全 文 ：第 3 7卷第 4期 江　苏　林　业　科　技 Vol.3 7No.4
2 0 1 0 年 8 月 JournalofJiangsuForestryScience＆Technology Aug.2 0 1 0
文章编号:1001-7380(2010)04-0009-03
三叶崖爬藤 ISSR反应体系的初探
杨　华 1 ,陈　磊2 ,宋绪忠1
(1.浙江省林业科学研究院 , 浙江　杭州　310023;2.浙江科技学院 , 浙江　杭州　 310023)
　　收稿日期:2010-03-22;修回日期:2010-05-10
　　基金项目:浙江省科学技术厅青年人才项目(2007R20005)
　　作者简介:杨　华(1976-),女 ,江苏扬州人 ,博士 ,森林培育专业 ,主要研究方向:植物遗传育种。
摘要:对三叶崖爬藤 ISSR-PCR扩增反应体系的建立和优化进行探讨。结果表明 ,最适宜的 PCR反应条件为 20 μL
PCR反应体积中含有 1×缓冲液 , 20 ng模板 DNA, 3.0 mmol/LMgCl2 , 0.2 mmol/LdNTPs, 1.5 UTaqDNA聚合酶 ,
0.5μmol/L引物 。扩增程序为:94 ℃预变性 5min;再 35个循环:94℃ 60s, 52 ℃ 60s和 72℃ 105 s;最后 72℃延
伸 10 min。
关键词:三叶崖爬藤;ISSR;优化
中图分类号:R282.5　　文献标识码:A
OptimizationconditionsofISSRreactionsystemfor
TetrastigmahemsleyanumDielset.Gilg.
YANGHua1 , CHENLei2 , SONGXu-zhong1
(1.ZhejiangAcademyofForestry, Hangzhou310023, China;
2.ZhejiangUniversityofScienceandTechnology, Hangzhou31023, China)
Abstract:FactorswhichafecttheISSRanalysisinthemolecularstudyofTetrastigmahemsleyanumwerestudiedforoptimi-
zingconditions.TheresultsshowedthattheconditionsbeingsuitableforISSR-PCRofT.hemsleyanumwereasfollows:1
bufer, 20 ngtemplateDNA, 3.0 mmol/LMgCl2 , 0.2 mmol/LdNTPs, 1.5UTaqDNApolymerase, 0.5 μmol/Lprimer.
Theamplificationcyclingwas1 cycleat94 ℃for5 min;35 cyclesat94 ℃for60sec, 52℃ for60 sec, and72℃ for105
s, respectively, and1cycleat72 ℃ for10 min.
Keywords:TetrastigmahemsleyanumDielset.Gilg.;ISSR;Optimization
　　三叶崖爬藤 (TetrastigmahemsleyanumDielset
Gilg)为葡萄科崖爬藤属植物 ,别名有三叶青 、金线
吊葫芦 、丝线吊金钟等 [ 1] 。三叶崖爬藤以块根或全
草入药 ,具有清热解毒 、祛风化痰 、活血止痛的功能 ,
在民间应用颇多 。近年的药理实验表明 ,三叶崖爬
藤提取物还具有抗病毒 、消炎镇痛 、保肝等作用 [ 2] ,
具有良好的开发前景 ,对其资源的开发与应用受到
空前的重视 。目前 ,随着分子生物学研究的不断发
展 ,为三叶崖爬藤资源保护和利用提供了新手段。
ISSR(inter-simplesequencerepeats)是由 Zi-
etkiewicz等 [ 3]提出的一种分子标记技术 ,它由 SSR
(simplesequencerepeat)发展而来 ,结合了 SSR和
RAPD技术的优点 ,不需要知道简单重复序列两端
的碱基序列 ,引物较长 ,退火温度较高 ,增强了实验
的可重复性 ,已成功地运用于品种鉴定 、物种的分类
