全 文 ：Efectofcalcitonin-relatedgeneonmyocardiallipid
peroxidationinseverelyscaldedrats
HuDelin, FangLinsen, YuYouxin, etal
(DeptofBurns, TheFirstAfiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity, Hefei　230022)
Abstract　Objective　ToexploretheprotectiveefectsofintravenousCGRPonmyocardialinjuryintermsoflipid
peroxidationinseverelyscaldedrats.Methods　Wistarratswith30% TBSAⅢ °scaldwererandomlydividedinto
twogroups:thegrouptreatedwithsinglefluidresuscitationandthegrouptreatedwithfluidresuscitationandintra-
venousCGRPafterscald.TheserumcTnT, MDAandSODinmyocardialtissueinratsatdiferenttimespostscald
weremeasured.Results　SerumcTnTandtissueMDAlevelsincreasedsignificantlyandtissueSODdecreasedsig-
nificantlyinsinglefluidresuscitationgroup, inthefluidresuscitationandintravenousCGRPtreatmentgroup, and
therangeoftheabovechangeswerelowerthanthatinthesinglefluidresuscitationgroup.Corelationanalysis
showedthatthechangesbetweenserumcTnTandtissueMDAlevelswerepositivelycorelated;whiletherelation-
shipbetweenserumcTnTandtissueSODwasnegative.Conclusion　IntravenousCGRPhasprotectiveefecton
myocardialinjuryproducedbyseverescaldinrats;inhibitionoflipidperoxidationmaybeitsimportantmechanism.
MeSH　calcitoningene-relatedpeptide;myocardium;lipidperoxides;rats;burns
◎药学研究◎
山香圆总黄酮对免疫功能低下
小鼠免疫功能的影响
张　磊1 ,李　俊 1 ,余世春 2 ,吕雄文1 ,金　涌 1 ,胡成穆 1 ,李　荣1
摘要　目的　探讨山香圆总黄酮(TFS)对免疫抑制小鼠免
疫功能的影响。方法　在腹腔注射环磷酰胺(Cy)诱导小鼠
免疫低下模型的基础上 , 采用碳廓清实验检测小鼠巨噬细胞
的吞噬功能;分光光度法测定血清及脾细胞中溶血素水平;
二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应 ,并用流式细胞仪检测
T细胞亚群。结果　TFS(240、480 mg/kg, ig)可明显提高 Cy
诱导免疫功能低下小鼠的吞噬指数 a值和校正指数 K值 、增
加 Cy诱导免疫功能低下小鼠脾细胞和血清中溶血素水平 ,
增强 Cy诱导免疫低下小鼠的迟发性变态反应。进一步研究
发现 , TFS(240 mg/kg, ig)可明显提高 CD4 +、CD8 +细胞
数 , 使 CD4+/CD8+细胞比值上升。结论　TFS能明显改
善 Cy致免疫功能低下小鼠的免疫功能 ,其免疫调节作用与
调节 T细胞亚群有关。
2006 -04-15接收
基金项目:安徽医科大学科学技术研究基金(编号:200419)
作者单位:1 安徽医科大学药学院 ,合肥　 230032
