全 文 ：中国农业科学 2008,41(2):607-612
Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2006-09-19；接受日期：2006-11-06
基金项目：广东省自然科学基金项目（032040）
作者简介：谢启鑫（1981-），男，江西南康人，硕士研究生，研究方向为植物遗传与转基因。Tel：0754-2902083；E-mail：biocrat@126.com。通讯
作者庄东红（1955-），女，广东普宁人，教授，博士，研究方向为植物遗传与转基因。Tel：0768-2522088；E-mail：dhzhuang@stu.edu.cn


君迁子叶片培养再生植株的研究
谢启鑫，黄美连，吴晓萍，庄东红
（汕头大学生物系，广东汕头 515063）

摘要：【目的】建立君迁子叶片离体再生体系，为转基因操作奠定基础。【方法】以君迁子幼叶为外植体，研
究适合其再生植株的叶片部位、放置方式、基础培养基、植物生长调节剂以及暗培养时间等条件。【结果】叶片基
部上表面朝下接种于 1/2MS+ ZT 5.0 mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1的培养基，先期暗培养 5周后转移至正常光照下培
养效果最好，愈伤组织形成率、不定芽再生率和外植体平均不定芽数分别为 100.0%、85.3%和 2.8±0.6 个。再生
芽接种于不含植物生长调节剂的 1/2MS 培养基上，30 d 时生根率达 100%，平均根数和平均根长分别达 5.4 条和
3.7 cm。再生植株炼苗后移栽，30 d 时成活率达 98.5%。【结论】成功地建立了君迁子叶片的离体再生体系。
关键词：君迁子；叶片；离体培养；再生植株

Plant Regeneration from Leaves of Date Plum (Diospyros lotus L.)
XIE Qi-xin, HUANG Mei-lian, WU Xiao-ping , ZHUANG Dong-hong
(Department of Biology, Shantou University, Shantou 515063, Guangdong)

Abstract:【Objective】This research aims at developing a plant regeneration system from leaf explants of Diospyros Lotus L.
thereby establish a foundation for transformation.【Method】Used tissue culture technique, the conditions for plant regeneration from
leaf explants of Diospyros Lotus L. such as leaf segment, inoculate method, basal medium, plant growth regulator and dark period
were investigated.【Result】The low segment of leaf with the adaxial surface downwards inoculated on 1/2MS medium containing
0.01 mg·L-1 indole-3-butyric acid(IBA) and 5.0 mg·L-1 zeatin, dark incubated for the first 5 weeks and then transferred to light was
the most optimum for shoot regeneration and the shoot percentage and average shoots number per explant were 85.3% and 2.8±0.6
respectively. Regenerated shoots were cut and transferred to 1/2MS medium without any plant growth regulator for rooting. After
cultured for one month, the rooting percentage, average roots number and length per shoot reached up to 100%, 5.4 and 3.7
centimeter respectively. After rooting, the regenerated plants were transplant in pots where 98.5% plants survived after one month.
【Conclusion】The plant regeneration system from leaf explants of Diospyros lotus L. was developed successfully.
Key words: Date plum(Diospyros lotus L.); Leaf segment; in vitro culture; Plant regeneration

