全 文 :书 [收稿日期] 2014-05-12;2014-10-16修回
[基金项目] 国家社会科学基金项目“白族民间医药文化调查研究”(12XMZ033);贵州省科技厅贵州民族大学联合项目[黔科合J字LKM
(2012)04]
[作者简介] 卫亚丽(1977- ),女,副教授,从事天然药物分析及应用的研究。E-mail:weiyali0012@163.com
*通讯作者:何可群(1971-),女,副教授,从事分析化学及民族药用植物学的研究。E-mail:hekequn2004@163.com
[文章编号]1001-3601(2014)12-0737-0066-04
HPLC法同时测定地桃花的槲皮素和山奈酚
卫亚丽,吕 昱,杨 琼,何可群*
(贵州民族大学 化学与环境科学学院,贵州 贵阳550025)
[摘 要]为更好地控制地桃花的质量,建立高效液相色谱法同时测定地桃花中槲皮素和山奈酚含量的
方法,对地桃花中槲皮素和山奈酚的含量进行测定。结果表明:用C18色谱柱(100mm×4.6mm,5μm),以
甲醇-0.4%磷酸水溶液(45∶55)为流动相,流速0.8mL/min,检测波长360nm,测定出槲皮素和山奈酚的
线性范围均为2.500~25.00μg/mL,相关系数r分别为0.999 7和0.999 9,精密度RSD(n=5)分别为
0.98%和0.79%,稳定性试验RSD(n=5)分别为1.36%和1.13%,加样回收率RSD(n=5)分别为
2.37%和2.10%。该方法适于同时测定地桃花中的槲皮素及山奈酚含量,方法简便可行,重现性好,精密度
高,结果可靠。地桃花中槲皮素和山萘酚的最高含量分别为(1.067±0.02)mg/g和(1.232±0.03)mg/g。
[关键词]HPLC;地桃花;槲皮素;山奈酚
[中图分类号]S567.9;R917 [文献标识码]A
Simultaneous Determination of Quercetin and
Kaempferol in Urena lobata by HPLC
WEI Yali,LV Yu,YANG Qiong,HE Kequn*
(Chemistry and Environmental Science Department,Guizhou Minzu University,Guiyang,Guizhou550025,China)
Abstract:To better control the quality of U.lobata,an HPLC method was established for
simultaneously determining quercetin and kaempferol of U.lobata and the content of quercetin and
kaempferol were determined.The column was agilent Eclipse plus C18(100mm×4.6mm,5μm)column.
The mobile phase was mixture of methanol and 0.4%phosphoric acid water solution(45∶55).The flow
rate was 0.8mL/min,the wavelength was 360nm.The results showed that the calibration curves of two
flavonoids were both linear in the range of 2.500~25.00(g/mL(r=0.9997and 0.9999respectively).
The precisions test RSD were 0.98%and 0.79%respectively.The stability test RSD were 1.36%and
1.13%respectively.The RSDwere 2.37%and 2.10%respectively.The method was accurate with high
sensitivity and suitable for the determination of quercetin and kaempferol in U.lobata.The highest
contents of quercetin and kaempferol in U.lobata were respectively(1.067 0.02)mg/g and(1.232 0.03)
mg/g.
