全 文 ：书ｈｔｔｐ：／／ＸＢＹＺ．ｃｂｐｔ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ
·中药及天然药物·
珠子参ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立及优化
宋小妹，许苗苗，刘银环，王　薇，刘　超，杨新杰，崔九成＊（陕西中医学院，咸阳　７１２０４６）
摘要：目的　建立珠子参的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ适宜扩增反应体系和程序，为其深入研究奠定基础。方法　采用新型植物基因组ＤＮＡ提
取试剂盒提取珠子参总ＤＮＡ，并用正交设计实验对其ＩＳＳＲ反应体系条件进行筛选及优化。结果　提取的基因组ＤＮＡ纯度和
完整性较好，Ａ２６０／Ａ２８０值在１．８～２．０之间，ＤＮＡ无降解现象，可满足ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增要求。珠子参ＩＳＳＲ分析的最适反应体系
为：在２０μＬ　ＰＣＲ反应体积中，含１０ｎｇ模板ＤＮＡ、０．２０ｍｍｏｌ·Ｌ
－１ｄＮＴＰｓ、１．５μｍｏｌ·Ｌ
－１引物、３ＵＴａｑＤＮＡ聚合酶、２μＬ
１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、３ｍｍｏｌ·Ｌ－１　Ｍｇ２＋。扩增程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，循环
４０次，７２℃延伸１０ｍｉｎ。由此可获得带型丰富和清晰可辨的ＤＮＡ指纹图谱。结论　建立的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系可用于研究珠
子参的遗传变异和遗传多样性。
关键词：珠子参；基因组ＤＮＡ；ＩＳＳＲ反应体系；遗传多样性
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－２４０７．２０１４．０６．００１
中图分类号：Ｒ２８２　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００４－２４０７（２０１４）０６－０５５１－０４
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｐａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ
Ｃ．Ａ．Ｍｅｙ．ｖａｒ．ｍａｊｏｒ
ＳＯＮＧ　Ｘｉａｏｍｅｉ，ＸＵ　Ｍｉａｏｍｉａｏ，ＬＩＵ　Ｙｉｎｈｕａｎ，ＷＡＮＧ　Ｗｅｉ，ＬＩＵ　Ｃｈａｏ，ＹＡＮＧ　Ｘｉｎｊｉｅ，ＣＵＩ　Ｊｉｕｃｈｅｎｇ＊（Ｓｈａａｎｘｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉ－
ｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉａｎｙａｎｇ，７１２０４６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ　ｗａｓ　ｕｎｄｅｒｔａｋｅｎ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａｎ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｐａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉ－
ｃｕｓ　Ｃ．Ａ．Ｍｅｙ．ｖａｒ．ｍａｊｏｒｆｏｒ　ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ　ｂａｓｉｓ　ｔｏ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　Ｃ．Ａ．Ｍｅｙ．ｖａｒ．
ｍａｊｏｒ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｅｐｓ　Ｋｉｔ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ＩＳ－
ＳＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｗａｓ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　１．８ｔｏ　２．０ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ（２６０／２８０），ｄｉｄ　ｎｏｔ　ｓｈｏｗ　ａｎｙ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ
ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ａ　ｔｏｔａｌ　２０μＬ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　１０ｎｇ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ，０．２０ｍｍｏｌ·Ｌ
－１　ｏｆ
ｄＮＴＰｓ，１．５μｍｏｌ·Ｌ
－１　ｐｒｉｍｅｒ，３Ｕｏｆ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，２μＬ　１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　ａｎｄ　３ｍｍｏｌ·Ｌ