2 安徽省安泰医药生物技术有限责任公司 ,合肥　230061
作者简介:张　磊 ,女 , 32岁 ,讲师 ,博士研究生;
李　俊 ,男 , 43岁 ,教授 , 博士 ,博士生导师 , 责任作者 , E-
mail:amuicplj@mail.hf.ah.cn
主题词　黄酮类 /药理学;免疫 /药物作用;溶血素类;超敏
反应
中图分类号　R282.71;R961.1
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2006)05-0539-05
　　山香圆(turpiniaargutaseen)为我国传统中草
药 ,性味辛 、温 ,盛产于江西省赣南地区 ,具有较好的
抗菌消炎作用 。民间用鲜叶水煎内服治疗扁桃体
炎 、咽喉炎 ,预防感冒 ,或鲜叶捣烂外敷治疗疮疥 ,均
有显著疗效。在对山香圆叶化学成分研究中发现其
醇提物中含有熊果酸 、 2α-羧基熊果酸 、α-香树脂 、
2α-过氧羟基熊果酸 、肉豆蔻等 [ 1] 。就其研究情况来
看 ,国内主要集中在对其化学成分和抗菌药理作用
的研究上 ,国外则鲜有报道 。山香圆总黄酮 (total
flavonoidsofturpiniaargutaseen, TFS)是从山香圆中
提取的有效部位 ,总黄酮含量达 75%。目前有关山
香圆提取物总黄酮的免疫作用的研究还未有报道 ,
为此 ,本文观察了 TFS对环磷酰胺(Cy)致免疫低下
小鼠多项免疫指标的影响 ,旨在全面了解其对机体
·539·安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2006 Oct;41(5)
免疫功能的调节作用 。
1　材料
1.1　动物　昆明种小鼠 、BALB/C小鼠及豚鼠 ,普
通级 ,均由安徽医科大学实验动物中心提供。
1.2　药品与试剂　TFS为安徽省安泰医药生物技
术有限责任公司提供 , 棕黄色粉末 , 总黄酮含量
70%。山香圆 ,江西山香药业有限公司产品 ,批号:
9906263。雷公腾多苷片 ,上海医科大学红旗制药厂
生产 ,批号:020201。 Cy,上海华联制药有限公司产
品 ,批号:20020601。绵羊红细胞 ,安徽省防疫站提
供 。印度墨汁 ,英国 Winsor＆Newton产品。 2, 4—二
硝基氟苯 ,上海试剂一厂产品 ,批号:950601。丙酮 ,
国营南京化学试剂一厂产品 ,批号:01091640。 PE-
CD4-Ab和 FITC-CD8-Ab,由美国 INC公司提供 ,批
号 LMCD0401。
1.3　仪器与设备　电子天平 BP211D,德国 Sartari-
us生产。 SW-CJ-IF型超净工作台 ,江苏苏净集团苏
州安泰空气技术有限公司产品。高速冷冻离心机 ,
湖南离心机厂产品。 SHY-2型水浴恒温振荡器 ,江
苏金坛市振兴仪器厂产品 。多功能显微镜 , OLYM-
PUS产品 。分光光度仪 722S,上海精密科学仪器公
司产品 。多管架自动平衡离心机 TDZ5,长沙湘仪离
心机仪器有限公司产品。电热恒温水浴锅 GSY-8,
北京医疗设备厂意成公司产品 。 COULTZEREPICS
XL-MCL流式细胞仪 ,美国 BeckmanCounter公司产
品 。
2　方法
2.1　Cy诱导免疫低下小鼠碳廓清实验-巨噬细胞
吞噬功能测定 [ 2] 　昆明种小鼠 , ♀♂各半 ,体重 18
～ 22 g, 随机分组 ,每组 10只 , 即正常组 、模型组
(Cy)、TFS(120、240、480 mg/kg)组 、阳性药组(山
香圆8 880 mg/kg, 雷公藤多苷 60 mg/kg)。灌胃
(ig)给药 ,每天 1次 ,连续 5 d。第 3天每只小鼠腹
腔注射(ip)Cy50 mg/kg,每天 1次 ,连续 2 d。第 5
天每鼠尾静脉注入离心后 2倍稀释的印度墨汁 , 2
和 10 min后分别从眼球取血 40 μl,并将其加到 4
ml0.10% Na2CO3溶液中 ,用 722分光光度计在 600
nm波长处测光密度值 (OD), 以正常小鼠血加
Na2 CO3溶液作空白对照。称体重和肝脾重量 ,并按
下列公式计算碳廓清指数 K和吞噬指数 a。
K=LgOD2-LgOD10 /t10 -t2
吞噬指数 a=体重(g)肝脾重(g)×
3 K