0 引言
【研究意义】建立高效离体再生体系是利用遗传
转化技术培育柿树（Diospyros kaki Thunb.）及其砧木
新品系的重要基础和条件。【前人研究进展】对于柿
树的研究早期主要为种质资源调查、收集、整理和鉴
定，20 世纪 90 年代后国内外一些实验室先后运用现
代生物技术开展了柿优良品种微繁殖和转基因育种等
研究[1~6]。柿砧木的研究主要有嫁接亲和性调查、砧木
快速育苗、嫁接方法和机理、嫁接苗的生理生化特性
等[7~9]，但通过试管微繁殖的方法繁殖砧木研究不多[10,11]，
利用转基因技术改良砧木性状的研究尚未见报道。【本
研究切入点】君迁子（Diospyros lotus L.）又名黑枣，
根系发达，成活率高，寿命长，与柿树的许多优良品
种嫁接亲和性强，是中国北方常用的砧木，但有关其
离体再生的研究较少[12]。本研究拟建立君迁子的高效
离体再生体系，为培育转基因砧木新品系奠定基础。
【拟解决的关键问题】以君迁子幼叶为材料，研究组
织培养不同因素对诱导器官形成和植株再生的影响，
初步建立君迁子叶片离体再生体系，为利用叶盘法开
608 中 国 农 业 科 学 41 卷
展遗传转化研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
从室外栽培的一株君迁子上取休眠芽培养得到的
组培苗无性系群体，在含 0.5 mg·L-1 ZT 和 0.01
mg·L-1IAA 的 MS(1/2N)培养基上继代培养 7 次以上。
1.2 方法
1.2.1 叶片培养与不定芽诱导 组培苗继代培养 3
周后，在无菌条件下切取离顶端分生组织较近的第
3～4 片展开叶，横切成顶部、中部、基部、叶柄等 4
段，每段大小约为 4×4 mm，或全叶仅在中间横切两
条伤口，上表面朝下接种于添加 2.0 mg·L-1 ZT 和 0.1
mg·L-1 IBA 的 MS（1/2N）培养基上，试验叶片的不
同部位对不定芽诱导的影响。
切取叶片基部，随机分成相同数目的两组，按两
种不同的放置方式培养：一组上表面朝下、另一组下
表面朝下接种于添加 2.0 mg·L-1 ZT 和 0.1 mg·L-1 IBA
的 MS（1/2N）培养基上，对比观察不定芽的诱导情况。
分别以 MS、MS（1/2N）、1/2MS、1/2MS（1/2N）
为基础培养基，添加 2.0 mg·L-1 ZT 和 0.1 mg·L-1IBA，
叶片基部上表面朝下接种于培养基上，试验基础培养
基种类对不定芽诱导的影响。
以 1/2MS 为基础培养基，附加不同浓度的 ZT
（1.0、3.0、5.0、10.0 mg·L-1）和 IBA（0.01、0.1、1.0
mg·L-1），共 12 个处理，叶片基部上表面朝下接种于
培养基上，确定不同浓度的 ZT 与 IBA 组合对叶片不
定芽诱导的影响。
为了试验暗处理时间对不定芽诱导的影响，取叶
片基部上表面朝下接种于添加 5.0 mg·L-1 ZT 和 0.01
mg·L-1 IBA 培养基上，随机分成 9 组，先期暗处理 0～
8 周后转至正常光照下培养。
以上各处理均接种 35～40 个外植体，培养期间不
更换培养基，12 周后统计愈伤组织形成率、不定芽再
生率和外植体平均不定芽数。所有培养基均添加 0.8%
琼脂和 3%蔗糖，pH 调至 5.8 后于 121℃高压灭菌 15
min。培养物置于 24～26℃、光周期为 12 h、光照度
为 60 µmol·m-2·s-1的条件下（特殊处理除外）培养。各
试验均重复 2 次（下同）。
1.2.2 组培苗生根、炼苗及移栽 切取再生芽顶端
15～20 mm 长的一段，接种于不含植物生长调节剂的
1/2MS 培养基上诱导不定根的形成。4 周后统计生根
率、平均根数和平均根长。然后打开培养瓶盖，在培
养室炼苗 3 d，小心取出小苗，用自来水洗去基部琼脂，
移栽于盛有蛭石、河沙、塘泥各一份的培养盆中。基
质用 MS 培养液（稀释 500 倍）湿透，最初一周用塑
料薄膜保湿，以后逐渐打开[13]，4 周后以长出新叶新
根为植株成活的标志计算移栽成活率。
1.2.3 数据分析 所有数据均采用SPSS软件进行方
差分析。愈伤组织形成率=形成愈伤组织的叶片数/接
种叶片数×100%，不定芽再生率=再生叶片数/接种叶
片数×100%，叶片平均不定芽数＝再生芽总数/再生
叶片数。
2 结果与分析
2.1 叶片培养诱导不定芽
接种后 2 周，叶片开始膨胀，边缘逐渐向中央无
规则卷起，3 周左右于伤口处形成致密的愈伤组织，
颜色由暗黄至深褐，体积迅速增大。5 周时伤口末端
的愈伤组织处开始分化出绿色芽点（图 1-A），7 周
后不定芽分化率迅速上升，此后不定芽不断伸长（图
1-B）。
2.2 叶片不同部位对不定芽再生的影响
由表 1 可见，叶片基部的愈伤组织形成率、不定
芽再生率和外植体平均不定芽数都最高，分别为
100.0%、19.0%和 2.0±0.5 个，其中不定芽再生率显
著高于其它部位或全叶，说明叶片不同部位在不定芽
的诱导上存在显著差异。
2.3 叶片放置方式对不定芽再生的影响
由表 2 可见，上表面朝下接触培养基的叶片的愈
伤组织形成率、不定芽再生率和外植体平均不定芽数
分别为 100.0%、21.6%和 2.0±0.7 个，而下表面朝下
的叶片 3 个指标分别只有 53.1%、5.4%和 1.0±0.2 个，
两者间差异显著。
2.4 基础培养基种类对不定芽再生的影响
从表 3 可见，4 种基础培养基中，1/2MS 的培养
效果最好，MS（1/2N）和 1/2MS（1/2N）次之，MS
效果最差。1/2MS 的愈伤组织形成率、不定芽再生率
和外植体平均不定芽数分别达到 89.2%、32.5%和 2.5
±0.5 个，后两个数据均显著高于其它培养基。
2.5 不同浓度的 ZT 和 IBA 组合对不定芽再生的影响
表 4 结果显示，最适合君迁子叶片不定芽再生的
植物生长调节剂组合为 ZT 5.0 mg·L-1+IBA 0.01
mg·L-1，不定芽再生率和平均不定芽数分别达到 46.7%
和 3.0±1.0 个，其次是 ZT 10.0 mg·L-1+IBA 0.01
mg·L-1，两个指标分别为 44.8%和 2.2±0.8 个。ZT 浓
2 期 谢启鑫等：君迁子叶片培养再生植株的研究 609
度较低时再生率也低，甚至完全不能诱导再生。随着
IBA 浓度增加，外植体的愈伤组织形成率也有增加的
趋势，说明高浓度的 ZT 能促进不定芽的形成，而高
浓度的生长素能促进愈伤组织的生长。



