全 文 ： 实验研究
收稿日期:2007 - 01 -08
山梗菜碱有效改善 6-OHDA诱导偏侧鼠帕金森病的研究
栗超跃 ,史锡文 ,张建国 ,周伟 ,柴昌 ,李玉 ,步星耀
(河南省人民医院神经外科 , 郑州 450003)
　　摘要:目的　研究山梗菜碱对 6-OHDA诱导鼠帕金森病的治疗作用 。方法　6-OHDA诱导制作的偏侧鼠
帕金森病模型检测山梗菜碱对帕金森病的治疗作用 , TH免疫检测多巴胺能神经细胞 ,偏侧旋转试验行行为学
检测 。结果　通过 TH免疫组化显示:山梗菜碱可以达到保护黑质多巴胺能神经元的作用 (P <0. 05);行为学
试验显示:山梗菜碱可以有效改善运动障碍 (P <0. 05)。结论　首次研究显示山梗菜碱有效改善 6-OHDA诱
导的偏侧鼠帕金森病运动障碍 ,对帕金森病具有潜在的治疗价值 。
关键词:山梗菜碱;帕金森病;6-OHDA
中图分类号:R739. 4　　　文献标志码:A　　　文章编号:1006 - 1959(2007)03 - 0244 - 03
Effect of Lobeline on 6 -OHDA - inducedRatM odel of Parkinson’ sD isease
LI Chao - yue, SH IX i-wen, ZHANG Jian - guo, et al
(Department ofNeu rosu rgery, Henan Provincial Peop lesHosp ital, Zhengzhou 450003,Henan P rovince, China)
Abstract:Objective　Study on effect of lobeline on 6-OHDA-treated ratM odel of Parkinson’ sD isease.M ethods
　Rat treatedwere exam ined by behavioral tests(emetomorph ine - induced rotation) and tyrosine hyd roxylase (TH )
immunohistochem istry was stained to dopam inergic neu rons in substan tia nigra. Results　The resu lts demonstrated lo-
beline cou ld increased sign ificantly TH positive neu rons in substan tia n igra and reversed locomotor deficits detected in
MPTP - treated m ice(P <0. 05). Conclusions　Lobeline may be usefu l to treat symptoms in Park inson’ s disease and
protect dopam inergic neurons again st neurotoxin in vivo.
Key words:lobeline;Park inson’ sD isease;6 -OHDA
　　山梗菜碱是一种亲脂性的非吡啶生物碱 ,为半边
莲属的一个主要成分 。山梗菜碱被发现具有对黑质多
巴胺能细胞内多巴胺递质分布调节作用 ,提高细胞外
多巴胺浓度 [ 1] ,而帕金森病 (Pa rkinson’ s D isease, PD)
的病理生理特征就是黑质纹状体系统多巴胺显著减少
造成的 ,那么 ,山梗菜碱是否具有改善 PD的作用是本
文研究的目的。
1　材料与方法
1. 1　材料
SD鼠由中科院上海生命科学院动物中心提供;山
梗菜碱 、 6 - OHDA和兔抗鼠洛氨酸羟化酶 ( ty rosine
hydroxy lase, TH)抗体购自 S igm a公司;免疫组化按试
剂盒购自上海实生公司。
1. 2　方法
1. 2. 1　偏侧多巴胺能神经元损毁 Sprague - D aw ley
(SD)大鼠的制作 [ 2]