2.2　 Cy诱导免疫低下小鼠血清中 IgM的测
定[ 3-4] 　昆明种小鼠 , ♀♂各半 ,体重 18 ～ 22 g,随
机分组 ,每组 10只 ,即正常组 、模型组(Cy)、TFS
(120、240、480 mg/kg)组 、阳性药组(山香圆 8 880
mg/kg,雷公藤多苷 60 mg/kg)。 ig给药 ,每天 1次 ,
连续 7 d。第 3天每鼠 ip10%的 SRBC0.2 ml致敏。
致敏同时 ipCy50 mg/kg,连续 2 d。致敏后第 5天 ,
摘除免疫小鼠眼球取血 ,把收集的血清作 800倍稀
释后 , 吸取 0.5 ml稀释的血清放入另一试管中 ,依
次加入 10% SRBC、补体 、生理盐水各 0.5 ml, 空白
管用生理盐水代替血清 , 混匀 , 置 37℃温箱温育 1
h, 离心(3 000 r/min), 5 min, 取上清液 , 用 722分
光光度计(波长 540 nm)测 OD值 。
2.3　Cy诱导免疫低下小鼠血清中 IgG的测定 [ 3 -4]
　测定 IgG时于第一次致敏后第 5天同剂量再次致
敏 ,再次免疫后第 8天眼球取血 ,放血的试管置室温
中数小时或放 4 ℃冰箱过夜 , 离心分离血清。把血
清加等量 2-巯基乙醇后 37 ℃水浴保温 0.5 h,随后
将血清 800倍稀释 。取 2-巯基乙醇处理后的血清
0.5 ml和 5 % SRBC0.5 ml,充分混匀 ,再加羊抗小
鼠 IgG和补体各 0.5 ml,空白管以 0.5 mlNS代替血
清。置 37 ℃温箱温育 1 h, 离心 (3 000 r/min, 10
min),取上清液 ,用 722分光光度计(波长 540 nm)
测 OD值 。
溶血素含量(hemolysinconcentration, HC)计算:
HCIgM =样本稀释血清的 OD×稀释倍数
HCIgG =2 -巯基乙醇处理样本血清的 OD值 ×
稀释倍数
2.4　Cy诱导免疫低下小鼠脾细胞溶血素生成的
测定 [ 3 ～ 5] 　昆明种小鼠 , ♀♂各半 ,体重 18 ～ 22 g,
随机分组 ,每组 10只 ,即正常组 、模型组(Cy)、TFS
(120、240、480 mg/kg)组 、阳性药组(山香圆 8 880
mg/kg,雷公藤多苷 60 mg/kg)。 ig给药 ,每天 1次 ,
连续 7 d。第 3天每鼠 ip10% SRBC0.2 ml致敏。
致敏同时 ipCy50 mg/kg,连续 2 d。致敏后第 5天 ,
放血致死 ,用冷的 Gey液制成脾细胞悬液(5 ×109 /
L),然后取试管若干只 ,每管依次加入脾细胞悬液 、
0.2% SRBC、1 ∶10豚鼠血清各 0.5 ml,另设不加补
体的空白对照 。置 37 ℃水浴温浴 1 h,离心(3 000
r/min)5 min,取上清液 。用 722分光光度计(波长
413 nm)测吸光度 。
2.5　迟发型超敏反应
·540· 安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2006 Oct;41(5)
2.5.1　Cy诱导免疫低下小鼠的迟发型变态反应 [ 6]
　BALB/C小鼠 ,体重(20 ±2)g, ♀、♂各半 , 随机
分组 ,每组 10只 , 即正常组 、模型组 (Cy)、TFS
(120、240、480 mg/kg)组 、阳性药组(山香圆 8 880
mg/kg,雷公藤多苷 60 mg/kg)。 ig给药 ,连续 9d。
第 3天除抗原攻击的对照组外 ,每鼠腹部涂 1%二
硝基氟苯丙酮麻油溶液 50μl致敏 (范围 3 cm×3
cm),第 2天同剂量强化一次 ,同时 ipCy50 mg/kg,
连续 2 d。致敏 5 d后 ,将 1% DNFB溶液均匀涂抹
于小鼠右耳(两面)进行攻击 ,对照组同样涂耳但未
致敏。攻击 24 h,颈椎脱臼处死小鼠 ,剪下左右耳
壳 ,用 9 mm的打孔器打下圆耳片 ,称重 。以左右
耳片之差为肿胀度。
2.5.2　免疫荧光法测定 Cy诱导免疫低下 DTH小
鼠 T淋巴细胞亚群[ 7] 　分组及给药方法如上 ,第 9
天小鼠放血处死后取脾 ,用 PBS常规制备脾细胞悬
液 ,加入 0.84%的氯化铵溶液 2ml使红细胞裂解 ,
调整脾细胞悬液浓度为(5 ×107 /L),取脾细胞悬液