A：出现芽点（图中箭头示芽点,培养 35 d）；B：不定芽不断伸长（培养 60 d）；C：再生苗生根（培养 30 d）；D：再生植株移栽成活（移栽 30 d）。
图中标尺示 10 mm
A: The leaf segments produced adventitious shoots（the arrows show buds, cultured for 35 d）; B: The adventitious shoots grows continuously (cultured for 60
d); C: Rooting (cultured for 30 d); D: Survived plantlets (30 d after transplanted ). Bars=10 mm

图 1 君迁子叶片培养再生植株
Fig. 1 Plant regeneration from leaf segments of D. lotus L.

表 1 叶片不同部位对不定芽再生的影响
Table 1 Effect of leaf segments on shoot regeneration of D. lotus L.
叶片部位
Leaf segment
不定芽再生率
Shoot percentage(%)
平均不定芽数
Shoot No. per explant
愈伤组织形成率
Callus percentage (%)
顶部 Top segment 9.4 c 1.3±0.4 b 90.6 bc
中部 Middle segment 15.6 b 1.8±0.6 a 93.2 b
基部 Basal segment 19.0 a 2.0±0.5 a 100.0 a
叶柄 Leaf stalk 0.0 e - 87.5 c
全叶 Whole leaf 6.3 d 1.5±0.3 b 100.0 a
同列内相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在 0.05 水平上差异不显著。下同
Mean separation within columns by Duncan’s multiple range test at P=0.05. The sameas below

表 2 叶片放置方式对不定芽再生的影响
Table 2 Effect of inoculate methods on shoot regeneration of D. lotus L.
放置方式
Inoculate method
不定芽再生率
Shoot percentage (%)
平均不定芽数
Shoot No. per explant
愈伤组织形成率
Callus percentage (%)
上表明朝下
Adaxial surface downwards
21.6 a 2.0±0.7 a 100.0 a
下表面朝下
Abaxial surface downwards
5.4 b 1.0±0.2 b 53.1 b

