全 文 ： 菌物学报
jwxt@im.ac.cn 15 January 2014, 33(1): 138‐142
Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q © 2014 IMCAS, all rights reserved.
简报 Short communication DOI: 10.13346/j.mycosystema.120152
基金项目：浙江省公益技术研究农业项目（No. 2010C32084）
*Corresponding author. E‐mail: bglou@zju.edu.cn
收稿日期: 2012‐07‐03, 接受日期: 2013‐09‐29
秃瓣杜英叶枯病及其病原菌
楼晓明 1 许琰丹 2 孙超 3 楼兵干 3*
1 浙江省杭州市园林文物局花港管理处 浙江 杭州 310007
2 绍兴出入境检验检疫局 浙江 绍兴 312000
3 浙江大学生物技术研究所 浙江 杭州 310058
摘 要：秃瓣杜英是我国江南地区广泛栽培的园林绿化树种。从 2003 年开始，在杭州地区秃瓣杜英叶枯病发生严
重，发病株率达 20%以上。该病害主要在春、秋季为害新梢嫩叶，导致叶片枝条枯死，树势衰退，严重的整株树
枯死。通过对侵染秃瓣杜英病原菌的形态学观察、致病性测定及 rDNA ITS 序列分析，证明侵染秃瓣杜英的病原菌
为芒果球座菌 Guignardia mangiferae，其无性型为 Phyllosticta anacardiacearum。
关键词：球座菌，叶点霉，ITS 序列，园林绿化
Leaf blight of Elaeocarpus glabripetalus and its pathogen
LOU Xiao‐Ming1 XU Yan‐Dan2 SUN Chao3 LOU Bing‐Gan3*
1 Huagang Office, Hangzhou Bureau of Garden and Cultural Relics, Hangzhou, Zhejiang 310007, China
2 Shaoxing Entry‐Exit Inspection and Quanrantine Bureau, Shaoxing, Zhejiang 312000, China
3 Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310058, China
Abstract: Elaeocarpus glabripetalus (Elaeocarpaceae) is widely cultivated as an ornamental tree in southern China. Since
2003, a leaf blight has seriously occurred on the plants in Hangzhou area, Zhejiang Province. The rate of the diseased
plant was more than 20%. The disease mainly infects the top of plants in spring and autumn, causing twigs growing
slowly, degenerating and even wilting to death of the whole plants. The causal agent was identified as Guignardia
mangiferae (anamorph: Phyllosticta anacardiacearum) based on its morphological characteristics, pathogenicity and
rDNA ITS sequence analyses.
Key words: Guignardia mangiferae, Phyllosticta anacardiacearum, rDNA ITS sequence, ornamental tree
楼晓明 等 /秃瓣杜英叶枯病及其病原菌
菌物学报
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秃瓣杜英 Elaeocarpus glabripetalus Merr.
是杜英科 Elaeocarpaceae杜英属 Elaeocarpus L.
中的一种优良的园林绿化树种。该树种树干通
直，树冠圆整，树姿优美，冬春季部分老叶红
色，挂于树枝上，红绿相间，颇为美丽。加之
树木易繁殖、移栽、生长迅速，对二氧化硫等
有害气体具有很强的抗性，在长江中下游以南
地区多作为行道树、园林景观树以及防护林带
广为栽种。从 2003 年秋开始，在杭州及周边
地区，发现秃瓣杜英上有叶枯病发生，发病株
率达 20%以上。该病主要为害新梢嫩叶，形成
叶枯和叶斑，树势逐年衰退，严重的树干枯死，
影响秃瓣杜英的生长和观赏价值。郭立中和邓
先琼（2006）对杜英 Elaeocarpus decipiens
Hemsl.叶枯病的病原进行过鉴定，明确杜英叶
枯病病原菌为球座菌 Guignardia sp．（无性型：
叶点霉 Phyllosticta sp．），但未明确其具体分类
地位。为此，本文对该病的发生情况及其病原
菌的分类地位进行了深入研究。
1 材料与方法
1.1 病害调查
在 2007–2011年，选取杭州西湖风景区、浙
江大学华家池校区和杭州运河边公园的秃瓣杜
英叶枯病进行定点和定期调查，调查不同树龄
和不同季节叶枯病的发生和危害及症状特点。
