全 文 ：鹅掌柴炭疽病病原菌鉴定
黄江华， 叶益丽
（仲恺农业工程学院农学院，广东 广州 510225）
摘 要：从广州地区采集鹅掌柴炭疽病病叶，经分离培养、致病性接种和再分离，并结合传统形态特征和扩增 ITS 片段对病原
菌进行鉴定。 结果表明，引起广州地区鹅掌柴炭疽病的病原菌是胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）。
关键词：鹅掌柴； 炭疽病； 鉴定
中图分类号：S436.8 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2012）16－0069-03
Identification of the anthracnose of Schefflera actinophylla
HUANG Jiang-hua, YE Yi-li
（College of Agronomy, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China）
Abstract: Anthracnose pathogen was isolated from Schefflera actinophylla, and species identification with the morphological
character, pathogencity on plants and the sequence of ribosomal DNA -ITS were studied. The results indicated that the anthracnose
pathogen of Schefflera actinophylla belonged to the species Colletotrichum gloeosporioides Penz. in Guangzhou.
Key words: Schefflera actinophylla; anthracnose; identification
随着我国经济发展和人民生活水平的不断提高 ，
花卉作为美化人们生活的精神消费品在全国各地悄然
兴起，并迅速扩大。 花卉普遍受人们喜爱，具备较高的
经济价值和较好的社会效益和生态效益， 具有种类繁
多、花色丰富、装饰效果强、美化速度快等优点。 随着城
市建设的发展， 近年来花卉更被广泛应用于园林绿地
中。 随着生产规模逐渐扩大，道路、河道绿化及其他园
林绿地的应用更加广泛， 但花卉病害的种类也随之增
多，危害程度加重，直接影响了花卉的观赏效果与经济
价值。
花卉病害是制约花卉产业可持续发展的一个重要因
素。 在花卉病害中，以真菌性病害发生最普遍，分布广，危
害大，如褐斑病、炭疽病、叶斑病、黑斑病、立枯病、煤烟
病、疫霉病等 [1]。 对花卉病害的研究及其控制越来越受到
地方政府以及大型花卉种植企业的重视。
鹅掌柴 Schefflera actinophylla (Endl.) Harms. 隶属五
加科，为常绿灌木，植株姿态优雅，是一种深受人们喜爱
和种植较多的常绿观叶木本花卉植物， 可用于公园、花
坛、路边的绿化或盆栽置于庭园和室内观赏。 鹅掌柴花是
冬季之蜜源，是南方不可多得的冬季蜜源植物。 鹅掌柴的
枝叶还是上好的插花陪衬材料，同时根皮及叶可供药用，
是一种应用广泛的经济植物。 鹅掌柴原产于大洋洲、我国
广东、福建等亚热带雨林，日本、越南、印度也有分布，现
广泛植于世界各地。
鹅掌柴在繁殖和栽培中常会发生病害，以炭疽病和叶
斑病发病率较高，危害也较重，影响观赏价值，甚至造成死
亡，给园林建设带来一定经济损失。对该植物的病原真菌，
美国记载了 15种[2]，国内报道较少。因此，我们对广州地区
的鹅掌柴炭疽病病原菌进行鉴定。
1 材料与方法
1.1 试验材料
鹅掌柴炭疽病叶采自广东省广州市海珠湖以及广州
市会展公园。
PDA 培养基：土豆 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15~20 g，
水 1 000 mL。 WA培养基：琼脂粉 18 g，水 1 000 mL。
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌的分离及纯化 组织分离法：取鹅掌柴炭疽