－１　Ｍｇ２＋．Ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｐｒｏｇｒａｍ
ｗａｓ　ｓｅｔ　ｔｏ　５ｍｉｎ　ａｔ　９５℃ｆｏｒ　ｐｒｅ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ，ｆｏｌｏｗｅｄ　ｂｙ　４０ｃｙｃｌｅｓ　ｏｆ　３０ｓａｔ　９４℃ （ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ），３０ｓａｔ　５８℃ （ａｎｎｅａｌｉｎｇ）ａｎｄ
１ｍｉｎ　ａｔ　７２℃ （ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ），ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｉｎａｌ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｅｔ　ａｔ　７２℃ｆｏｒ　１０ｍｉｎ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｙｉｅｌｄｅｄ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ
ＤＮＡ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｍａｙ　ｂｅ　ｕｓｅｆｕｌ　ｔｏ　ａｓｓｅｓｓ　ｔｈｅ
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　Ｐａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　Ｃ．Ａ．Ｍｅｙ．ｖａｒ．ｍａｊｏｒ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　Ｃ．Ａ．Ｍｅｙ．ｖａｒ．ｍａｊｏｒ；ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ；ＩＳＳＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ；ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
基金项目：国家自然科学基金项目（编号：８１１０２８０５／Ｈ２８０４）；
陕西 省 科 技 统 筹 创 新 工 程 项 目 （编 号：
２０１１ＫＴＣＱ０３－０２）；陕西省科学技术研究发展计
划项目（编号：２０１１Ｋ１６－０２－０２）；陕西省教育厅项
目（２０１０ＪＫ５０２）；陕西省中医管理局专项科研计
划项目（编号：ＺＹ０８）
作者简介：宋小妹，女，教授
＊通信作者：崔九成，男，教授
　　珠子参为五加科人参属植物珠子参Ｐａｎａｘ　ｊａ－
ｐｏｎｉｃｕｓ　Ｃ．Ａ．Ｍｅｙ．ｖａｒ．ｍａｊｏｒ（Ｂｕｒｋ．）Ｃ．Ｙ．Ｗｕ
ｅｔ　Ｋ．Ｍ．Ｆｅｎｇ或羽叶三七Ｐａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　Ｃ．Ａ．
Ｍｅｙ．ｖａｒ．ｂｉｐｉｎｎａｔｉｆｉｄｕｓ（Ｓｅｅｍ．）Ｃ．Ｙ．Ｗｕ　ｅｔ　Ｋ．
Ｍ．Ｆｅｎｇ的干燥根茎，常用于治疗气阴两虚、烦热口
渴、虚劳咳嗽、跌扑损伤、关节疼痛、咳血、外伤出血等
症［１］。珠子参也是民间习用特色中药材太白七药之
一，分布于我国陕西、四川、云南、甘肃、贵州等地。目
前对珠子参的研究主要集中在生药、化学、药效［２－７］等
方面，而在植物分子生物学研究方面的报道甚少；而
珠子参由于受其生长环境等因素及人为过度采挖而
被列为濒危药用植物。因此，开展珠子参的分子生物
学和遗传学多样性方面的研究，对珠子参种质资源保
护及资源的开发利用都将产生重要影响。
简单重复序列间区多态性标记（ＩＳＳＲ）是Ｚｉｅｔｋ－
ｉｅｗｉｃｚ等［８］于１９９４年提出的一种基于微卫星（ＳＳＲ）
的十分有效的分子标记，具有多态性高、产率中等、重
复性好、操作简单、引物开发无需任何ＤＮＡ序列信
息等优点，在不同的物种间具有通用性，比较适合于
基因组未测序已知ＤＮＡ序列信息量小的物种使用。
目前，ＩＳＳＲ标记已广泛应用于植物种质资源鉴定评
１５５西北药学杂志　２０１４年１１月　第２９卷　第６期
ｈｔｔｐ：／／ＸＢＹＺ．ｃｂｐｔ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ
价、遗传图谱构建、重要性状标记、进化及分子生态学
等研究中［９］。本实验旨在探索珠子参基因组 ＤＮＡ
最优提取方法，建立和优化ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，为
珠子参的分子鉴别提供理论基础和技术支持。
１　仪器与试药
１．１　仪器　ＣＴ　９６１２型基因扩增仪（杭州柏恒科技
有限公司）；ＤＹＹ－１０Ｃ型电泳仪（北京六一仪器厂）；
ＵＶ－１８００紫外检测器（日本岛津公司）；Ｓ．Ｍ－７６Ｓ型
凝胶成像系统（意大利ＢＩＯ－ＲＡＤ　Ｌａｂ公司）；３－１８Ｋ
型台式冷冻离心机（德国Ｓｉｇｍａ公司）。
１．２　试药
１．２．１　植物材料　２３份样品（１，２及１２～１４号为新
鲜根茎，其余均为新鲜叶片）分别采自陕西、四川、云
南３个主产区的１０个不同地区，保存于－８０℃超低
温冰箱中备用。所有样本均经陕西中医学院标本馆
王继涛高级实验师鉴定，其中，除１０号样本为羽叶三
七Ｐａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　Ｃ．Ａ．Ｍｅｙ．ｖａｒ．ｂｉｐｉｎｎａｔｉｆｉ－