Key words:HPLC;Urena lobata;quercetin;kaempferol
地桃花(Urena lobata L.)是锦葵科梵天花属多
年生亚灌木状草本植物,又名野桃花、野棉花、肖梵
天花、大迷马桩棵、土黄芪等 [1-4]。地桃花全株均可
入药,具有清热利湿,祛风解毒,益气活血、消肿的功
效,主治乳腺炎、风湿痹痛、感冒、带下、淋病、肾炎水
肿、疟疾、痢疾、外伤出血等,在我国西南地区,地桃
花是白族、纳西族、苗族等少数民族习用草药[1-5]。
已有研究表明,地桃花的化学成分主要为黄酮类、甾
醇、鞣质、酚类、有机酸、蛋白质、糖类、皂苷等[4-7]。
地桃花水提液在体外对大肠埃希菌、金黄色葡萄球
菌、肺炎链球菌、普通变形杆菌及铜绿假单胞菌均有
一定的抑菌活性[8]。目前,地桃花尚未被《中国药
典》收录,但含有地桃花药材的花红片和花红颗粒为
2010年版《中国药典》收录品种。关于地桃花药材
质量标准的描述,在《广西中药材标准》和《湖南省中
药材标准》中均被收录。但两个地方标准对于地桃
花相关质量标准的规定非常简单,仅有来源、性状、
炮制、性味归经、功能主治、用法用量及保藏方面的
简单描述。地桃花在民间被广泛使用,《中国药典》
有必要对其质量标准进行规定。贾陆等从95%乙
醇提取地桃花浸膏中共检测出12个黄酮及苷类化
合物,分别是山奈酚、芦丁、槲皮素等[6]。槲皮素具
有抗肿瘤[9]、抗炎[10]、抗血小板聚集及扩张冠脉等
作用[11];山奈酚有逆转肿瘤细胞多药耐药、对神经
细胞的保护作用以及对蛋白激酶的抑制作用等[12]。
目前,国内外还未见有关地桃花中槲皮素及山奈酚
测定的研究报道。试验建立同时测定地桃花中槲皮
素和山奈酚含量的方法,并对3个批次地桃花中槲
皮素及山奈酚含量进行测定,以期为进一步完善地
桃花的质量控制体系和研究开发提供依据。
贵州农业科学 2014,42(12):66~69
Guizhou Agricultural Sciences
1 材料与方法
1.1 试验材料
材料及试剂:地桃花,采自云南省云龙县,经鉴
定为地桃花(Urena lobata L.),标本保存于贵州民
族大学化学与环境科学学院药学教研室。槲皮素
(批号:117-39-5)及山奈酚(批号:520-18-3)对照品,
均购自贵州迪大科技有限责任公司。磷酸、无水甲
醇均为色谱纯,浓盐酸为分析纯,所有试剂用超纯水
配制。
仪器:高效液相色谱仪(Agilent 1260LC,美国
安捷伦仪器有限公司),VWD可变波长紫外检测
器,756PC紫外-可见分光光度计(上海舜宇恒平科
学仪器有限公司),METTLERAE240电子分析天
平(上海天平仪器厂),BGZ-30电热鼓风干燥箱(上
海博迅实业有限公司医疗设备厂),SG3200HE超
声清洗仪(上海冠特超声仪器有限公司),数显恒温
水浴锅(常州博远实验分析仪器有限公司)
1.2 储备液的配制
1.2.1 对照品储备液的配制 精密称取槲皮素、
山奈酚各20.00mg,分别置于50mL容量瓶中,加
无水甲醇适量使其溶解,以无水甲醇定容,摇匀,配
制成质量浓度均为400μg/mL的单一对照品储备
液备用。
1.2.2 供试品溶液的制备[9-10] 将自然晾干的地
桃花叶片在电热鼓风干燥箱中于(60±1)℃烘干
3h,精确称取干燥、粉碎(过40目筛)的地桃花叶粉
末0.500g,用80%甲醇水溶液20mL浸泡、75℃水
浴回流提取2次,每次1h,提取结束后,合并提取
液、冷却、过滤,滤液用80%甲醇水溶液补足至
40mL,加10mL浓盐酸(质量浓度35%),85℃水
浴回流酸水解1h,迅速冷却,用无水甲醇定容至
50mL,摇匀,临用前过0.45μm滤膜。
1.3 检测波长的选择与色谱条件
将质量浓度均为40μg/mL的槲皮素、山奈酚
标准品的甲醇溶液用756PC紫外-可见分光光度计
在波长200~500nm进行扫描,选择使两种物质吸
收较大的波长作为检测波长。
色谱条件:Agilent Eclipse plus C18 色谱柱
(100mm×4.6mm,5μm);流动相为甲醇与0.4%
磷酸水溶液,按不同比例混合(70∶30、60∶40、45∶
55),根据槲皮素、山奈酚的分离度确定最终的混合
比例;流速0.8mL/min;紫外检测波长根据1.3结
果确定;柱温30℃;进样量10μL。
1.4 方法学考察