10 μl、PBS1 ml加入离心管中 , 1 000 r/min离心 5
min去上清。取 5 μlPE-CD4-Ab和 10 μlFITC-
CD8-Ab,依次加入离心管中 , 混匀后避光反应
30min,送流式细胞仪测定 CD4 +和 CD8+细胞数 。
2.6　剂量设置　阳性对照药:山香圆:小鼠(8 880
mg/kg)为生药剂量;雷公藤多苷(60 mg/kg)剂量为
人常用有效剂量经体表面积折算。 TFS与山香圆按
有效成分相当 ,为成药剂量 。
2.7　统计学处理　结果以 x±s表示 ,各组均数之
间比较采用 SPSS10.0统计软件进行方差分析及
Studentt检验 。
3　结果
3.1　TFS对 Cy诱导免疫低下小鼠单核 -巨噬细
胞系统碳廓清的影响　结果如表 1所示 , Cy组小鼠
的吞噬指数 a值和校正指数 K值明显低于正常对照
组(P<0.01),而 TFS(240、480 mg/kg)可显著提高
Cy致免疫低下小鼠的吞噬指数 a值和校正指数 K
值 ,提高免疫低下小鼠的巨噬细胞吞噬功能。
3.2　TFS对 Cy诱导免疫低下小鼠血清中 IgM水
平的影响　用分光光度法测定血清中 IgM水平 。
结果如表 2所示 , Cy组小鼠血清中 IgM水平明显低
于正常对照组 (P<0.01), TFS(120、 240、480 mg/
kg)ig×7 d可显著提高 Cy致免疫低下小鼠血清中
IgM水平。
表 1　TFS对 Cy诱导免疫低下小鼠单核 -巨噬细胞
系统碳廓清的影响(n=10, x±s)
组别 剂量(mg/kg) 碳廓清系数 K 吞噬指数 a
正常 - 0.061+0.006 7.58 +0.67
Cy 50 0.047+0.008■■ 6.55 +0.37■
TFS 120 0.051+0.007＊ 7.11 +0.74
240 0.057+0.008＊ 7.29 +0.73＊
480 0.060+0.007＊＊ 7.36 +0.82＊
山香圆 8 880 0.054+0.005＊■ 7.09 +0.60＊
雷公藤多苷 60 0.046+0.008■■ 6.47 +0.42■■
　　与正常组比较:■P<0.05, ■■ P<0.01;与 Cy组比较:＊ P<
0.05, ＊＊P<0.01
表 2　TFS对Cy诱导免疫低下小鼠血清中IgM
水平的影响(n=10, x±s)
组别 剂量(mg/kg) HCIgM
正常 - 381.3 +52.6
Cy 50 298.2 +40.5■■
TFS 120 249.6 +33.6■■
240 340.5 +39.8＊
480 366.0 +37.9＊＊
山香圆 8 880 315.2 +44.1■
雷公藤多苷 60 230.9 +26.0 ＊＊■■
　　与正常组比较:■P<0.05, ■■ P<0.01;与 Cy组比较:＊ P<
0.05, ＊＊P<0.01
3.3　TFS对 Cy诱导免疫低下小鼠血清中 IgG水
平的影响　结果如表 3所示 , Cy组小鼠血清中 IgG
水平明显低于正常对照组 (P<0.01), TFS(120、
240、480 mg/kg)可显著提高 Cy致免疫低下小鼠血
清中 IgG水平。
表 3　TFS对 Cy诱导免疫低下小鼠血清中 IgG
水平的影响(n=10, x±s)
组别 剂量(mg/kg) HCIgG
正常 - 240.0 +23.7
Cy 50 118.1 +19.6■■
TFS 120 225.2 +19.7＊＊
240 206.9 +23.6＊＊■■
480 244.4 +27.5＊＊
山香圆 8 880 237.5 +22.0＊＊
雷公藤多苷 60 114.1 +19.1■■
　　与正常组比较:■P<0.05, ■■ P<0.01;与 Cy组比较:＊ P<
0.05, ＊＊P<0.01
3.4　TFS对 Cy诱导免疫低下小鼠脾细胞溶血素
生成的影响　结果如表 4所示 , Cy组小鼠脾细胞溶
血素水平明显低于空白对照组 (P<0.01), TFS
(240、480 mg/kg)可显著提高 Cy致免疫低下小鼠
脾细胞溶血素的生成。
·541·安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2006 Oct;41(5)