ｄｕｓ（Ｓｅｅｍ．）Ｃ．Ｙ．Ｗｕ　ｅｔ　Ｋ．Ｍ．Ｆｅｎｇ外，其余样本
均为珠子参Ｐａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　Ｃ．Ａ．Ｍｅｙ．ｖａｒ．ｍａ－
ｊｏｒ（Ｂｕｒｋ．）Ｃ．Ｙ．Ｗｕ　ｅｔ　Ｋ．Ｍ．Ｆｅｎｇ。
１．２．２　试剂及引物　１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、ＭｇＣｌ２、Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ、ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋ－
ｅｒ、新型植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒（ｎｕｃｌｅａｎ　ｐｌａ－
ｎｔｇｅｎ　ＤＮＡ　ｋｉｔ）均购自北京康为世纪生物科技有限
公司；无水乙醇、氢氧化钠均为国产分析纯。所用
ＩＳＳＲ引物参照加拿大的不列颠哥伦比亚大学所公布
的序列，由上海生物工程有限公司合成。
２　实验方法
２．１　基因组ＤＮＡ的提取及检测　采用新型植物基
因组ＤＮＡ提取试剂盒（ｎｕｃｌｅａｎ　ｐｌａｎｔｇｅｎ　ＤＮＡ　ｋｉｔ），
具体操作步骤如下：
取植物新鲜组织１００ｍｇ，加入液氮充分研磨。
将研磨后的粉末收集到离心管中，加入４００μＬ　Ｂｕｆｅｒ
ＧＬＰ１和６μＬ　ＲＮａｓｅ　Ａ（１０ｍｇ·ｍＬ
－１），涡旋振荡
１ｍｉｎ，室温放置１０ｍｉｎ，使其充分裂解。加入１３０μＬ
Ｂｕｆｅｒ　ＬＰ２，混匀，涡旋振荡１ｍｉｎ。以１２　０００ｒ·ｍｉｎ－１
离心５ｍｉｎ，将上清液移至新的离心管中。加入
１．５倍体积的Ｂｕｆｆｅｒ　ＬＰ３充分混匀。将上步所得溶
液和沉淀全部加入到已装入收集管的吸附柱中。以
１２　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１ｍｉｎ，弃去收集管中的废液，
将吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入
５００μＬ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＧＷ（使用前加无水乙醇），以１２　０００
ｒ·ｍｉｎ－１离心１ｍｉｎ，弃去收集管中的废液，将吸附
柱重新放回收集管中。以１２　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心
２ｍｉｎ，弃去收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分
钟，彻底晾干。将吸附柱重新放到一个新的离心管中，
向吸附膜的中间部位悬空滴加５０～１００μＬ　Ｂｕｆｅｒ　ＧＥ
或灭菌水，室温放置３ｍｉｎ，以１２　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心
１ｍｉｎ，收集ＤＮＡ溶液。－２０℃保存备用。
采用１８ｇ·Ｌ－１琼脂糖凝胶电泳以ＤＬ２０００为标
准检测ＤＮＡ完整性，在紫外分光光度计上，根据Ａ２６０／
Ａ２８０确定ＤＮＡ的质量和浓度。将检验合格的所有供
试ＤＮＡ样品储存在－２０℃冰箱中，保存备用。
２．２　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ 扩增条件优化　在前期查阅资
料［１０－１４］及预实验的基础上，认为影响ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应
的主要因素为：ｄＮＴＰｓ、引物、Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚合酶、
Ｍｇ２＋、模板ＤＮＡ浓度等，因此，采用Ｌ１６（４５）正交设
计对影响ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的主要因素进行优化。影
响因素水平见表１，实验设计方案见表２。
ＰＣＲ总反应液体积除表１中所列外，还包括
２μＬ　１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ，用去离子水补足到２０μＬ。扩
增引物采用通用引物ＵＢＣ８１８，样品采用陕西太白县
太白山山神庙珠子参叶ＤＮＡ。
表１　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系正交实验因素水平表
Ｔａｂ．１Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
水平
影响因素
引物浓度
／μｍｏｌ·Ｌ
－１
ｄＮＴＰｓ
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
Ｔａｑ酶
／２０Ｕ·μＬ
－１
Ｍｇ２＋浓度
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＤＮＡ模板
／ｎｇ
１　 ０．５　 ０．１５　 １　 １．５　 １０
２　 １．０　 ０．２０　 ２．０　 ２．０　 ２０
３　 １．５　 ０．２５　 ３　 ２．５　 ３０
４　 ２　 ０．３０　 ４　 ３．０　 ４０
表２　ＩＳＳＲ反应体系Ｌ１６（４５）正交实验设计
Ｔａｂ．２Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
编号
引物浓度
／μｍｏｌ·Ｌ
－１
ｄＮＴＰｓ