病的新鲜病叶， 剪取病健交界处 5 mm×5 mm 大小组织
块，将病组织放入 75％酒精中浸 1 min，再放入次氯酸钠
溶液 3 min，无菌水洗 3次，用灭菌的滤纸吸干病组织块表
面的水分，再将病组织块移至制好的 PDA 平板上，25℃条
件下培养，2 d后观察结果。
纯化和保存： 从组织块边缘挑取长出的病原菌至
PDA平板上，25℃条件下培养，3 d后将纯化的病原菌转置
斜面上低温保存[3]。
1.2.2 致病性接种及再分离 在 25℃、 相对湿度为 90%
的条件下，挑取大小相同的健康鹅掌柴叶片，每株接种 3
片叶片，每 3株为 1组，每个处理 9 次重复，用灭菌的针将
叶片刺伤，再接上病原菌块，套上保鲜袋并扎紧袋口，保鲜
袋中放有吸满无菌水的灭菌棉花团， 以无菌的 PDA接种
收稿日期：2012-06-30
基金项目： 广东省现代农业产业技术体系花卉病虫害防治创新
团队建设专项（粤农[2009]380 号）
作者简介：黄江华（1973-），男，博士，副教授，E-mail: jhhuang@
139.com
广东农业科学 2012 年第 16 期 69
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2012.16.035
AD
B
E
C
F
A、B：菌落形态；C：刚毛；D：分生孢子；E、F：分生孢子梗与分生孢子
图 2 鹅掌柴炭疽病菌菌落及显微形态
图 1 鹅掌柴炭疽病症状
为对照，7 d 后观察并记录发病情况。 从接种的发病组织
上再次分离纯化病菌。
1.2.3 病原菌的形态鉴定 在光学显微镜下观察真菌的
显微形态，结合菌落特征，参照相关资料从形态上进行初
步鉴定 [4]。
1.2.4 病原菌的分子鉴定 DNA提取： (1) 在灭菌的研钵
中加入 1 mL真菌 DNA提取液。(2) 选取单孢菌落（培养 3
d），用灭菌的药匙轻刮菌丝，取少量放入研钵中研磨，充分
研磨后，分装入 2 个 1.5 mL 离心管中，4℃、9 000 r/min 离
心 10 min。 (3) 取上清液，加入 500 μL异丙醇，待有沉淀产
生后， 上下颠倒数次， 4℃、12 000 r/min 离心 10 min。 (4)
弃上清液，加入 800 μL 70%酒精， 4℃ ，12 000 r/min 离心
10 min。 (5) 弃上清液，自然风干后加入 50 μL灭菌超纯水
溶解。 放在-20℃的冰箱保存。
病原菌 DNA 电泳检测 ：取 5 μL 扩增样品 ，于 1%
琼脂糖凝胶上进行电泳 。 在 120 V 条件下电泳 20
min。
病原菌 ITS片段扩增： 用真菌核糖体 DNA通用引物
ITS4和 ITS5进行 PCR扩增[5]。 其序列为：ITS1: 5′-TCCG
TAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGA
TATGC-3′。 选择 PCR 仪上 ITS 程序开始扩增 。 其中
Green mix 包含 dNTP、buffer、Taq 酶及染料。 PCR 扩增程
序为：94℃预变性 4 min，94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，
72℃延伸 1 min，33 个循环；72℃终延伸 10 min， 扩增样
于 4℃保存。
PCR反应体系 50 μL， 其中 DNA模板、ITS4、ITS5、超
纯水和 Green Mix分别为 2、2、2、19、25 μL。
电泳检测：取 8 μL 扩增样品，于 1%琼脂糖凝胶上进
行电泳，在 120 V条件下电泳 20 min。 电泳后在紫外灯下
观察。
PCR 产物纯化测序：PCR 扩增后的产物送北京六合
华大基因科技股份有限公司进行测序， 测序结果进行
BLAST同源性比对分析。
2 结果与分析
2.1 鹅掌柴炭疽病病原菌形态鉴定
2.1.1 鹅掌柴炭疽病症状 病斑发生于叶缘或中部， 近椭
圆形，略下陷，病斑中央浅褐色，边缘褐色至红褐色，严重时
病块连成片导致整叶干枯。 病斑上可见黑色小点，为病原
菌分生孢子盘。 湿度大时，病部产生大量桔红色粘孢团（图
1）。 该病终年发生，危害普遍，当温度为 25℃、相对湿度在
80%以上时易发病， 每年 2~4月流行最盛， 苗期发病受害
重。
