键
酶 [1]。白藜芦醇（resveratrol）作为植物中抵御真菌的
植保素，对人体健康也有重要的医疗保健作用[2]。我
国野生葡萄资源十分丰富，其中野生毛葡萄‘丹凤-
2’不仅抗病性强，且白藜芦醇含量高[3]，研究其芪合
成酶基因的表达模式对改良欧洲葡萄品种抗病性有
重要的参考价值。
双向启动子（bidirectional promoter）是指同时启
动2个转录起始方向相反的旁侧基因共同表达的一
段核苷酸序列。植物中双向启动子的首次发现是欧
洲油菜（Brassica napus）种子特异油质蛋白基因（ole⁃
osin）872 bp的启动子，其启动子下游链上的大量开
放阅读框编码了类似番茄E4基因有关乙烯诱导的
多肽，且2个方向的启动分别受到不同激素（脱落酸/
乙烯）的调控[4]。在植物中，双向启动子的研究较少，
目前已报道的有拟南芥[5]、杨树[6]、欧洲油菜[7]、辣椒[8]、
甜瓜[9]等。Dhadi等[10]通过分析水稻（Oryza sativa）、拟
南芥（Arabidopsis thaliana）和杨树（Populus trichocar⁃
pa）双向启动子序列信息，发现3个较有代表性的顺
式作用元件：（1）SORLIP，在拟南芥光诱导启动子
phyA中发现，参与 phyA响应转录；（2）SITEIIAT⁃
CYTC，在分生组织中参与PCNA（proliferating cell nu⁃
clear antigen）的转录和细胞 DNA聚合；（3）UP1AT⁃
MSD，有关腋芽生长。双向启动子中TATA盒的含量
较少，但具有较高的GC含量[11]。Mitra等[5]在拟南芥
cab1和 cab2基因间发现天然双向启动子，其可在洋
葱表皮细胞和转基因烟草植株中同时启动2个报告
基因GUS和GFP的表达且2个方向的转录活性强度
相同，每个转录方向上最靠近基因的上游序列单独
控制转录；同时还发现报告基因只在叶片和茎中表
达，不在根中表达，这一结果正如预期所想，该双向
启动子还控制拟南芥2个光合作用基因的表达。拟
南芥基因组 1号染色体上AtClpB-C和AtCK2基因间
有 1 kb双向启动子[12]，其含有 4个热休克元件，分别
连接报告基因GUS和GFP后，在热处理后 2个方向
的表达活性均增强。将甜瓜品种‘日本甜宝’的双向
启动子DP连入CaMV 35S下游构成双启动子，在黄
瓜叶片、茎、果实和烟草叶片、茎中瞬时转化发现均
有比单独使用CaMV 35S启动子更高的转录水平；但
均低于单独使用双向启动子[9]。
除在植物中，目前多种双向病毒启动子活性也
被鉴定，且位于互补链的反向启动子活性通常高于
病毒链[13-15]。丁家波[16]发现马立克氏病病毒 pp38基
因与另一个与肿瘤相关的 1.8 kb mRNA家族转录因
和 静，等:野生毛葡萄芪合成酶基因双向启动子活性分析
then continued to decrease during the berry ripening period. The only exceptions were that the VqSTS12
of the‘Danfeng-2’didn’t reduce at late veraison and the VqSTS33 of the‘Cabernet Sauvignon’didn’t
reduce during the berry ripening period. To study the promoter activity，the GUS gene was fused to the 3’
end sequences of the bidirectional promoter. Histochemical staining and fluorescent quantitation analysis
of the GUS gene were conducted. The results showed that PvqDSTS12 was positively regulated by the pow⁃
dery mildew incubation，MeJA，and heat and cold stress，but had no significant changes in response to
SA and ABA. We found that PvqDSTS33 was positively regulated by MeJA and negatively regulated by