系统学比较 、遗传多样性 、种质鉴定等 [ 4-6]领域。本
实验以三叶崖爬藤为材料 ,首次进行 ISSR实验体系
优化的研究 ,建立了重复性强 、稳定性好的反应体系
和扩增程序 ,为其分子水平的遗传多样性研究奠定
基础 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
2008 年 , 从 浙 江 省 杭 州 市 余 杭 区
(119°59.274′E, 30°12.173′N)采集三叶崖爬藤 ,移
栽至浙江省林业科学研究院苗圃 。 2009年 4月 ,采
集其幼嫩叶片 ,直接用于实验。
1.2　主要试剂和仪器
从上海生工生物公司购买引物和 100-bpDNA
ladder;TaqDNA聚合酶和 dNTPs购自杭州博日科
技有限公司(BIOER)。
PCR扩增仪为 GeneAmpPCRSystem2720 (Ap-
pliedBiosystemCo.);全自动凝胶成像分析系统为
上海培清科技有限公司;DYY-8C型双稳电泳仪;水
平电泳槽购自北京六一仪器厂;各型号微量移液器
来自 Eppendorf公司 。
1.3　试验处理
基因组 DNA提取采用 SDS-CTAB法 ,本实验初
始 PCR扩增 20 μl体系为:10×bufer(w/Mg)2.0
μl, 0.25 mmol/LdNTPs, 2.75 mmol/LMg2 + , 0.2
μmol/L引物 , 1.5UTaqDNA聚合酶 , 20 ng左右的模
板 DNA。基本程序如下:9 ℃预变性 5 min;再 35个
循环:9℃变性 1min, 52℃退火 45sec, 7℃延伸 1.5
min;最后 7℃延伸 10min。取加入溴酚蓝的扩增产
物 13μl,用含有溴化乙锭的 1.5%琼脂糖凝胶在 1
×TAE缓冲液中电泳分离检测 ,电泳结果通过凝胶
成像分析系统存盘保存。
dNTPs浓度梯度设置 6个处理 , 分别是 0.05 ,
0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3 mmol/L,使用 4个引物 。
Mg2 +浓度梯度设置 6个处理 , 分别是 2.0 , 2.25 ,
2.5, 2.75 , 3.0, 3.25 mmol/L,使用 4个引物。引物
浓度梯度设置 4个处理 ,分别是 0.25, 0.5, 0.75, 1.0
μmol/L,使用 3个引物。
延伸时间设置 4个梯度 ,分别是 90, 105, 120 ,
135s,退火时间设置 4个梯度 ,分别是 30, 45, 60, 75
s。都使用 6个引物。
每一个合适的条件确定后即作为后续优化的 1
个条件 。实验过程中使用的引物见表 1。
表 1　ISSR分析用的引物序列
引物 碱基(5 -3 ) 引物 碱基(5 -3 )
794 GA(8)T 800 CA(8)T
796 GA(8)A 801 CA(8)A
797 CT(8)T 803 GT(8)A
798 CT(8)A
2　结果
2.1　dNTPs浓度对 ISSR分析的影响
dNTPs一般使用浓度在 50 ～ 200μmol/L之间 。
它可以按 1∶1的比例与 Mg2+结合 ,过低的 dNTPs浓
度 ,会影响合成效率 ,甚至会因 dNTPs过早耗尽而
使产物单链化 [ 9] 。从 dNTPs浓度的实验中可以看
到(见表 2),随着浓度的增加 ,条带逐渐清晰 ,但浓
度达到 0.2 mmol/L以后 ,部分扩增条带开始模糊。
最后选定第 4种反应体系 ,即 0.2 mmol/L的 dNTPs
浓度 。
表 2　dNTPs浓度对 PCR结果的影响
引物 dNTPs浓度 /(mmol/L)
0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
796 + + ++ ++ ++ ++
797 + + + ++ + ++
798 + + + ++ + +
800 + ++ ++ ++ ++ +
　　++:表示扩增效率高;+:表示有扩增产物。
2.2　Mg2+的浓度对 ISSR分析的影响
在一般的 PCR反应中 , Mg2+浓度在 1.5 ～ 2.0
mmol/L范围内是比较合适的 。Mg2+过多 ,就易鳌合