模型按文献 [ 2]制作:SD大鼠 (210±20)g 14只 ,
雄性 ,用 10%水合氯醛 (3 m l /kg)麻醉 ,固定于立体定
向仪上(且牙杆置于内耳线下 3. 3mm),头部常规备皮
消毒 ,按以下靶点做头皮切口 、钻孔 ,前脑内侧束:前囟
后 4. 4 mm、矢中线旁 1. 2 mm、硬膜下 7. 8 mm ,注射 2
μl的 5μg /μl的 6-羟基多巴胺 (sigma)。术后四周平
稳后用药行旋转行为 、络氨酸羟化酶免疫组化检测中
脑黑质细胞损伤程度损伤情况 ,其中阿朴吗啡 (0. 25
mg /kg)皮下注射诱发旋转行为 ,以 360°旋转≥7转 /
m in为成功模型 。
1. 2. 2　免疫组化染色
大鼠用 10%水合氯醛麻醉后 4%多聚甲醛灌注 ,
取脑组织后再在 4%多聚甲醛固定 24 h,随后再 25%
蔗糖溶液中浸泡 48 h,行冰冻切片;TH免疫组化按试
剂盒说明书操作 (漂浮法 ):漂洗 ,甲醇处理 , 0.02%
TritonX-100的 3%羊血清 , 4℃ 24 h;不漂洗 ,直接加含
有 0.02%TritonX-100兔抗鼠 TH抗体 (含有 3%羊血
清), 4℃ 24 h,加入二抗 , 37℃, 60m in,染色 ,显微镜下
控制 。
244 　M edica l Info rm a tion Section of Opera tive Surgery. M ar. 2007. Vo.l 20. No. 3　
1. 2. 3　药物实验
术后四周实验 ,挑选 10只符合要求大鼠 ,用药前
一天检测阿朴吗啡诱发旋转行为 ,用药后 5 m in开始
记录 15 m in的旋转次数 ,第二天腹腔注射山梗菜碱(3
mg /kg), 10 m in后重复前一天的实验 ,记录大鼠旋转
次数 ,每周 1次 ,连续 3周。
1. 2. 3　纹状体突触体多巴胺摄取实验
实验按文献 [ 3]进行:断颈处死 SD大鼠 ,分离出纹
状体 ,称量后置于预冷的玻璃匀浆器 , 0. 32M蔗糖 /PBS
溶液中匀浆;离心 , 1000 g, 10 m in,取上清 ,用 N a+-KRH
溶液悬浮;加入 10μl 1. 5 μM [ 3H ] DA ,同时加入 10μl
山梗菜碱 ,加入 10 μl突触体悬浮液 , 37℃温育 10 m in,
用 Li+-KRH设阴性对照 ,替代 Na+-KRH;加 1. 2 m l冰
浴的 Li+-KRH溶液结束反应 ,离心 , 12 000 g, 10m in,弃
上清 ,重复一次 ,加入 50μl2N的 N aOH于室温裂解 30
m in;加入 1. 2 m l闪烁液 ,摇匀 ,放入闪烁杯 ,用液闪计数
器测 DPM I值;重复三次 ,取均数。
2　统计学处理
采用 SPSS 10. 0统计软件包处理 ,数据以 Mean±
SD表示 , P =α<0. 05为统计学有显著意义 。
3　结果
3. 1　6-OHDA制作偏侧多巴胺能神经元损伤模型
6-OHDA可以选择性损毁多巴胺能神经元 ,造成 SD大
鼠偏侧黒质纹状体多巴胺通路选择性部分损毁 , TH免
疫组化显示正常鼠黑质多巴胺能神经元和损伤后多巴
胺损失可达到 70%以上 (图 1A , B);阿朴吗啡是多巴
胺能神经元突触后膜受体激动剂 ,由于受损侧多巴胺
受体敏感度增加 ,用药后大鼠向对侧旋转 ,以此作为多
巴胺能神经元受损程度的行为判定标准。
3. 2　偏侧旋转实验检测山梗菜碱的治疗作用
立体定向制作 SD大鼠后四周检测山梗菜碱治疗
作用 ,偏侧部分损伤的 SD大鼠应用腹腔注射山梗菜
碱(3mg /kg),应用阿朴吗啡后检测旋转次数 、结果如
表 1示 ,统计学处理后显示用药后 SD鼠向对侧旋转次
数显著减少 ,有统计学意义 , P =0. 000335<0. 05,表明
山梗菜碱可降低鼠 PD对阿朴吗啡的敏感度。
表 1　山梗菜碱腹腔注射前后模型鼠 15分钟旋转次数(次数 /15分钟)
序号 第一次用药前 用药后 差值
第二次
用药前 用药后 差值
第三次
用药前 用药后 差值