heat and cold stress，and was insensitive to powdery mildew incubation，SA and ABA.【Conclusion】Re⁃
al- time PCR results showed that，VqSTS12 and VqSTS33 started by the bidirectional stilbene synthase
promoter of‘Danfeng-2’had higher expression levels than VvSTS31 and VvSTS32 started by the bidirec⁃
tional stilbene synthase promoter of‘Cabernet Sauvignon’. We also noted that the VqSTS12/VvSTS31 and
VqSTS33/VvSTS32 basic expression trends at six development periods increased sustainedly before the
berries turned color until late veraison，After falling，the gene expression reached a peak，then contin⁃
ued to decrease during the berry ripening period. However，the VqSTS12 of‘Danfeng-2’didn’t reduce
at late veraison. PvqDSTS12 was positively regulated by powdery mildew incubation，MeJA，and heat
and cold stress. We found that PvqDSTS33 was positively regulated by MeJA and negatively regulated by
heat and cold stress but not affected by powdery mildew incubation. Both promoters had no significant
changes in response to SA and ABA. The research on bidirectional stilbene synthase promoter activity
sets the foundation for the use of a plant natural bidirectional promoter.
Key words: Chinese wild V. quinquangularis; Stilbene synthase; Bidirectional promoter; GUS
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果 树 学 报 第33卷
子间含有一个大小为 300 bp左右的双向启动子，且
该核苷酸序列中含有多个增强元件。该双向启动子
在体外 2个方向均具有转录活性，去除启动子部分
片段后，启动活性降低，表明该启动子的完全活性依
赖于其结构的完整性。此外，在山羊痘病毒GPV基
因组[17]、中国番茄黄花曲叶病毒和棉花曲叶病毒[15]中
也均发现了双向启动子。除了天然双向启动子，人
工构建的双向启动子也用于植物转基因，从而更加
高效、稳定和严谨地调控基因表达[18]。
目前，双向启动子在部分植物中已有研究，但在
葡萄中尚未报道。本研究对已报道的欧洲葡萄芪合
成酶家族的 48个基因位置[19]进行分析，发现欧洲葡
萄芪合成酶基因 VvSTS31与 VvSTS32的位置相隔
1 737 bp，且启动方向相反，因此基因之间的序列为
双向启动子。本研究通过染色体步移法扩增‘丹凤-
2’中的芪合成酶基因双向启动子，检测其在多种胁
迫下调控基因表达的活性，阐明时空表达模式，为进
一步利用该双向启动子奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 中国野生毛葡萄（V. quinquangu⁃
laris）‘丹凤-2’（‘Danfeng-2’）‘83-4-96’‘商-24’
（‘Shang-24’）和欧洲葡萄（V. vinifera）品种‘赤霞
珠’（‘Cabernet Sauvignon’）‘霞多丽’（‘Chardon⁃
nay’）‘雷司令’（‘Riesling’）取自西北农林科技大学