1.4.1 线性关系考察 分别精密吸取质量浓度
为400μg/mL的 槲 皮 素、山 奈 酚 标 准 溶 液 各
2.00mL置于同一个20mL容量瓶中,用无水甲醇
稀释至刻度、摇匀,得质量浓度为40μg/mL的槲皮
素、山奈酚混标溶液。分别精密吸取上述槲皮素、山
奈酚混标溶液各0.625mL、1.25mL、2.50mL、
3.75mL、5.00mL、6.25mL置于6个10mL容量
瓶中,用无水甲醇稀释至刻度、摇匀,配制成含槲皮
素、山 奈 酚 均 为 2.50 μg/mL、5.00 μg/mL、
10.00μg/mL、15.00 μg/mL、20.00 μg/mL、
25.00μg/mL的混标溶液。以0.45μm 滤膜过滤
后,在色谱条件下测定峰面积,以对照品溶液浓度
(μg/mL)为横坐标x,峰面积为纵坐标y,绘制标准
曲线并进行回归分析。
1.4.2 精 密 度 考 察 将 质 量 浓 度 均 为
20.00μg/mL的槲皮素、山奈酚混合对照品溶液按
色谱条件连续进样5次,以峰面积计算槲皮素及山
奈酚的RSD。
1.4.3 稳定性试验 将同一供试品溶液在0、
2h、4h、8h、10h进行测定,测定色谱峰面积,计算
槲皮素及山奈酚的RSD。
1.4.4 回收率试验 精密称取5份已知含量的样
品(20140213)各0.250g,分别精密加入槲皮素、山
奈酚标准溶液适量,按1.2.2项下方法制备溶液,按
色谱条件进样分析,测定峰面积,计算各成分的量及
回收率。
1.5 样品测定 精密称取3批地桃花样品(采集
时间分别为20130205、20140213、20140117)各3
份,每份0.500g,按1.2.2项下方法制备溶液,按色
谱条件进样分析,测定峰面积,计算槲皮素及山奈酚
的含量,数据的表示方法为x±SD。
2 结果与分析
2.1 检测波长
对槲皮素和山奈酚对照品溶液进行紫外波长
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
0.000
0.500
1.000
1.500
1
200.0%%%%%%%250.0%%%%%%%%%300.0%%%%%%%%%350.0%%%%%%%400.0%%%%%%%%%%450.0%%%%%%500.0%
波长 /nm
Wavelength
0.000
0.500
1.000
1.500
2
200.0%%%%%%%250.0%%%%%%%%%300.0%%%%%%%%%350.0%%%%%%%400.0%%%%%%%%%%450.0%%%%%%500.0%
波长 /nm
Wavelength
吸
光
度
Ab
so
rb
an
ce
注:1为槲皮素 ,2为山奈酚
Note:1,Quercetin;2,kaempferol.
图1 槲皮素和山奈酚标准品的紫外可见吸收光谱
Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of quercetin
and kaempferol
·76·
卫亚丽 等 HPLC法同时测定地桃花的槲皮素和山奈酚
WEI Yali et al Simultaneous Determination of Quercetin and Kaempferol in Urena lobata by HPLC
010
5
15
20
25
30
信
号
强
度
/m
AU
Si
gn
al
%st
re
ng
th
时间 /min
Time
2.5%%%%%%%%%%5%%%%%%%%%7.5%%%%%%%%10%%%%%%%12.5%%%%%%%%15%%%%%%%17.5%%%%%%%%20
A
10.111
18.665
1
2
0
10
5
15
20
25
30
信
号
强
度
/m
AU
Si
gn
al
%st
re
ng
th
时间 /min
Time
2.5%%%%%%%%%5%%%%%%%%7.5%%%%%%%%10%%%%%%%12.5%%%%%%%%15%%%%%%%17.5%%%%%%%%20
B
1
2
35
40
1.3
20
2.0
13
3.7
08
4.7
46
8.4
95
10
.21
0
18
.84
5
注:1为槲皮素,2为山奈酚,A为混合对照品,B为地桃花
Note:1,quercetin;2,kaempferol;A,control;B,U.lobata.