表 4　TFS对 Cy诱导免疫低下小鼠脾细胞溶血素
生成的影响(n=10, x±s)
组别 剂量(mg/kg) HCIgM
正常 - 0.26+0.06
Cy 50 0.11+0.01■■
TFS 120 0.11+0.02
240 0.36+0.05＊＊■■
480 0.22+0.03＊＊
山香圆 8 880 0.27+0.04＊＊
雷公藤多苷 60 0.10+0.02■■
　　与正常组比较:■■P<0.01;与 Cy组比较:＊＊P<0.01
3.5　TFS对 Cy诱导免疫低下小鼠迟发性变态反
应的影响　结果如表 5所示 ,与正常组相比 , Cy模
型组小鼠耳肿胀程度明显减轻 , TFS(120、480 mg/
kg)可明显拮抗 Cy致免疫低下小鼠的 DTH反应 ,并
以 480 mg/kg的剂量最为显著 。
表 5　TFS对Cy诱导免疫低下小鼠 DTH
反应的影响(n=10, x±s)
组别 剂量(mg/kg) 耳肿胀度(g)
正常 - 2.20±0.33
Cy - 1.62±0.23■■
TFS 120 1.83±0.38■
240 2.0±0.39＊
480 2.12±0.34＊＊
山香圆 8 880 2.1±0.55＊
雷公藤多苷 60 1.71±0.56■
　　与正常组比较:■P<0.05, ■■P<0.01;与 Cy组比较:＊ P<
0.05, ＊＊P<0.01
3.6　TFS对 Cy诱导免疫低下 DTH小鼠 T淋巴细
胞亚群的影响　结果如表 6所示 ,与正常组相比 , Cy
模型组 CD4 +、CD8 +细胞数及 CD4 +/CD8 +细胞
比值均明显下降 , TFS(240 mg/kg)可提高 Cy致免
疫低下小鼠的 CD4 +、CD8 +细胞数 ,使 CD4 +/CD8
+细胞比值上升 。
4　讨论
单核巨噬细胞系统(网状内皮系统 , reticuloen-
dothelialsystem, RES)是机体非特异性免疫系统的
重要组成部分 ,能迅速清除多种致病物质 ,是维持机
体内环境稳定的一个重要系统。而单核巨噬细胞的
吞噬能力又是衡量机体非特异性免疫功能的标志之
一[ 8] 。小鼠碳廓清实验中所测得的廓清指数 K可
反映网状内皮系统的吞噬功能 ,吞噬指数 a则反映
单核 -巨噬细胞的吞噬能力 [ 9] 。本实验结果发现 ,
TFS(240、480 mg/kg)可明显提高 Cy诱导免疫功能
低下小鼠的吞噬指数 a值和廓清指数 K值 。提示
TFS可提高 Cy致免疫低下小鼠的巨噬细胞吞噬功
能。
针对病原微生物 ,体液免疫肩负着抗感染 、免疫
调理等作用 ,并通过产生抗体与对应的抗原特异性
结合产生各种生物学效应。血清中溶血素水平测定
是将致敏动物血清中循环抗体-IgM或 IgG与 SRBC
一起体外孵育 ,在补体参与下 ,产生溶血反应 ,用分
光光度计测定溶血程度反应抗体形成水平的实
验[ 10] ;脾细胞溶血素测定不仅反映抗体形成细胞的
数量 ,也提示合成抗体的能力[ 11] 。此两项指标均是
检测体液免疫功能的指标。本实验结果显示 , TFS
(120、240、480 mg/kg)可显著提高 Cy致免疫功能
低下小鼠血清中及脾细胞溶血素水平。提示 TFS
可提高 Cy致免疫低下小鼠的体液免疫功能。
迟发型变态反应是依赖细胞免疫的反应 ,在致
敏机体接触过敏原后约 24 h以上才出现 ,病变仅限
于抗原所在的局部组织 ,其实质是变应原引起的 T
细胞介导为主的炎症反应 ,参与此反应的主要有
TH、TD、TC和单核巨噬细胞。变应原使 TH细胞活
化 ,促使形成致敏的 TD和 TC细胞 ,当机体再次接
触相同变应原时 , TD细胞释放出多种淋巴因子 ,导
致反应局部组织发生以单核细胞浸润为主的炎症反
应 ,与机体细胞免疫能力相一致 [ 8] 。小剂量 Cy(50
mg/kg, ip×2d)主要杀伤的是 Th前体细胞 ,造成
DTH抑制 [ 12] 。本研究表明 ,与正常组相比 , Cy诱导
免疫低下小鼠耳肿胀程度明显减轻 , TFS(120、240、
表 6　TFS对 Cy诱导免疫低下 DTH小鼠 T淋巴细胞亚群的影响(n=10, x±s)
组别 剂量(mg/kg) CD4+(%) CD8+(%) CD4+/CD8+
正常 - 56.26 ±5.01 21.64±2.56 2.62±0.33