dNTPs,使 dNTPs消耗殆尽 ,无延伸反应 ,扩增产物
单链化 ,造成扩增失败。 Mg2+过少又造成 dNTPs螯
合 Mg2+或降低 Taq酶活性 [ 8] 。而且 Mg2+也直接影
响到随机引物与 DNA模板的结合 ,从而导致 PCR
结果的改变。从 Mg2 +浓度的组合实验中可以看到
(见表 3),第 4和 5种反应体系结果较好 ,其他反应
体系扩增条带不够清晰 ,最后选定第 5种反应体系 ,
即 3.0 mmol/L的 Mg2+浓度。
表 3　Mg2+浓度对 PCR结果的影响
引物 Mg
2+浓度 /(mmol/L)
2.0 2.25 2.5 2.75 3.0 3.25
796 +/- +/- ++ ++ ++ +/-
797 +/- +/- +/- +/- ++ +/-
798 + ++ - ++ + +
800 + ++ ++ ++ ++ ++
　　++:表示扩增效率高;+:表示有扩增产物;-:表示无扩增产
物;+/-:表示扩增产物不清晰;以下表格标注相同。
2.3　引物的浓度对 ISSR分析的影响
引物浓度影响扩增产物的质与量 ,直接关系到
可重复性 。根据设计的浓度梯度 ,其他成分按前期
实验结果 , PCR扩增结果如表 4,第 2种反应体系效
果最好 ,扩增条带达到最多 ,且稳定清晰 ,没有出现
明显的弥散现象。
10 江　苏　林　业　科　技 第 37卷
表 4　引物浓度对 PCR结果的影响
引物 引物浓度 /(μmol/L)
0.25 0.5 0.75 1.0
794 + ++ ++ +/-
796 + ++ + +/-
801 + ++ +/- +/-
2.4　延伸时间对 ISSR分析的影响
根据上述各因子比较实验的结果 ,可以确定三
叶崖爬藤 ISSR-PCR最佳反应体系 , 但反应程序中
变性 、退火 、延伸的温度与时间 、循环的周期数等也
会影响 PCR反应结果 。本实验主要分析了延伸时
间和退火时间的影响。通过对 ISSR反应的延伸时
间的调节 ,发现三叶崖爬藤的 ISSR反应延伸时间在
105s效果最好(见表 5),条带清晰 , 120 s其次 ,可
见用 105 s延伸时间更为适宜。
表 5　延伸时间对 PCR结果的影响
引物 延伸时间 /s
90 105 120 135
794 - ++ ++ +
796 + ++ + +
797 + ++ ++ +
798 + ++ + +
800 - - - -
801 + ++ + +
2.5　退火时间对 ISSR分析的影响
通过对 ISSR反应的退火时间调节 ,结果退火时
间在 60s时效果最好(见表 6),条带清晰 ,最终确定
使用。
表 6　退火时间对 PCR结果的影响
引物 退火时间 /s
30 45 60 75
794 + ++ ++ ++
796 + + + +
797 + + ++ ++
798 +/- ++ ++ +
801 + + ++ ++
803 - - - -
3　结论与讨论
ISSR扩增虽然有诸多的优点 ,但也容易受到诸
多因素的影响 , 如 DNA模板的浓度和纯度 ,引物 、
Mg2 +、dNTPs、TaqDNA聚合酶的浓度 ,扩增程序与
循环周期等都会影响扩增式样 ,而且不同实验材料
的反应条件也存在差异 ,因此 ,需要优化固定三叶崖
爬藤的 ISSR-PCR反应条件 , 以期得到重复性和稳
定性良好的反应程序 ,在此基础筛选出多态性强 、重
复性好的引物继续下一步工作。本实验最终获得的
PCR反应条件为:20 μLPCR反应体积中含有 1×
缓冲液 , 20 ng模板 DNA, 3.0 mmol/LMgCl2 , 0.2
mmol/LdNTP, 1.5 UTaqDNA聚合酶 , 0.5 μmol/L
引物 。扩增程序为:94 ℃预变性 5 min;再 35个循
环:94℃ 60s, 52℃ 60 s和 72℃ 105s;最后 72 ℃
延伸 10min。利用这个反应条件 ,筛选(见图 1)出
10个扩增条带清晰且多态性强的引物 ,用于下一步
实验 。
图 1　三叶崖爬藤基因组 DNA的 ISSR扩增(引物为 810
～ 818)
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11第 4期 杨　华等:三叶崖爬藤 ISSR反应体系的初探