图2 混合对照品和地桃花中槲皮素及山奈酚的
液相色谱
Fig.2 HPLC chromatograms of standard
and sample of U.lobata
扫描。由图1可知,槲皮素、山奈酚的甲醇溶液在
360nm处均有较大吸收峰且峰形平缓,适于定量测
定,故以360nm作为测定波长。
2.2 色谱条件
试验表明,甲醇与0.4%磷酸水溶液比例为
45∶55时的分离度较好。由图2可知,当甲醇与
0.4%磷酸水溶液比例为45∶55时,按槲皮素峰计
算柱效,理论塔板数大于7 000。槲皮素和山奈酚的
分离度均大于1.5,在此色谱条件下,样品分离良
好。槲皮素的保留时间为10.111min,山奈酚的保
留时间为18.665min。在样品溶液色谱峰中,保留
时间为10.210min的峰对应的物质为槲皮素,保留
时间为18.845min的峰对应的物质为山奈酚。由
于受后运行时间或冲洗时间的影响,样品中槲皮素
和山奈酚的保留时间与标准品不完全一致,但在误
差允许的范围内。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系 按1.5.1方法所述,以对照品
溶液浓度(μg/mL)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制
标准曲线,槲皮素、山奈酚标准曲线回归方程、相关
系数及线性范围分别为y=43.85x-24.02,r=
0.999 8和y=29.85x-13.24,r=0.999 9。槲皮
素及山奈酚在2.500~25.00μg/mL线性关系良
好。
2.3.2 精密度 通过连续5次进样,槲皮素及山
奈酚的RSD分别为0.98%和0.79%,均小于2% ,
表明该方法精密度良好。
2.3.3 稳定性 同一供试品溶液在0h、2h、4h、
8h、10h测定,根据峰面积计算槲皮素及山奈酚的
RSD分别为1.36%和1.13%,表明供试品溶液在
10h内稳定性良好。
2.3.4 回收率 从表1可知,该测定方法测定地
桃花中槲皮素的平均回收率为100.85%,RSD 为
2.37%;山奈酚的平均回收率为100.95%,RSD 为
2.10%。表明,该测定方法的准确度高。
表1 槲皮素及山奈酚的回收率*
Table 1 Results of recovery tests of quercetin and kaempferol
标准品
Standards
样品含量/mg
Sample
content
加标量/mg
Adding
quantity
测得量/mg
Measured
amount
回收率/%
Recoveryrate
平均回收率/%
Average
recovery rate
RSD/%
槲皮素 266.75 300 568.55 100.60
Quercetin 266.75 260 524.07 98.97
266.75 260 536.53 103.76 100.85 2.37
266.75 210 482.50 102.74
266.75 210 206.14 98.16
山奈酚 198.75 230 432.50 101.63 100.95 2.10
Kaempferol 198.75 200 395.47 98.86
198.75 200 402.45 101.85
198.75 160 364.61 103.66
198.75 160 356.70 98.72
注:*(n=5)
Note:*(n=5)
2.4 不同采集批次地桃花的懈皮素及山奈酚含量
从表2可知,不同采集批次地桃花中槲皮素含
量相差不大,最大的为(1.067±0.02)mg/g,最小
的为(1.016±0.02)mg/g;不同采集批次地桃花中山
奈酚含量相差较大,最大的为(1.232±0.03)mg/g,最
小的为(0.572±0.02)mg/g。由此说明,地桃花中
槲皮素含量受采集批次影响较小,而山奈酚含量受
采集批次的影响较大。可以看出,地桃花药材质量
因植株个体情况存在较大的差异。
表2 不同采集批次地桃花中槲皮素、山奈酚的含量*
Table 2 The content of quercetin and kaempferol in
U.lobatain different colection time
样品编号
Sample
number
槲皮素含量/(mg/g)
Quercetin
content
山奈酚含量/(mg/g)
Kaempferol
content
20130205 1.016±0.02 0.572±0.02
20140213 1.067±0.02 0.795±0.02
20140117 1.023±0.02 1.232±0.03
注:*(n=3)
Note:*(n=3)
·86·
贵 州 农 业 科 学
Guizhou Agricultural Sciences
3 讨论与结论
关于同时测定中药中的槲皮素和山奈酚含量的
文章已有较多报道,参考文献[15]的条件进行测定
时发现,该条件下虽然能使山奈酚、槲皮素与其他成
分分离,但峰形不太好。故尝试把流动相的甲醇-
0.4% 磷酸溶液(60∶40)改为甲醇-0.4%磷酸溶
液(45∶55),峰形有较大的改善,相邻两物质完全分
离。因此,选用甲醇-0.4% 磷酸溶液 (45∶55)作
为流动相。
试验结果表明:用 C18 色谱柱 (100 mm×
4.6mm,5μm),以甲醇-0.4%磷酸水溶液(45∶
55)为流动相,流速0.8mL/min,检测波长360nm,
进行测定槲皮素和山奈酚的线性范围均为2.500~
25.00μg/mL,相关系数 r分别为 0.999 7 和
0.999 9,精密度RSD 分别为0.98%和0.79%,稳
定性试验RSD分别为1.36%和1.13%,加样回收
率RSD 分别为2.37%和2.10%。该方法简便可
行,重现性好,精密度高,结果可靠。试验比较了3
个不同采集批次地桃花中槲皮素和山奈酚的含量,
其中,槲皮素的含量以2014年2月13日采集的地
桃花含量,为(1.067±0.02)mg/g,2013年2月5
日采集的地桃花含量最低;山奈酚的含量以2014年
1月17日采集的最高,为(1.232±0.03)mg/g。
[参 考 文 献]
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(责任编辑:孙小岚
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(责任编辑:孙长青)
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卫亚丽 等 HPLC法同时测定地桃花的槲皮素和山奈酚
WEI Yali et al Simultaneous Determination of Quercetin and Kaempferol in Urena lobata by HPLC