葡萄种质资源圃。
1.1.2 载体与菌株 克隆载体 pMD-19-T为 TaKa⁃
Ra公司产品，大肠杆菌感受态TOP10购自北京天根
公司。植物表达载体 pBI121 和农杆菌感受态
GV3101为本试验室保存。白粉病菌[Uncinula neca⁃
tor（Schw.）Burr.，Genbank accession No. KJ539202]新
鲜孢子采自该资源圃感病欧洲葡萄‘佳利酿’叶片。
1.1.3 酶与化学试剂 DNA Marker、限制性内切酶、
LA Taq酶、LA PCR in vitro Cloning Kit、SYBR Premix
Ex Taq II购自TakaRa公司。RevertAidTM First Strand
cDNA Synthesis Kit购自 Fermentas公司。5-溴-4-
氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）和茉莉酸甲酯
（MeJA）为 Sigma公司产品。质粒提取试剂盒、DNA
回收试剂盒和RNA提取试剂盒购自Omega Bio-Tek
公司，其他化学药品为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取 葡萄叶片基因组DNA的提
取采用CTAB法[20]，将纯化后的DNA样品置于-80 ℃
冰箱保存备用。
1.2.2 双向启动子的克隆 根据中国野生毛葡萄
‘丹凤-2’双向启动子所启动基因的序列，从第一外
显子处设计染色体步移法PCR下游引物VqSTS-R1
（5’- CCAATGTTTGGGTGCTCCTCAAGC- 3’）和
VqSTS- R2（5’- GGTAGCTGTGCCAATGGCTAGAA
C-3’），与 LA PCR in vitro Cloning Kit中提供的上游
引物C1、C2相结合，扩增上游调控序列，具体步骤参
照LA PCR in vitro Cloning Kit说明书。
1.2.3 总RNA提取 采集毛葡萄‘丹凤-2’和欧洲
葡萄‘赤霞珠’不同成熟时期（1：浆果直径7 mm，‘丹
凤-2’花后16 d，‘赤霞珠’花后21 d；2：浆果绿且硬，
‘丹凤-2’花后25 d，‘赤霞珠’花后30 d；3：浆果转色
前期，‘丹凤-2’花后 50 d，‘赤霞珠’花后 60 d；4：浆
果转色后期，‘丹凤-2’花后 60 d，‘赤霞珠’花后 80
d；5：浆果半熟期，‘丹凤-2’花后70 d，‘赤霞珠’花后
95 d；6：浆果成熟期，‘丹凤-2’花后80 d，‘赤霞珠’花
后 110 d）的果实材料 [21]，按照RNA提取试剂盒说明
书提取总RNA。
1.2.4 荧光实时定量PCR分析 分别取葡萄不同成
熟时期果实总RNA，按照RevertAidTM First Strand cD⁃
NA Synthesis Kit操作说明反转录为 cDNA，作为后续
荧光实时定量 PCR的模板。分别根据 VqSTS12/
VvSTS31和VqSTS33/VvSTS32基因 cDNA序列设计特
异引物VqSTS12-RT-F（5’-TACCCCTGACCACTGT⁃
GTCTAC-3’）、VqSTS12-RT-R（5’-CCTTCAATGCT⁃
GCTTCCT TAC-3’）、VqSTS33-RT-F（5’-CCTTTT
TGGTGATGGGTCTG-3’）、VqSTS33-RT-R（5’-GG⁃
TA TTGGGGATGAATGTTTG-3’）。以葡萄18S rRNA
为内参基因，上游引物 18S rRNA-F（5’-GTAACGG
GTGACGGAGAATTAG-3’），下游引物 18S rRNA-R
（5’-CCGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’）。按照SYBR
Premix Ex Taq II说明书进行实时定量PCR试验。
1.2.5 GUS融合瞬时表达载体的构建 选用pBI121
构建适用于启动子瞬时表达的GUS报告基因融合载
体，以 ScaⅠ和 XbaⅠ酶切 pMD19- T/PvqDSTS12、
pMD19-T/PvqDSTS33重组质粒和 pBI121空载体，分
别回收启动子片段和线性载体，连接，转化TOP10后
进行菌液 PCR 及酶切检测，重组质粒命名为
PvqDSTS12::GUS、PvqDSTS33::GUS。
1.2.6 瞬时转化葡萄叶片 将构建好的重组质粒
PvqDSTS31::GUS、PvqDSTS32::GUS转化到农杆菌菌