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
Ｔａｑ酶
／２０Ｕ·μＬ
－１
Ｍｇ２＋浓度
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＤＮＡ模板
／ｎｇ
１　 ０．５　 ０．１５　 １　 １．５　 １０
２　 １．０　 ０．２０　 １　 ２．０　 ２０
３　 １．５　 ０．２５　 １　 ２．５　 ３０
４　 ２．０　 ０．３０　 １　 ３．０　 ４０
５　 ２．０　 ０．２０　 ２　 １．５　 ３０
６　 １．５　 ０．１５　 ２　 ２．０　 ４０
７　 １．０　 ０．３０　 ２　 ２．５　 １０
８　 ０．５　 ０．２５　 ２　 ３．０　 ２０
９　 ２．０　 ０．２５　 ３　 １．５　 ４０
１０　 ０．５　 ０．３０　 ３　 ２．０　 ３０
１１　 ２．０　 ０．１５　 ３　 ２．５　 ２０
１２　 １．５　 ０．２０　 ３　 ３．０　 １０
１３　 １．５　 ０．３０　 ４　 １．５　 ３０
１４　 ２．０　 ０．２５　 ４　 ２．０　 １０
１５　 ０．５　 ０．２０　 ４　 ２．５　 ４０
１６　 １．０　 ０．１５　 ４　 ３．０　 ２０
２５５ 西北药学杂志　２０１４年１１月　第２９卷　第６期
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　　初步设定的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增程序为：９５℃预变
性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ；５８℃退火３０ｍｉｎ；７２℃延
伸１ｍｉｎ；循环４０次；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。
取１０μＬ扩增产物采用１８ｇ·Ｌ
－１的琼脂糖凝胶电
泳检测，ＥＢ染色，置于紫外凝胶成像分析仪中观察
拍照。
２．３　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增　按照优选出的反应体系采用
ＵＢＣ　８１８对２３个ＤＮＡ样品全部进行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增。
３　结果与分析
３．１　基因组ＤＮＡ检测结果　在紫外分光光度计上
测定ＤＮＡ的Ａ２６０与Ａ２８０比值在１．８～２．０之间，电泳
条带集中整齐、清晰明亮、无拖尾、无弥散，表明满足
ＩＳＳＲ反应对ＤＮＡ质量的要求。电泳结果见图１。
图１　珠子参基因组ＤＮＡ
注：１～２３代表２３个珠子参样品
Ｆｉｇ．１Ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍＰａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ｖａｒ．ｍａｊｏｒ
Ｎｏｔｅ：１－２３ｓｔａｎｄ　２３ｓａｍｐｌｅｓ
３．２　正交实验结果和分析及引物筛选　琼脂糖凝胶
电泳结果见图２，依据所显示的条带清晰度及条带数
量等指标进行直观分析，１４号条带扩增效果较好，即
对应的表２中１４号正交实验结果较好。因此最终优
化出最佳反应体系为：２０μＬ的ＰＣＲ反应体系中含２μＬ
１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｅｒ、１０ｎｇ模板 ＤＮＡ、０．２５ｍｍｏｌ· Ｌ－１
ｄＮＴＰｓ、２μｍｏｌ·Ｌ
－１引物、４Ｕ ＴａｑＤＮＡ 聚合酶、
２ｍｍｏｌ·Ｌ－１　Ｍｇ２＋。扩增程序为：９５ ℃ 预变性
５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｍｉｎ，７２℃延伸
１ｍｉｎ，循环４０次，７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。
图２　正交实验ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系扩增电泳图
注：１～１６：对应表１；Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ
Ｆｉｇ．２Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ
ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ
Ｎｏｔｅ：１－１６：ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｔａｂ．１；Ｍ：ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ
３．３　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果　采用 ＵＢＣ　８１８对所有
样本进行扩增的结果见图３。结果显示，此反应体系
可以给出清晰的指纹图谱，而且，ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体
系稳定可靠，可用于珠子参的分子的鉴别和遗传关系
分析。
图３　样品的ＩＳＳＲ引物ＵＢＣ８１８扩增谱带
Ｆｉｇ．３Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｂｙ　ｐｒｉｍｅｒ　ＵＢＣ８１８
４　讨论
珠子参所含皂苷类、多糖类等成分含量较高，在
ＤＮＡ提取过程中易与ＤＮＡ共沉淀，形成黏稠的胶