1.2 病原菌的分离和保藏
在杭州西湖风景区采集具典型叶枯病症状
的秃瓣杜英新鲜病叶进行病原菌的分离和培
养。首先用自来水将病叶冲洗干净，经自然晾
干，在病健交界处切取 5mm×5mm 的组织块，
在 75%酒精中消毒 30s，然后在 0.1%升汞中消
毒 5s，最后经无菌水漂洗 2 次后，将组织块移
到 PDA 平板中，在 25℃黑暗条件下培养。待长
出菌落后，挑取菌落边缘菌丝体进行转接和培
养。经稀释单孢分离，获得 Phy01、02、03、04、
05和 06等 6个菌株，将这 6株菌在 PDA斜面试
管中培养后加入液体石蜡保藏（室温）备用。
1.3 致病性测定
选取菌株 Phy03 在 PDA 平板上培养 10d，
用灭菌玻棒轻轻刮下病原菌的分生孢子，用无
菌水配制成分生孢子悬浮液（浓度 106个/mL）
作为接种体。于 2008 年 4月在浙江大学华家池
校区的健康秃瓣杜英树上进行致病性试验。将
上述配好的分生孢子悬浮液喷在秃瓣杜英的新
叶上，接种后用塑料袋保湿 48h，以无菌水作
对照，定期观察并记载发病情况和症状特点。
1.4 病原菌的培养和形态学观察
将单胞分离获得的 Phy01、02、03、04、
05 和 06 等 6 株菌分别培养在 PDA 平板上，于
25℃的恒温培养箱中，在光暗交替条件下培
养。在 PDA 上形成子实体后，在光学显微镜下
进行病原菌的形态学观察和照像。将菌株
Phy01 和 Phy03 送往中国科学院微生物研究所
进行鉴定。
1.5 基因组 DNA 提取和 rDNA ITS 区序列扩增
菌株 Phy01、02、03、04、05 和 06 基因组
DNA的提取参照White et al.（1990）的方法。
用引物 ITS4（5′‐TCCTCCGCTTATTGATATGC‐3′）和
ITS5（5′‐GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG‐3′）扩增 ITS
和 5.8S rDNA 序列。反应在 25μL 体系中进行，
25μL 反 应 体 系 含 1×PCR 反 应 缓 冲 液 、
1.5mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、0.5mol/L
的一对引物、60ng 模板 DNA、1U Taq 聚合酶
和 ddH2O。反应程序为 94℃预变性 3min，进
入循环；94℃变性 30s，50℃退火 30s，72℃延
伸 1min，34 个循环；最后 72℃延伸 7min，
4℃保存。用上海申能博彩生物科技有限公司
的 DNA 清洁试剂盒纯化 PCR 产物。
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1.6 测序及 rDNA ITS 序列分析
序列测定在浙江大学农生环分析测试中
心生物大分子实验室的 MegaBase 1000 DNA
测序仪上进行。测序后的 ITS1、ITS2 和 5.8S
rDNA 用 CLUSTAL X 进行序列联配比较、编辑，
然后提交 GenBank。将序列与 GenBank 中的
ITS1、ITS2 和 5.8S rDNA 序列进行同源性比较。
2 结果与分析
2.1 病害调查及其病原菌分离
据 2007–2011 年调查，在杭州地区秃瓣杜
英叶枯病的发病株率达 20%以上。该病害主要
为害新梢嫩叶，形成叶枯和叶斑，长势衰弱的
树干或树枝更易发病，严重的树干枯死，影响
秃瓣杜英的生长和观赏价值。该病害大多从叶
缘或叶尖开始发生，逐渐向叶片内侧或叶柄方
向发展，最后形成叶枯。病斑初期为深褐色小
点，后发展为红褐色圆形、半圆形或不规则小
斑，圆形病斑的直径约为 0.5–1.0cm（图 1A）。
病斑不断扩大，向内和向上下延伸或多个病斑
愈合形成叶尖或叶缘枯死。病斑边缘红褐色，
中间棕褐色或灰褐色。湿度大时，嫩叶上病斑
扩展快，迅速形成叶片半截枯死或叶缘枯死。
病、健交界明显，病斑中间散生黑色的颗粒状
物，即病原菌的分生孢子器（图 1B），分生孢
子器球形或扁球形，直径 75–150µm，平均为
123.5µm。病斑在叶片中部发生时，开始为深
褐色小点，后发展为边缘红褐色、中间棕褐色
或淡褐色的近圆形或不规则病斑。
在病害调查的基础上，分离获得了多个菌
株，选择其中 6 个菌株（Phy01–06）进行保藏
和用于致病性测定和病原菌鉴定。
2.2 致病性测定
接种试验结果表明，接种 5d 后接有病原
菌的秃瓣杜英叶片出现症状，14d 后，所有接
种叶片出现与自然发病相似的症状（图 1C），
而对照无任何症状。取病、健交界处组织再分
离，可重新分离到同一种病菌。
2.3 秃瓣杜英叶枯病菌鉴定及其培养性状
病菌在 PDA上生长较慢，25℃暗培养 10d，
菌落直径为 75mm，菌落正面与背面均为黑色。
后期形成灰黑色颗粒状分生孢子器（图 1D），
分生孢子器球形或扁球形，直径达 238µm，器
壁由 7 层角胞组成，厚度为 32–40µm，孔口单
生、居中，孔口处壁加厚棕色，产孢细胞顶生，
亚圆筒状，无色，光滑，大小为 6–12×3–5µm，
分生孢子倒卵形或梨形，基部通常平截，无色，
含多个油滴，10–12.5×5–7µm，外有粘液鞘包
被，顶部有一根无色附属丝，长 5–8µm（图 1E）。
病原菌在自然发病的病叶上或 PDA 培养基上
未发现有性世代，但在杜英叶煮出液+1‰酵母
+1.5%蔗糖琼脂培养基上，培养 15d 后开始产
生子囊座。子囊座球形，黑色，直径为
150–300µm。子囊束生，双层壁。子囊圆筒形
或棍棒形（图 1F），35–80×7.5–10µm，子囊内