株GV3101中，农杆菌菌液使用LB培养基2次活化，
确保菌液具有侵染活性后，用重悬液（10 mmol·L-1 MES
140
第2期
pH 5.6，10 mmol·L-1 MgCl2，2% 蔗糖，150 μmol·L-1
AS）重悬至OD600=0.6~0.8，利用农杆菌介导的真空渗
透法瞬时转化葡萄叶片，具体方法参照 Santos-Rosa
等[22]的方案。将瞬转后叶片远轴面向上培养于保鲜
膜封口的培养托盘中，用于后期胁迫处理。对照叶
片置于重悬液中真空渗透30 min。
1.2.7 生物与非生物胁迫 将瞬时转化的葡萄叶片
分别进行以下处理。（1）葡萄白粉病接种：将感病‘佳
利酿’叶片上的白粉病菌利用压片法接种于渗透处
理 48 h后的叶片，光照培养箱培养 24 h。（2）SA：用 1
mmol·L-1的 SA喷洒农杆菌渗透后培养 48 h的葡萄
离体叶片，培养 24 h，培养方法同白粉病接种处理。
（3）MeJA：用10 mmol·L-1 MES溶液配置100 μmol·L-1
MeJA处理液，处理方法与时间同（2）。（4）ABA：配置
浓度为 100 μmol·L-1 ABA溶液为处理液，处理方法
与时间同（2）。（5）低温（高温）：将农杆菌渗透后的葡
萄叶片置于常温培养箱48 h后转入4 ℃（40 ℃）培养
箱处理 24 h。对照：将渗透后 48 h的葡萄叶片置于
常温光照培养箱培养24 h。
1.2.8 组织化学染色与GUS蛋白定量分析 GUS蛋
白的组织染色法参照 Jefferson法 [23]。将胁迫处理
后的葡萄叶片放置于 GUS染色液 [10 mmol · L- 1
Na2EDTA，100 mmol · L- 1 NaH2PO4，0.5 mmol · L- 1
K4Fe（CN）6·3H2O，0.1% Triton X-100 和 0.5 mg·L-1
X-Gluc]中，在 37 ℃培养箱中培养 24 h后使用 70%
的乙醇脱色。GUS蛋白荧光定量方法参照 Jefferson
法 [24]，GUS活性定量结果通过每毫克蛋白每分钟产
生 4-methylumbelliferon（4-MU）的量来确定。GUS
活性测定试验3次重复。
2 结果与分析
2.1 中国野生毛葡萄‘丹凤-2’双向启动子所启动
芪合成酶基因的序列同源性分析
为了分析欧洲葡萄双向启动子启动的VvSTS31
和VvSTS32在中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基
因中的同源序列，利用NCBI对 VvSTS31和 VvSTS32
序列进行比对。结果显示：欧洲葡萄 VvSTS31与毛
葡萄‘丹凤 - 2’VqSTS12（Genbank accession No.
JQ868686）同源，相似度为 98.47%；欧洲葡萄
VvSTS32与毛葡萄‘丹凤-2’VqSTS33（Genbank acces⁃
sion No. JQ868665）同源，相似度为92.71%（图1）。
2.2 双向启动子的克隆和顺式作用元件分析
和 静，等:野生毛葡萄芪合成酶基因双向启动子活性分析
参照LA PCR in vitro Cloning Kit说明书，毛葡萄
‘丹凤-2’叶片基因组DNA分别用 EcoR I和BamH I
酶切连接后，通过2轮PCR。将1 000 bp左右的条带
分别胶回收，连接，转化，经酶切检测和测序后，获得
PvqDSTS33序列（Genbank accession No.KM250118），
其反向互补序列即为PvqDSTS12序列（Genbank ac⁃
cession No.KP899559）。
将获得的中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基
因双向启动子序列提交到启动子预测网站 Plant⁃
CARE进行顺式作用元件预测分析（图 2）。预测
结果发现距 PvqDSTS12转录起始位点（ATG）上游
的-108~-103 bp有典型的TATA-box及-26~-21 bp
处有 1个 CAAT-box元件；距 PvqDSTS33 ATG上游
的-114~-106 bp有典型的 TATA-box及-334~-330
图1 欧洲葡萄VvSTS31/VvSTS32与毛葡萄‘丹凤-2’VqSTS12/VqSTS33基因序列比对
Fig. 1 Gene sequence alignment between VvSTS31/VvSTS32 from V. vinifera and VqSTS12/VqSTS33