状物，难以溶解或产生褐变［１５］。本实验珠子参ＤＮＡ
基因组的提取采用了新型的提取试剂盒，不仅提取步
骤简便、效果好，而且获得的ＤＮＡ样本纯度高、杂质
少，特别适合于从野外采集样品 ＤＮＡ 基因组的快
速、高效提取。
影响ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的因素很多。基于正交设
计具有均衡分散、效应明确、综合可比、信息量大等优
点，本研究采用５因素４水平正交实验确定了影响珠
子参ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的引物浓度、模板浓度、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚
合酶浓度、ｄＮＴＰ浓度、Ｍｇ２＋浓度的最佳组合，筛选
出了扩增条带清晰、多态性丰富的ＩＳＳＲ引物１３个，
建立了稳定的、可重复的珠子参ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应
体系及 ＰＣＲ 扩增参数。本研究主要应用引物
ＵＢＣ８１８进行扩增，优选出的条件基本适用于其他大
多数引物，但是在具体使用的过程中还要根据不同引
物的特征进行适当的微调，主要调整扩增过程中的退
火温度，以期达到最好的扩增效果。
从图２和图３可以看出，样品１０与其他样品
ＤＮＡ间差异较大。从来源得知，１０号样品为羽叶三
七，虽然与珠子参同为竹节参的变种均作为珠子参药
用，但是从分子水平角度初步说明二者间有一定差异。
目前对珠子参从ＤＮＡ层面展开的研究较少，前
人对珠子参的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ分子标记技术研究很少，很
多东西无从借鉴，这就为珠子参的更深入的研究带来
一定的难度。本研究针对珠子参ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体
系的研究，为珠子参种质资源的保护、遗传多样性的
研究、药效成分的体内代谢和人工规模化栽培珠子参
奠定了一定的基础。
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科大学学报，２０１０，２７（８）：６２６－６２９．
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３５５西北药学杂志　２０１４年１１月　第２９卷　第６期
ｈｔｔｐ：／／ＸＢＹＺ．ｃｂｐｔ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ
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［８］　Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ　Ｅ，Ｒａｆａｌｓｋｉ　Ａ，Ｌａｂｕｄａ　Ｄ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｆｉｎｇｅｒ－
ｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｂｙ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ａｎｃｈｏｒｅｄ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
１９９４，２０：１７６－１８３．
［９］　Ｐｒａｄｅｅｐ　Ｒｅｄｄｙ　Ｍ，Ｓａｒｌａ　Ｎ，Ｓｉｄｄｉｑ　Ｅ　Ａ．Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａ－
ｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００２，１２８：９－１７．
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（收稿日期：２０１４－０５－２６）
紫外可见分光光度法测定苣荬菜根部总三萜皂苷的含量
刘伟锐＃，张　霞＃，姜　蕊，杨　悦，谢　梦，颜　承，折改梅＊（北京中医药大学中药学院，北京　１００１０２）
摘要：目的　用紫外可见分光光度法测定苣荬菜根部总三萜皂苷的含量。方法　采用ＡＢ－８、Ｄ－１０１、Ｄ－４０２０、ＨＰＤ－４００和ＮＫＡ－９
５种大孔树脂对苣荬菜根部总三萜皂苷进行纯化，以齐墩果酸为对照品，５０ｇ·Ｌ－１香草醛－冰醋酸、高氯酸为显色系统，在５４６ｎｍ
波长处测定总三萜皂苷含量。结果　在ＡＢ－８、Ｄ－１０１、Ｄ－４０２０、ＨＰＤ－４００和ＮＫＡ－９　５种树脂中，Ｄ－１０１对苣荬菜根部总三萜皂苷
纯化效果最好；齐墩果酸质量浓度在０．０３４　２～０．１０６　５ｍｇ·ｍＬ－１范围内，吸光度与含量呈良好的线性关系，回归方程Ｙ＝
８．２９８　２　Ｘ－０．０８４　９（ｒ＝０．９９９　６），平均加样回收率为９５．３％，ＲＳＤ＝１．５％（ｎ＝５），苣荬菜根部总三萜皂苷含量为０．２０２％，ＲＳＤ
＝２．６％。结论　该方法操作简单，快速灵敏，准确可靠，对设备要求不高，适用于苣荬菜根部总三萜皂苷的含量测定。
关键词：苣荬菜；总三萜皂苷；含量测定；紫外可见分光光度法
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－２４０７．２０１４．０６．００２
中图分类号：Ｒ２８２　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００４－２４０７（２０１４）０６－０５５４－０４