Cy - 38.67 ±5.99■■ 17.04±3.38■■ 2.29±0.19■
TFS 240 53.66 ±0.53＊＊ 21.44±2.89＊＊ 2.54±0.28＊
山香圆 8880 55.85 ±3.35＊＊ 23.90±2.08＊＊ 2.36±0.27
雷公藤多苷 60 49.33 ±4.96＊＊■ 15.77±1.90■■ 3.14±0.23＊＊■■
　　与正常组比较:■P<0.05, ■■P<0.01;与 Cy组比较:＊P<0.05, ＊＊P<0.01
·542· 安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2006 Oct;41(5)
480 mg/kg, ig)可明显拮抗 Cy诱导免疫低下小鼠
耳肿胀度的减轻。提示 TFS可提高 Cy致免疫低下
小鼠的细胞免疫功能。采用流式细胞仪测定 T淋
巴细胞亚群发现 , Cy组小鼠 CD4 +、CD8 +细胞数
及 CD4 +/CD8 +细胞比值均明显低于正常对照组
(P<0.05),而 TFS(240 mg/kg)可明显提高 CD4
+、CD8 +细胞数 ,使 CD4 +/CD8 +细胞比值上升 。
提示 TFS可通过提高 CD4 +、CD8 +细胞数和调节
T细胞亚群的比例来发挥其免疫调节作用。
综上所述 , TFS对 Cy致免疫低下小鼠的网状内
皮系统吞噬功能 、迟发性超敏反应 ,血清溶血素生成
素生成均有增强作用 。这可能为 TFS治疗免疫低
下 、免疫缺陷性疾病提供理论基础和依据 ,有关详细
作用机制尚待进一步研究阐明 。
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Theefectsoftotalflavonoidsofturpiniaargutaseenontheimmune
functionofimmunosuppressedmiceinducedbycyclophosphamide
ZhangLei, LiJun, YuShichun, etal
(PharmacySchool, AnhuiMedicalUniversity, Hefei　230032)
Abstract　Objective　Tostudytheefectsoftotalflavonoidsofturpiniaargutaseen(TFS)ontheimmunefunction
ofimmunosuppressedmice.Methods　Immunosuppresionwasinducedbycyclophosphamide(Cy, 50 mg/kg, ip,
qd×2 ).Carbonclearance, thehemolysinlevelofserumandsplencyte, Delayed-typehypersensitivityandTlym-
phocytessubsetsweremeasuredrespectively.Results　TFS(240, 480 mg/kg, ig)apparentlyimprovedcarbonic
clearancesofmacrophages, thehemolysinlevelinserumandsplencyteandtheabilityofdelayed-typehypersensi-
tivityinmiceimmunosuppressedbyCy.TFS(240 mg/kg, ig)significantlyincreasedbothCD4 +andCD8 +
cel, especialyinfluencedonCD4 +cel, whichrenderedtheascendingratioofCD4+/ CD8 +cel.Conclusion
　TFScouldpromotetheimmunefunctioninimmunosuppressedmice, whichmightberelatedtoregulatingTcel
subtype.
MeSH　Flavones/pharmacology;immunity/drugefects;hemolysins;hypersensitivity
·543·安徽医科大学学报　ActaUniversitatisMedicinalisAnhui　2006 Oct;41(5)