from V. quinquangularis‘Danfeng-2’
Similarity Scale
Nothing detected 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
VqSTS12
VvSTS31
VqSTS33
VvSTS32 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1 000 1 100
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1 000 1 100
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1 000 1 100
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1 000 1 100
141
果 树 学 报 第33卷
bp处有 1个CAAT-box元件。启动子中含有很多与
胁迫诱导调控相关的元件，其中，Box-W1与真菌诱
导有关，TGACG-motif与茉莉酸甲酯（MeJA）诱导有
关，ABRE与脱落酸（ABA）响应相关。MBS是MYB
系列转录因子与 DNA结合相关的顺式作用元件。
GCN4_motif和 Skn-1_motif与胚乳表达相关。SOR⁃
LIP响应光诱导，SITEIIATCYTC参与细胞 DNA聚
合。预测分析结果表明中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪
反向箭头表示在互补链上顺式作用元件Flip Arrows mean cis-acting elements on complementary strand
图2 ‘丹凤-2’芪合成酶基因双向启动子（PvqDSTS12）序列及主要的顺式作用元件
Fig. 2 The sequence and cis-acting element of bidirectional stilbene synthase promoter（PvqDSTS12）from
V. quinquangularis‘Danfeng-2’
-1 244
-1 184
-1 124
-1 064
-1 004
-644
-584
-524
-464
-404
-344
-284
-224
-164
-104
-44
-944
-884
-824
-764
-704
142
第2期
合成酶基因双向启动子中的调控元件多数参与环境
胁迫响应，在防御反应中可能具有重要的调控作用。
2.3 ‘丹凤-2’双向启动子与欧洲葡萄双向启动子
差异
将毛葡萄3个株系‘丹凤-2’‘83-4-96’‘商-24’
的双向启动子与欧洲葡萄 3个品种‘赤霞珠’‘霞多
丽’‘雷司令’的相应启动子比较发现：毛葡萄双向启
动子序列比欧洲葡萄短 491 bp（图 3）。比对毛葡萄
‘丹凤-2’双向启动子 PvqDSTS12与欧洲葡萄品种
‘赤霞珠’双向启动子 PvvSTS31发现：除去缺失的
491 bp，其他序列的相似度为98.81%（图4）。
2.4 毛葡萄‘丹凤-2’与欧洲葡萄‘赤霞珠’双向启
动子所启动基因在果实发育不同时期的荧光实时定
量PCR分析
为了了解果实发育不同时期毛葡萄‘丹凤-2’
VqSTS12/VqSTS33与欧洲葡萄‘赤霞珠’VvSTS31/
VvSTS32表达量的差异，设计了特异引物进行实时定 量 PCR。结果是，‘丹凤-2’VqSTS12和 VqSTS33的
和 静，等:野生毛葡萄芪合成酶基因双向启动子活性分析
1 500 bp
800 bp
M 1 2 3 4 5 6
M. MarkerⅢ DNA Ladder；1~3. 中国野生毛葡萄株系‘丹凤-2’
‘83-4-96’‘商-24’；4~6.欧洲葡萄品种‘赤霞珠’‘霞多丽’‘雷司令’
M. MarkerⅢ DNA Ladder；1 to 3.‘Danfeng-2’‘83-4-96’‘Shang-
24’from V. quinquangularis；4 to 6.‘Cabernet Sauvignon’‘ Chardon⁃
nay’‘ Riesling’from V. vinifera
图3 中国野生毛葡萄芪合成酶基因双向启动子与欧洲葡萄
双向启动子电泳图对比
Fig. 3 Electrophoretogram comparison between
PvqDSTS12 from V. quinquangularis and PvvSTS31
from V. vinifera