表 3 基础培养基种类对不定芽再生的影响
Table 3 Effect of basal mediums on shoot regeneration of D. lotus L.
培养基
Basal medium
不定芽再生率
Shoot percentage (%)
平均不定芽数
Shoot No. per explant
愈伤组织形成率
Callus percentage (%)
MS 4.2 d 1.0±0.1 c 57.9 c
MS (1/2N) 23.3 b 1.8±0.6 b 97.2 a
1/2MS 32.5 a 2.5±0.5 a 89.2 b
1/2MS (1/2N) 17.4 c 2.1±0.8 b 96.5 a
610 中 国 农 业 科 学 41 卷
表 4 不同浓度的 ZT 和 IBA 组合对不定芽再生的影响
Table 4 Effect of ZT and IBA with different concentrations on shoot regeneration of D. lotus L.
组合
Disposal
ZT
(mg·L-1)
IBA
(mg·L-1)
不定芽再生率
Shoot percentage (%)
平均不定芽数
Shoot No. per explant
愈伤组织形成率
Callus percentage (%)
1 1.0 0.01 0.0 h - 86.1 b
2 0.1 5.5 g 1.0±0.3 e 94.4 a
3 1.0 0.0 h - 97.2 a
4 3.0 0.01 28.0 c 1.9±0.7 c 85.0 b
5 0.1 23.6 d 1.7±0.5 cd 100.0 a
6 1.0 10.0 f 1.6±0.4 cd 100.0 a
7 5.0 0.01 46.7 a 3.0±1.0 a 84.4 b
8 0.1 18.2 e 2.3±0.6 b 87.5 b
9 1.0 20.4 e 1.5±0.4 d 100.0 a
10 10.0 0.01 44.8 ab 2.2±0.8 b 87.5 b
11 0.1 41.9 b 1.4±0.5 d 85.7 b
12 1.0 25.0 c 2.3±0.4 b 87.5 b

2.6 暗培养时间对不定芽再生的影响
由表 5 可见，一定时间的暗培养对君迁子叶片不
定芽的再生有促进作用。随着暗培养时间的增加，再
生率也提高，5 周时达到 85.3%，平均不定芽数达到
2.8±0.6 个，显著高于对照的 41.5%和 2.2±0.5 个。
但随着暗培养时间继续增加，再生率又有所下降。
2.7 生根、炼苗及移栽
再生芽接种于无植物生长调节剂的1/2MS培养基
上，30 d 时生根率达 100.0%，平均根数为 5.4 条，平
均根长为 3.7 cm（图 1-C）。再生植株经炼苗后移栽
至盛有蛭石、河沙、塘泥各一份的培养盆中。经统计，
30 d 时成活率达 98.5%（图 1-D）。

表 5 暗培养时间对不定芽再生的影响
Table 5 Effect of dark period on shoot regeneration of D. lotus L.
暗培养时间
Dark period (week)
不定芽再生率
Shoot percentage (%)
平均不定芽数
Shoot No. per explant
愈伤组织形成率
Callus percentage (%)
0 41.5 g 2.2±0.5 c 90.0 cd
1 46.3 f 2.7±0.6 ab 100.0 a
2 52.5 e 2.1±0.4 c 93.3 bc
3 57.0 d 1.5±0.3 d 94.5 b
4 78.2 b 2.6±0.7 b 86.7 d
5 85.3 a 2.8±0.6 ab 100.0 a
6 76.5 b 3.1±0.9 a 100.0 a
7 64.8 c 2.9±0.8 ab 96.7 ab
8 62.7 c 3.0±1.0 ab 100.0 a

