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度的高低取决于引物的碱基组成、长度和浓度。本试验根据
引物的理论退火温度进行适当的调整，优化退火温度。ISSR
分子标记技术基于 PCR反应，其扩增条带虽较 RAPD 标记稳
定，但也受反应条件变化以及物种不同的影响［10］。ISSR 条
带的清晰度和稳定性是进行遗传多样性分析的必要条件，而
研究显示不同条件下的 ISSR分析结果条件不完全一样，这样
就更进一步要求在试验条件下先做好 ISSR － PCR 体系优化
的研究，为下一步的研究做好基础，这样才能使遗传多样性分
析的结果更加科学和可靠。
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三叶崖爬藤 DNA提取及 RAPD引物筛选
郭 勇，卢华兵，石丽敏，金英燕，胡贤女
(浙江省东阳玉米研究所，浙江东阳 322100)
摘要:采用 CTAB法提取三叶崖爬藤基因组 DNA，用琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测，选择条带清晰的模板进行
RAPD试验。设计 PCR扩增程序，构建 RAPD反应体系，在 PCR仪上进行扩增反应，通过琼脂糖凝胶电泳检测筛选出
4 条具有多态性的 RAPD引物。
关键词:三叶崖爬藤;DNA;RAPD;引物
中图分类号:S567． 201 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2012)08 － 0039 － 02
收稿日期:2012 － 01 － 11
基金项目:浙江省农业科学院重点实验室开放课题 (编号:
YS2009JP01)。
作者简介:郭 勇(1984—) ，男，湖北公安人，研究实习员，主要从事
中药材栽培及引选的研究。E － mail:377738623@ qq． com。
三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et． Gilg)是葡
萄科崖爬藤属植物，别称蛇附子、石抱子、金线吊葫芦、三叶
青、三叶对、三叶扁藤、拦山虎、雷胆子等，是民间常用的中草
药［1］。三叶崖爬藤生于阴湿山坡、山沟或溪谷旁林下，主要
分布于我国西南及长江以南各地。三叶崖爬藤以块根或全草
入药，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能，药理试验表
明三叶崖爬藤提取物有抗病毒作用［2］、明显的消炎镇痛［3］及
保肝作用［4］，在民间有着广泛应用。目前对三叶崖爬藤的研
究多集中于生药鉴定、化学成分、药理功效等，还没有对其进
行分子学研究。本试验旨在通过对三叶崖爬藤进行 DNA 提
取和 RAPD引物筛选，为三叶崖爬藤的分子学研究打下基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
所用三叶崖爬藤采自浙江省东阳市山区，供试部分为新
鲜嫩叶。
1． 2 主要仪器和试剂
PCR仪、紫外光显色仪、离心机、电泳槽、试剂盒(北京天
恩泽基因科技有限公司生产，即用型 PCR 试剂盒 3． 0)、随机
引物(南京金斯瑞生物科技有限公司生产)。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 DNA 提取过程 将含有提取液的离心管放入 65 ℃
水浴中，保温 45 min，每 15 min 温和混匀 1 次。取出离心管
冷却至室温，加入等体积(1 mL)的 CI(氯仿 /异戊醇 = 24 /1，
体积比)抽提，温和而彻底地混合均匀，然后在室温下离心
(12 000 r /min，10 min)。转移离心后的上清液至新管中(必
要时用 CI重提 1 次) ，加入等体积冰冷的异丙醇，混合均匀。
室温下离心(12 000 r /min，10 min) ，弃去上清液，倒置离心管
于滤纸上 1 min，至水分完全挥发。加入 70%乙醇 0． 5 mL洗
涤，10 000 r /min离心 3 min，弃去上清液，加入 0． 5 mL双蒸水
溶解沉淀。
1． 3． 2 DNA 提取处理方法 (1)取 0． 5 g 三叶崖爬藤幼嫩
叶片，剪碎，置于研钵中，直接用 CTAB提取液研磨叶片，研磨
均匀后倒入 2 mL离心管;CTAB配方(100 mmol /L Tris － HCl，
pH 值 7． 5;0． 7 moL /L NaCl;10 mmol /L EDTA，pH 值 8． 0;
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DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2012.08.099