 


                



 


           



 


              



 


            



 


                   



 


               



  


             



 


             


 


              


 


                         


  


                   


 


           

注:黑色部分相似度为100%。
Note: Homology of the sequences in black shadow is 100%.
图4 中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因双向启动子序列与欧洲葡萄‘赤霞珠’比对
Fig. 4 Sequence alignment about bidirectional stilbene synthase promoter between V. vinifera‘Cabernet Sauvignon’
and V. quinquangularis‘Danfeng-2’
120120
240240
360360
480479
600507
719507
839507
959507
1 079587
1 199707
1 319827
1 412920
143
果 树 学 报 第33卷
0
1
2
3
4
5
6
7
1 2 3 4 5 6
VqSTS12 VvSTS31
显著差异。
2.5 GUS表达载体的构建及不同胁迫对瞬时转化
表达的影响
为了进一步研究‘丹凤-2’芪合成酶基因双向启
动子的活性，分别构建了双向启动子的GUS报告基
因融合载体 PvqDSTS12::GUS、PvqDSTS33::GUS。阴
性对照为 P0::GUS（无启动子），阳性对照为
CaMV35S::GUS（CaMV 35S强启动子）。将GUS融合
载体转化农杆菌菌株GV3101，用于瞬时表达。
使用化学组织染色和GUS蛋白定量方法验证
PvqDSTS12和 PvqDSTS33对葡萄白粉菌的诱导响
应。化学组织染色显示阴性对照叶片没有染色，阳
性对照 CaMV 35S显深蓝色。PvqDSTS12启动的
GUS对白粉菌处理敏感，染色加深，表达增强。
注：*表示显著性差异在P<0.05水平。下同。
*indicates significant difference at P<0.05. The same below.
图5 定量分析‘丹凤-2’VqSTS12/VqSTS33和‘赤霞珠’VvSTS31/VvSTS32表达差异
Fig. 5 Quantitative analysis of the expression profiles between VqSTS12/VqSTS33 from‘Danfeng-2’and VvSTS31/VvSTS32
from‘Cabernet Sauvignon’
0
200
400
600
800
1000
1200
1 2 3 4 5 6
VqSTS33 VvSTS32
*
A B
1 2 3
相
对
表
达
量
Rel
ativ
e ex
pres
sion
总体表达量高于‘赤霞珠’（图 5）。4个基因的基本
表达趋势为：时期1~3持续增长，时期4下降，时期5
达到最高峰，时期6表达降低。其中不同的是，毛葡
萄‘丹凤-2’VqSTS12的表达量在时期4并未降低，而
是增加到时期3的2.30倍；欧洲葡萄VvSTS32基因在
时期 6表达量升高为时期 5的 1.42倍。利用 T检验
对不同时期VqSTS12/VqSTS33与VvSTS31/VvSTS32的
表达量进行显著性分析，结果显示，在P<0.05的水平
下，时期1和4，VqSTS12与VvSTS31的表达量呈显著
差异；时期1、4、5和6，VqSTS33与VvSTS32的表达呈
STS33 TS32
图6 GUS染色验证葡萄白粉菌对‘丹凤-2’双向启动子启动活性的影响
Fig. 6 Histochemical staining of GUS gene test the influence of starting activity of bidirectional stilbene synthase promoters
from‘Danfeng-2’using U. necator
CaMV35S::GUS PvqDSTS12::GUS PvqDSTS33::GUS P0::GUS
*
*
*
*
*
*
Uncinula
necator
CK
1 2 0
1 0
800
6 0
4 0
200
0
相
对
表
达
量
Rel
ativ
e ex
pres
sion
144
第2期
0
50
100
150
200 PvqDSTS12 PvqDSTS33
和 静，等:野生毛葡萄芪合成酶基因双向启动子活性分析
GUS
acti
vity
(pm
ol·m
g-1 ·
min
-1 )
U. necator
PvqDSTS33无明显变化（图 6）。利用GUS蛋白定量
方法进一步分析启动子活性。试验结果显示，经白
粉菌处理后，PvqDSTS12的GUS活性是对照的近 2
倍，与对照呈显著性差异（P<0.05）。而 PvqDSTS33
几乎没有变化（图7），这与染色结果一致。试验结果
表明 PvqDSTS12响应白粉菌的侵染，而 PvqDSTS33
不响应。
非生物胁迫试验用于研究该双向启动子对温度