3 讨论
已有人进行了农杆菌介导外源基因转化柿树
（Diospyros kaki Thunb.）叶片的研究，并成功获得转
入了抗性基因的再生植株[5]。笔者当前建立起来的君
迁子叶片离体再生体系，也为进一步利用遗传转化技
术改良其某些性状创造了条件。
柿属植物不同基因型的再生能力存在较大差异。
Tao等[14]曾以日本柿16个品种的叶原基培养得到的愈
伤组织为对象，研究基因型对不定芽形成的影响，结
果只有 8 个品种能形成不定芽，再生率从 72%到 2%
不等。Choi 等[1]对西村早生和富有叶片植株再生的研
究结果表明，在适当的培养条件下，两者的再生率都
能达到 100%。中国学者马俊莲等[2]也研究了甜柿上西
早生叶片不定芽的再生，其再生率为 86%，平均不定
芽数为 2.2 个。迄今未见君迁子叶片培养植株再生的
2 期 谢启鑫等：君迁子叶片培养再生植株的研究 611
报道，本试验获得了 85.3%的较高不定芽再生率和 2.8
±0.6 个平均不定芽数。
人们在培养植物叶片时常把叶片切成几段后一
起接种，然而叶片不同部位的再生能力可能存在差异。
王树耀等[15]研究 84 K 杨叶片的再生情况后发现，带
叶柄的基部再生率比其它部位高。笔者当前的研究也
表明，叶基部的再生能力最强，其再生率和平均不定
芽数都显著高于其它部位。有研究[16]表明，植物叶片
的某些有机营养成分含量从叶尖到叶基逐渐增加，这
可能是叶片不同部位再生能力存在差异的原因之一。
叶片的放置方式也会影响植株的再生。王艳等[17]
研究苹果砧木叶片再生后发现，叶片下表面朝下放置
的再生效果远好于上表面朝下放置。而王树耀等[15]研
究 84 K 杨叶片的再生后则得出相反的结论。对于柿属
植物的叶片培养，不同研究者采用的放置方式也不尽
相同[1,2]。本研究结果显示，君迁子叶片上表面朝下放
置，不论愈伤组织形成率、再生率还是平均不定芽数
均显著高于下表面朝下放置。
MS 培养基是木本植物组织培养中应用最为广泛
的一种基础培养基，大部分柿组培研究结果表明
1/2MS 和 MS(1/2N)培养基最适合柿培养[18]。笔者的研
究也得出相似的结论，君迁子叶片在 1/2MS 培养基上
无论不定芽再生率还是平均不定芽数都显著高于其它
培养基。这说明，柿属植物外植体的再生需要较低的
矿质元素含量。
细胞分裂素对于不定芽的再生起着关键的作用。
大部分研究报道均表明 ZT 对促进柿外植体的生长和
再分化效果最好，但浓度不宜过高[18]。生长素对于外
植体的分化起辅助作用，一般使用 IAA 或 IBA。Choi
等[1]研究后发现，西村早生再生的最佳植物生长调节
剂组合为 ZT 5.0 mg·L-1 +IBA 0.1 mg·L-1，富有为 ZT
10.0 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1。本研究结果表明，适合
君迁子叶片不定芽再生的最佳植物生长调节剂组合为
ZT 5.0 mg·L-1 +IBA 0.01 mg·L-1，其次为 ZT 10.0
mg·L-1+IBA 0.01 mg·L-1，说明高浓度的细胞分裂素和
低浓度的生长素组合能促进不定芽形成。
前人在诱导柿不定芽再生时几乎都采用光周期为
12～16 h 的光照培养[2,14]，然而有资料表明暗处理对
于某些植物叶片再生不定芽有十分重要的作用。Choi
等[1]比较研究了不同光暗培养时间后发现，光照严重
抑制富有的形态发生，而对西村早生的形态发生具有
轻度的抑制作用，一定时间的暗培养能提高再生频率。
本研究中，暗培养 5 周后再生率达到 85.3%，是对照
的 1 倍多，表明前期暗培养对君迁子叶片不定芽再生
有很好的促进作用。暗培养能促进愈伤组织增殖和外
植体的形态发生，其机理仍需进一步研究。
4 结论
本文成功建立了君迁子叶片的离体再生体系。以
此为基础开展遗传转化研究，可望获得具有某些特定
性状的砧木植株，再利用组织培养技术进行无性繁殖，
有望得到性状整齐的无性系砧木群体，这对于加快柿
树优良品种的推广栽培、建立整齐一致的果园均具有
重要的意义。

致谢：本研究的试验材料由华中农业大学罗正荣教授
惠赠，谨表谢意。

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（责任编辑 曲来娥）