全 文 ：第 45 卷 第 4 期 四 川 大 学 学 报 (工 程 科 学 版 ) Vol． 45 No． 4
2013 年 7 月 JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY(ENGINEERING SCIENCE EDITION)
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July 2013
文章编号:1009-3087(2013)04-0181-05
柳叶水甘草碱与牛血清白蛋白的相互作用
吴 笛，晏 瑾，白珂珂，王 庆，闫树军，李 晖*
(四川大学 化学工程学院，四川 成都 610065)
摘 要:利用亲和毛细管电泳法(ACE)研究了柳叶水甘草碱(TAB)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。结果表
明，柳叶水甘草碱与 BSA常温下结合常数为 8． 00 × 106 L·mol －1，热力学参数验证两者相互作用力以氢键和范德
华力为主。傅立叶变换红外光谱(FT － IR)进一步考察了柳叶水甘草碱对 BSA二级结构的影响，其结果是，柳叶水
甘草碱使得蛋白的 α －螺旋、β －转角含量降低，β －折叠含量上升。在分子水平，利用分子对接技术确定了柳叶水
甘草碱和牛血清白蛋白结合的适宜位置。
关键词:柳叶水甘草碱;亲和毛细管电泳;牛血清白蛋白;分子对接;相互作用
中图分类号:O657 文献标志码:A
Analysis of Interation Between Tabersonine and Bovine Serum Albumin
WU Di，YAN Jin，BAI Ke-ke，WANG Qing，YAN Shu-jun，LI Hui*
(College of Chem． Eng．，Sichuan Univ．，Chengdu 610065，China)
Abstract:Affinity capillary electrophoresis was employed to study the interaction between tabersonine(TAB)and bovine serum albumin
(BSA)． The results showed that the binding constant is 8． 00 × 106 L·mol －1 under normal temperature． The thermodynamic parame-
ters indicated that the interaction between tabersonine and BSA was driven mainly by hydrophobic interaction and van der Waals forces．
The secondary structure of BSA was changed in the presence of TAB according to the FT-IR results． It was shown that TAB reduced α
－ helix，β － turn and increased β － sheet． At the molecular level，the binding mode of TAB and BSA was determined by molecular
modeling method．
Key words:tabersonine;affinity capillary electrophoresis;bovine serum albumin;molecular modeling，interaction
当药物进入体内后会与血清白蛋白产生快速可
逆结合，发生相互作用，其结果必将影响药物的总体
功效、活性、毒性和代谢等。血清白蛋白在循环系统
中起着维持渗透压、pH 缓冲，作为载体和营养等作
用［1］。因此，研究血清白蛋白与药物的相互作用，
在药代动力学、药效和药理毒性方面具有重要意
义［2］。何梅等［3］使用紫外光谱法研究了大黄素、大
黄酸和大黄酚与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，
进一步探明其药物代谢途径。Tajmir-Riahi 等［4］利
用红外光谱、紫外光谱和圆二色谱研究了叶绿素和
叶绿酸与人血清白蛋白(HSA)结合模型，结合常数
以及对 HSA 二级结构变化的影响。Naik［5］等人利
用荧光和红外法对地塞米松和 HSA 的相互作用进
行了研究，为地塞米松这种药物在人体中如何更大
收稿日期:2013 － 01 － 15
作者简介:吴笛(1988—) ，女，博士生．研究方向:药物分析．
* 通信联系人 E-mail:lihuilab@ sina． com