和激素的响应（图 7）。在 SA试验中，PvqDSTS12和
PvqDSTS33的GUS活性几乎没有变化。MeJA处理
后，PvqDSTS12和 PvqDSTS33的GUS活性都表现升
高趋势，约为对照的 1.80 倍。在冷处理中，
PvqDSTS12的GUS活性升高，约为对照处理的 1.25
倍，而PvqDSTS33的GUS活性降低，仅为对照处理的
0.67倍。热处理使两者GUS活性均降低。试验结果
表明，PvqDSTS12与PvqDSTS33均对SA处理不敏感，
2者对冷处理表现出相反反应，而对MeJA和热处理
呈现相同反应。
3 讨 论
双向启动子作为植物中一种特殊的启动子，研究
较少，在基因组序列中具有省空间、减少基因沉默[25]、
同时启动和双向表达的优势。虽自身启动活性与
CaMV 35S强启动子比较还有差异，但有研究表明，
人工连入增强表达基序可以提高启动子活性[26]。芪
合成酶是白藜芦醇生物合成过程中的关键催化酶，
芪合成酶基因的相关研究很多 [27]，但芪合成酶基因
启动子的研究较少 [28]，尤其是双向启动子的还没有
报道。本研究主要探究葡萄芪合成酶基因家族中已
知的一对双向启动子在生物、非生物胁迫及果实发
育时期启动活性的变化。
本研究将该双向启动子中的保守元件与对其他
双向启动子比较后发现，人类等脊椎动物已研究的
双向启动子中只有 9%含有 TATA盒 [29]，拟南芥和水
稻等植物基因组中双向启动子的TATA盒含量也较
少 [10]，而本研究中的毛葡萄芪合成酶基因双向启动
子中含有大量的TATA盒，TATA盒是RNA聚合酶 II
与基因调控序列互作的结合位点，它的存在对于确
定转录起始方向及对转录过程的调控有重要作用。
本研究的双向启动子也包含有Dhadi等[10]报道的保
守元件 SORLIP和 SITEIIATCYTC，它们分别与光诱
导和PCNA的转录有关。
转录调控是基因表达阶段中最主要的调控方
式，该过程是反式作用因子与靶基因上游相关顺式
作用元件进行结合，从而调节基因表达。在葡萄叶
片上，通过白粉菌接种和非生物胁迫处理，双向启动
子对GUS基因的启动活性变化有差异，如 4 ℃处理
后，PvqDSTS12的GUS活性升高，而PvqDSTS33却降
低。也有学者发现双向启动子两侧调控基因表达程
度呈负相关[29]，用来解释这一问题的模型有很多，其
中最广泛认同的是共享转录调控位点[11，30]，即双向启
动子 2个方向共用相同的转录结合位点，同一个顺
式作用元件2个方向结合活性的不同则可导致不同
的表达活性。结合活性由顺式作用元件的种类决
定，根据刘石娟的研究，顺式元件可分为 2类，一类
是方向和位置敏感性元件，这类作用元件的调控能
力与它们在启动子上的方向及位置有关 [31]；而另一
类顺式作用元件的调控与方向和位置无关[32]。在本
研究中，响应真菌诱导的Box-W1属于第一类顺式
作用元件，与茉莉酸甲酯诱导相关的 TGACG-motif
属于第二类。
中国野生毛葡萄‘丹凤-2’双向启动子与欧洲葡
萄赤霞珠相比缺少 491 bp，但在表达量最高的时期
5，VqSTS12 和 VqSTS33 表达量高于 VvSTS31 和
VvSTS32，这可能与启动子的缺失有关。Oropeza-
Aburto等[33]研究发现，启动子活性并未依照启动子逐
步缺失而递减，其原因可能是缺失的序列不是靶基
因表达所必需，去除冗余的片段更有利于基因的表
达。
转色期是葡萄果实发育的重要转折点，该时期
基因的表达变化对葡萄果实发育有很重要的影响。
在葡萄果实发育后期，即转色期到成熟期，由于白藜
TS 3
图7 GUS蛋白定量检测不同胁迫对‘丹凤-2’
双向启动子活性影响
Fig. 7 Fluorescent quantitation analysis of GUS gene test
the influence of starting activity of bidirectional stilbene
synthase promoters from‘Danfeng-2’under diffierent
stresses
TS12
CK SA ABA 40 ℃ 4 ℃MeJA
* * *
*
*
*
*
0
0
0
0
0
145
果 树 学 报 第33卷
芦醇与花青苷合成竞争底物，随着花青苷的积累，白
藜芦醇及其衍生物含量下降[34]。白藜芦醇的含量与
芪合成酶基因的表达有一定关联[27]。本研究的果实
发育时期 3~4对应转色期，在转色期，VqSTS33、
VvSTS31和VvSTS32的表达量均有不同程度下降，而
VqSTS12表达量在转色期呈上升趋势。葡萄果实中
白藜芦醇及其衍生物的含量与当年气候、品种和基
因等都有关，转色期芪合成酶基因的表达差异性可
能与双向启动子有关。
迄今为止，关于植物双向启动子的研究主要集
中于各种非生物胁迫对于双向启动子活性的影响，
如氯化钠，冷处理[35]，茉莉酸甲酯[36]，热处理[12]等，但
对于双向启动子之间表达活性的差异研究较少。本
研究在叶片和果实组织中分别对双向启动子的活性
进行验证，并且将中国野生毛葡萄与欧洲葡萄进行
对比，研究启动子在正向和反向不同的启动活性。
研究结果将进一步对揭示葡萄芪合成酶基因双向启
动子的启动机理和活性提供依据，关于中国野生毛
葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因双向启动子的启动活性
与差异的作用机理是下一步研究的重点内容。
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