2.1.2 致病性测定 接种 7 d 后开始发病，初期在伤口处
出现水渍状圆斑，10 d后病斑逐渐扩大。 接种症状与田间
发病初期症状基本一致。
2.1.3 病原菌的菌落形态及显微形态 菌落近圆形，灰白
色，边缘整齐，气生菌丝发达，高约 5 mm，后期产生桔红色
或黑色颗粒状孢子堆（图 2 A、B）。这与从接种的发病组织
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上再次分离纯化的病菌菌落性状相同。
病原菌分生孢子盘圆形至椭圆形， 周缘生暗褐色刚
毛，具 2个隔膜。 分生孢子梗无色透明，具隔膜，成排生于
分生孢子盘内。 分生孢子无色，单胞，椭圆形至圆柱形，油
球有或无，大小为 14.1~18.0 μm×4.0~6.1 μm（图 2 C、D、
E、F）。
2.2 ITS序列测定及结果分析
利用真菌通用引物 ITS4 和 ITS5 扩增病菌基因组
DNA， 得到大小为 588 bp 的 ITS 片段， 将所得序列在
GenBank 中进行比对，结果显示，本研究所得的鹅掌柴炭
疽病病菌的 DNA 序列与习平根等 [6]报道的鹅掌柴炭疽病
病原菌（Gen Bank 登录号：UAY266389.1）相似度达 99%，
同为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）。 扩
增出的 ITS序列如下：
3 讨论
真菌基因组核糖体 DNA 的基因间隔区 ITS ( Internal
Transcribed Space) 序列能很好地反映出同一属内不同种
间以及某些种内菌株间的序列差异，因此 ITS序列分析被
广泛地应用在真菌属种分类的研究领域中 [7]。 章桂明 [8]根
据对小麦印度腥黑粉菌（Tilletia indica）及其近似种的 ITS
序列分析和形态学比较结果， 提出黑麦草腥黑粉菌（T.
walkeri）与 T. indica 应是同一个种，建议将黑麦草腥黑粉
菌列为我国对外检疫性有害生物。 韦继光等[9]扩增了拟盘
多毛孢属及近缘属 19个菌株的 ITS片段， 并建立了分子
系统树，结果表明，分子系统树支持五细胞分生孢子类型
应归入拟盘多毛孢属， 四细胞分生孢子类型应归入截盘
多毛孢属， 分子系统树同时可以反映出无性阶段和有性
阶段之间的联系， 显示出分子系统学对形态分类学的客
观性的评判作用。
本研究对鹅掌柴炭疽病病原菌进行了系统地鉴定，
从形态特征和 ITS 片段两方面确认引起鹅掌柴炭疽病的
病原菌是胶孢炭疽，这一结果与习平根等 [6]的研究结果一
致。基于形态特征以及 ITS片段两方面结合对花卉病害病
原菌进行快速而准确的鉴定， 将对指导花卉病害的防治
具有重要的意义。
参考文献：
[1] 宋雪梅. 景观花卉常见病害极其防治技术 [J]. 中国西部科技,
2011,22(2):114-119.
[2] Farr D F, Bills G F, Chamuris G P, et al. Fungi on plants and
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[4] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.
[5] 李宁 .基因组学与应用生物学 [J].广西农学院学报 ,2012，31(1):
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[6] 习平根，戚佩坤，姜子德.鹅掌柴真菌病害鉴定[J].植物病理学报,
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[7] 邢红梅,丁平,王克荣,等.红掌炭疽病病原的分离鉴定及其核糖
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[8] 章桂明.小麦印度腥黑粉菌及其近似种的分子系统发育分析和形
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[9] 韦继光,徐同,郭良栋,等.从分子系统学角度分析拟盘多毛孢属
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