含 8 个子囊孢子。子囊孢子纺锤形（图 1G），
微弯，无色，初为单细胞，成熟后为大小不等
的双细胞，10–15×5µm。经形态鉴定，引起秃
瓣 杜 英 叶 枯 病 的 病 原 菌 为 芒 果 球 座 菌
Guignardia mangiferae A.J. Roy，无性型为
Phyllosticta anacardiacearum van der Aa（Van
der Aa 1973）。
2.4 rDNA ITS 分析
通过对菌株 Phy01、02、03、04、05 和 06
的 rDNA ITS 区 PCR 扩增，均获得一个约 640bp
的 DNA 片段（图 2）。经序列联配证明这 6 个
菌株的 ITS1、ITS2 和 5.8S 的 rDNA 序列是一致
的，序列长度均为 551bp。随后将序列提交给
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GenBank ， 并 获 得 序 列 号 （ Accession
Nos.:EU821356–EU821361 ）。 所 测 序 列 与
GenBank中已登录的菌株进行比对，结果显示，
病原菌菌株与有性型的芒果球座菌 Guignardia
mangiferae （Accession Nos.: AM403717 和
AB119121）, 同源性均达 100%，从分子水平
上证明引起秃瓣杜英叶枯病的病原物是芒果
球座菌。
图 1 秃瓣杜英叶枯病菌及为害症状 A：田间症状；B：分生孢子器；C：人工接种致病症状；D：在 PDA 上菌落
（25℃ 10d）；E：分生孢子；F：子囊；G：子囊孢子. 标尺为 20µm.
Fig. 1 The pathogen and symptom of leaf blight of Elaeocarpus glabripetalus. A: Symptom on leaves; B: Pycnidia; C:
Symptom caused by artificial inoculation; D: Colony on PDA (25℃, 10d); E: Conidia; F: Asci; G: Ascospores. Scale bars= 20µm.
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图 2 病原菌 rDNA ITS‐PCR 扩增产物电泳图谱 M：
4 500bp markers；1–6 泳道：菌株 Phy01、Phy02、Phy03、
Phy04、Phy05 和 Phy06.
Fig. 2 Electrophoresis pattern of rDNA ITS‐PCR products of
Guignardia mangiferae. M: 4 500bp markers; Lane 1–6:
Strains Phy01, Phy02, Phy03, Phy04, Phy05 and Phy06,
respectively.
3 讨论
秃瓣杜英叶枯病是我国新发现的一种林
木真菌病害。通过病原菌分离培养及致病性测
定，证明引起该病的病原菌为芒果球座菌
Guignardia mangiferae A.J. Roy。根据作者多年
野外观察，野生状态下的秃瓣杜英叶枯病很少
发生，但在公园和道路边栽种的秃瓣杜英叶枯
病发生逐年加重，这与秃瓣杜英生境的改变存
在密切关系。人工栽种秃瓣杜英过于密集和树
种单一，易引起杜英叶枯病的发生。因此，建
议园林绿化管理部门应加强杜英的栽培管理，
避免树种单一，栽种时要增强树势，减少病害
的发生，提高景观效果，降低经济损失。另外，
多年药剂试验结果（未发表）表明，在春梢初
展时，喷洒多菌灵和甲基托布津等杀菌剂是防
治该病的有效措施。
据文献报道，芒果球座菌是茶树、柑桔等
植物的内生真菌，通常不引起植物病害，只有
当树势衰退时才引起植物发病（ Peres &
Harakava 2007；Everett & Rees‐George 2006；
杨民和等 2010），但本文研究结果表明芒果球
座菌是杜英叶枯病的病原菌，说明芒果球座菌
可以内生菌和病原菌的形式存在。内生真菌能
否成为致病菌可能与寄主及生长环境有关。
目前，在我国各地有不少野生树木品种被
直接或经驯化繁育后应用于美化城市环境，但
对大量栽培后发生病害的研究却远落后于树
木品种的推广应用，从而造成一旦发生新植物
病害时往往束手无策。在杭州市杜英叶枯病的
普遍发生应引起园林绿化管理部门的高度重
视，并加强防治工作。
致谢：中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种
保藏管理中心提供文献资料并进行形态学鉴定，浙江
大学农生环分析测试中心高其康研究员提供测序服
务，在此表示诚挚感谢。
[REFERENCES]
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Everett KR, Rees‐George J, 2006. Reclassification of an
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Peres NA, Harakava R, 2007. Comparison of molecular
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杨民和，徐焰平，苏经迁，2010. 茶树内生球座菌的
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