1 197 117 - 80 113 122 +9 143 120 -23
2 142 98 - 44 146 133 - 13 156 139 -17
3 129 136 +7 181 181 0 159 139 -20
4 174 155 - 19 123 153 +30 177 169 - 8
5 176 127 - 49 119 80 - 39 165 154 -11
6 175 168 - 7 181 121 - 60 181 186 +5
7 193 198 +5 220 203 - 17 273 226 -47
8 211 174 - 37 177 184 +7 234 220 -14
9 139 92 - 47 104 90 - 14 116 102 -14
10 231 215 - 16 216 216 0 313 315 +2
　　注:P<0. 05,用药前后 SD鼠偏侧旋转次数差异有显著性。
245　医学信息手术学分册 2007年 3月第 20卷第 3期　
3. 3　纹状体突触体的摄取实验
为了明确山梗菜碱是通过作用于多巴胺突触体前
膜改变突触间隙多巴胺浓度达到改善 6-OHDA诱导 ,
取出刚刚处死的 SD鼠纹状体突触体测量多巴胺转运
活性 ,结果显示(图 3):山梗菜碱可有效的抑制多巴胺
摄取 ,并且具有浓度依赖效应 (0. 01 ～ 200 μm ), P <
0.05,与不加山梗菜碱相比较差异有显著性 ,而且 ,山
梗菜碱在较低浓度下 (0. 01 ～ 1 μm)可以有效抑制突
触体的摄取 , IC50≈0. 05μm。
图 2　山梗菜碱抑制纹状突触体摄取多巴胺
*P <0. 05, 用药组与阴性对照组比较差异有显著性
4　讨论
本研究用 6-OHDA诱导的帕金森病鼠模型检测山
梗菜碱的可能应用价值 ,应用行为学实验评价动物运
动障碍 。结果显示 6-OHDA立体定向注射前脑内侧
束 ,因 TH为多巴胺能神经元所特有 ,免疫染色后证明
黑质多巴胺能神经元损伤 、丢失达 70%以上 ,阿扑吗
啡证实模型有效;应用山梗菜碱后 ,再次检测模型鼠对
阿扑吗啡的敏感度 ,结果显示可显著减少旋转次数 ,有
效改善动物运动障碍;为了进一步证明山梗菜碱可直
接作用黑质纹状体系统 ,选择纹状体突触体多巴胺抑
制实验检测山梗菜碱作用位点 ,结果显示山梗菜碱可
有效抑制突触体摄取多巴胺 ,间接提示山梗菜碱对多
巴胺系统的作用机理可能是改变细胞内外多巴胺的分
布 ,这与以往的认识是相同 。
笔者选择山梗菜碱作为为 PD的治疗药物是根据
前期工作(另文发表)发现山梗菜碱是多巴胺转运蛋
白 (dopam ine transpo rt prote in , DAT)的有效抑制因子 ,
因为多巴胺转运蛋白抑制因子作为 PD的后选药物已
经有相关研究 ,证明是有效的[ 4] ;同时 ,在多个大型流
行病学调查中发现吸烟的人群患 PD危险性要比没有
吸烟嗜好的人群低 2倍 ,也就是说 ,在烟草成分中具有
预防多巴胺能神经元免受损伤的成分 , 尼古丁作为主
要成分首先备用于实验 ,被证明有效 ,而山梗菜碱与尼
古丁具有许多相似的药理作用[ 5] ;另外 ,研究也发现山
梗菜碱可以促进多巴胺释放细胞间隙 ,也即可以有效
提高突触间隙多巴胺浓度 [ 6] ;在笔者的实验中是抑制
多巴胺摄入细胞内而提高胞外浓度 ,综合以上三方面
促使笔者选择山根菜碱作为 PD治疗潜在应用药物 ,
结果也证明山梗菜碱具有改善 SD鼠 PD运动障碍的
效能;另外 ,山梗菜碱用药安全范围广 ,没有中枢依赖
性 ,有效抑制 DAT,对于与 DAT相关的药物成瘾的替
代治疗可能有潜在的价值;此外 ,山梗菜碱也有可能对
各种与多巴胺递质紊乱密切相关的中枢疾病具有潜在
治疗作用 ,如颅脑外伤 、睡眠障碍 、强迫症 、焦虑症 、重
症肌无力 、帕金森病 、精神分裂症 、注意力缺损病等。
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(本文编辑:杨智华)
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