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｓｏｎｃｈｕｓ　ａｒｖｅｎｓｉｓ　Ｌ．ｂｙ　ｓｐｅｃｔｒｏ－
ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ
ＬＩＵ　Ｗｅｉｒｕｉ＃，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａ＃，ＪＩＡＮＧ　Ｒｕｉ，ＹＡＮＧ　Ｙｕｅ，ＸＩＥ　Ｍｅｎｇ，ＹＡＮ　Ｃｈｅｎｇ，ＳＨＥ　Ｇａｉｍｅｉ＊（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，
Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００１０２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｎｅｗ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｓｏｎｃｈｕｓ　ａｒｖｅｎｓｉｓ　Ｌ．ｂｙ
ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ＡＢ－８，Ｄ－１０１，Ｄ－４０２０，ＨＰＤ－４００ａｎｄ　ＮＫＡ－９ｆｉｖｅ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ｒｅｓｉｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｕｒ－
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｓ．ａｒｖｅｎｓｉｓ　Ｌ．，ｗｉｔｈ　ｏｌｅａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ａｓ　ｓｔａｎｄａｒｄ，５０ｇ·Ｌ－１　ｖａｎｉｌｉｎ－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ｐｅｒ－
ｃｈｌｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　ａｓ　ｃｏｌｏｒｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍｓ，ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ａｔ　５４６ｎｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｄ－１０１ｍａｃｒｏ－
ｐｏｒｏｕｓ　ｒｅｓｉｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｓ．ａｒｖｅｎｓｉｓ　Ｌ．．Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ
ａｎｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｏｌｅａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．０３４　２－０．１０６　５ｍｇ·ｍＬ－１．Ｔｈｅ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ
ｗａｓ　Ｙ＝８．２９８　２Ｘ－０．０８４　９（ｒ＝０．９９９　６），ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　９５．３％，ＲＳＤ＝１．５％（ｎ＝５）．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｔｒｉｔｅｒ－
ｐｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｓ．ａｒｖｅｎｓｉｓ　Ｌ．ｗａｓ　０．２０２％，ＲＳＤ＝２．６％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｒｅ－
ｌｉａｂｌｅ，ｌｅｓｓ　ｄｅｍａｎｄｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｅｖｉｃｅ，ａｎｄ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｓ．ａｒｖｅｎｓｉｓ　Ｌ．．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓｏｎｃｈｕｓ　ａｒｖｅｎｓｉｓ　Ｌ．；ｔｏｔａｌ　ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓ；ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ
基金项目：教育部大学生创新性实验计划（编号：２０１３１００２６０６８）；
陕北地区苦菜汁开发研究（横向课题）
＃共同第一作者：刘伟锐，男，在读硕士研究生；
张霞，女，在读硕士研究生
＊通信作者：折改梅，女，博士，副教授，博士生导师
　　苣荬菜为菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）苦苣菜属（Ｓｏｎｃｈｕｓ）
植物苣荬菜（Ｓ．ａｒｖｅｎｓｉｓ　Ｌ．）的干燥全草，又名苦菜、
苦荬菜、取麻菜等。苣荬菜性寒、味苦，具有清热解
４５５ 西北药学杂志　２０１４年１１月　第２９卷　第６期