0. 02 g /mL CTAB)。(2)取 0． 5 g三叶崖爬藤幼嫩叶片，置入
研钵中，加液氮细细研磨成细粉，倒入 2 mL 离心管，加入
1 mL 上述 CTAB 提取液。(3)在上述 CTAB 提取液中加入
PVP(0. 03 g /mL)、偏重亚硫酸钠(20 mmol /L) ，然后用此提取
液研磨叶片，倒入 2 mL 离心管。(4)在处理(3)的基础上加
入 β －巯基乙醇(现用现加)。
1． 3． 3 DNA纯度检测 各取 5 μL各种处理的溶液，溴酚蓝
染色，0． 1 g /L琼脂糖凝胶电泳 15 min，EB 染色 20 min，在紫
外灯光下观察并拍照。
1． 3． 4 RAPD 试验及随机引物筛选 三叶崖爬藤为葡萄科
崖爬藤属植物，没有此种植物的分子学研究文献，在设计
RAPD试验时，参考葡萄相关研究的已发表论文。RAPD 扩
增反应程序设计为:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 1 min，
37 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，40 个循环;72 ℃ 延伸
5 min。反应结束后取 5 μL上样电泳，染色后进行紫外光检测。
表 1 葡萄相关论文中使用的 40 条引物的序列
编号 序列 编号 序列
1 AGGTGACCGT 21 CCAGATGGGG
2 AGTATGGCGG 22 CCAGGCTGAC
3 AGTCACTCCC 23 CCCAGTCACT
4 AGTCAGCCAC 24 CCCCGATGGT
5 AGTCGGCCCA 25 CCTGATCACC
6 AGTCGGCCCA 26 CCTTGACGCA
7 AGTCGGGTGG 27 CTACTGCGCT
8 AGTGCACACC 28 CTCAGTGTCC
9 CAAACGTCGG 29 TCGGCACGCA
10 CACCACTAGG 30 TCGGCGGTTC
11 CACCCCCTTG 31 TCTCAGCTGG
12 CACCGATCCA 32 TCTCCGCTTG
13 CAGACCGACC 33 TGCCGGTTCA
14 CAGAGGTCCC 34 TGCGCCCTTC
15 CAGGATTCCC 35 TGCTGCAGGT
16 CAGGCCCTTC 36 TGCTGCAGGT
17 CATCGCCGCA 37 TGGTCCAGCC
18 CCAACCCGCA 38 TGGTCGGGTG
19 CCAAGAGGCT 39 TGGTGGCGTT
20 CCACACTACC 40 TTCCCGTGCC
选择葡萄相关论文中使用的 40 条引物，其序列见表 1。
用提取出的 DNA模板，进行 PCR扩增反应，PCR 采用北京天
恩泽基因公司“即用型 PCR 试剂盒 3． 0”A 型，产品编号
90805。设计总反应体系 10 μL，在一干净的 PCR 管中，加入
下列成分:5 μL PCR MagicMix 3． 0，1 μL DNA 模板，0． 5 μL
PCR引物，3． 5 μL灭菌蒸馏水。
2 结果与分析
2． 1 DNA提取试验结果
只有处理 2 有明显亮条带，其余 3 种处理均无任何条带，
表明只有处理 2 提取出了高纯度的 DNA(图 1)。
2． 2 DNA提取试验分析
液氮的研磨对三叶崖爬藤 DNA的提取至关重要，研磨过
程应彻底，研磨至叶片成白色粉状，稍微带有一点绿色，并且
不能回潮，不能存在未研磨透的碎片。研磨后，应及时加入预
热的 CTAB缓冲液。加入异丙醇后，4 种处理都出现了大团
的白色物质，结合试验结果，证明提取出的 DNA 含有大量杂
质，并且 70%乙醇不能将其去除。
2． 3 RAPD试验结果
检测图片表明，RAPD试验的多态性并不优良，只有 4 条
引物(4:AGTCAGCCAC，13:CAGACCGACC，17:CATCGCCG-
CA，36:TGCTGCAGGT)扩增出比较明显的多条带(图 2)。
3 讨论
三叶崖爬藤是葡萄科植物，但与葡萄不同属，RAPD 试验
结果表明，它的随机引物多态性与葡萄有较大差别，应加强对
它的独立研究，不能将思维局限于葡萄文献。
随着社会的发展和研究水平的提高，三叶崖爬藤的药效
越来越得到承认和重视;无序采挖使三叶崖爬藤野生资源日
益枯竭，同时三叶崖爬藤对生长环境的要求非常苛刻，不易人
工种植，应从分子学角度研究三叶崖爬藤的生理规律，分辨不
同来源的三叶崖爬藤并鉴别伪品，以及为人工驯化创造条件。
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