的发挥药效提供了有力的指导。毛细管电泳法具有
简单、快捷、样品量少的特点也逐步用于研究 药物
与血清白蛋白相互作用［6 － 9］。
作者采用亲和毛细管电泳(ACE)法研究了长
春胺生物碱的合成前体化合物柳叶水甘草碱
(TAB)［10］与牛血清白蛋白的相互作用，利用傅立叶
红外变换光谱定量表征了相互作用前后 BSA 二级
结构的变化，同时进行了 TAB 与 BSA 的分子对接，
获得满意结果。
1 实验部分
1． 1 仪器与试剂
贝克曼 P /ACETM MDQ 毛细管电泳系统，Beck-
man Coulter Instrument，Fullerton，CA，USA，配置紫外
检测器;未涂层熔融石英毛细管(总长度 50． 2 cm，
有效长度 40 cm，内径 75 μm) ，河北永年锐沣色谱
器件有限公司;Nicolet － 6700 傅立叶红外(FT-IR)
DOI:10.15961/j.jsuese.2013.04.019
光谱仪(配有液体检测附件) ;Millipore synergy UV
超纯水系统(Milford，MA，USA) ;V0876X － 5 型混旋
仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司;KQ －
250DE型数控超声波仪，昆山市超声仪器有限公司;
BS224S电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限
公司;pHS － 3C酸度计(上海雷磁)。
牛血清蛋白(BSA) ，Sigma － Aldrich (美国)生
物技术公司，纯度 99%;柳叶水甘草碱，实验室自
提，(HPLC98%)［11］;硼砂(AR，Sigma) ;甲醇、氢氧
化钠均为分析纯，水为二次去离子水。
1． 2 测定条件
亲和毛细管电泳:
1)电泳条件:3． 45 × 10 －3Ma)气压进样 5 s，分
离电压 20 kV;紫外光谱检测波长 214 nm;甲醇作为
电渗流标记物。
2)毛细管预处理:每次电泳前均先用 5． 0 ×
10 －1 mol /L NaOH水溶液，去离子水，运行缓冲液分
别冲洗毛细管 6、5、5 min，所有溶液均经过 0． 45 μm
醋酸纤维素微孔滤膜过滤。
3)操作步骤:以 1． 0 × 10 －3 mol /L 柳叶水甘草
碱甲醇溶液作为样品进样，电泳运行缓冲溶液为
0． 01 mol·L pH 7． 4 的硼砂缓冲液(PBS) ，其中
BSA(硼砂缓冲溶解)的浓度梯度增加，依次为0、
3． 0 × 10 －6、6． 0 × 10 －6、9． 0 × 10 －6、1． 2 × 10 －5、1． 5
× 10 －5、1． 8 × 10 －5 mol /L，考察在不同 BSA 浓度下
柳叶水甘草碱的迁移情况。改变柱温 (25 、30 和
37 ℃) ，按上述步骤操作，相同条件下重复操作 3
次，结果取平均值，考察药物与 BSA的结合。
傅立叶红外变换光谱 FT-IR光谱均采用衰减全
反射(ATR)方法记录，将采集样品均匀铺满于液样
采集晶片，在分辨率为 4 cm －1，室温环境下敞开状
态收集背景，重复扫描 64 次样品。BSA和柳叶水甘
草碱浓度均为 4． 0 × 10 －4 mol·L。分别采集 BSA
作用前后的红外光谱图，以及缓冲液和药物的红外
光谱图。BSA作用前光谱图与缓冲液光谱图差谱得
到相互作用前 BSA的红外光谱，BSA作用后光谱图
与药物光谱图差谱得到相互作用后 BSA 红外光谱
图。将得到的红外差谱在 1 600 ～ 1 700 cm －1波数
段进行傅立叶去卷积处理和线性拟合，获得各子峰
的吸收频率和峰宽，并对其进行多次拟合使残差最
小，对得到的每一个子峰进行归属，根据其积分面积
计算各个二级结构的相对百分含量。
分子对接 BSA 的晶体结构来自于 Brookhaven
蛋白数据库(pdb code:3v03) ，TAB 的初始 3D结构
由 ChemiDraw11． 0 分子模拟软件包生成。再用
Gasteiger-Huckel优化分子的几何结构，修饰结构后
在 Linux操作系统上运用 sybyl8． 0 软件包基于探针
位置进行分子对接。用遗传算法来计算蛋白分子与
药物分子结合的可能构象，选择结合能量最小的结
果，最后用 Molsoft ICM Browser 软件编辑查看结合
构象。
2 结果与讨论
2． 1 结合常数及热力学参数的测定
2． 1． 1 结合常数测定
蛋白分子在电场作用下通过毛细管发生迁移
时，蛋白分子的电泳淌度主要由蛋白质分子的荷 /质
比和蛋白分子周围存在的化学微环境决定。药物能
与蛋白分子发生作用，蛋白 －药物复合物的荷 /质比
与蛋白分子不同，导致电泳淌度发生变化［12］。固定
药物浓度，以不同浓度的蛋白为缓冲溶液，当柳叶水
甘草碱与 BSA以 1∶ 1摩尔比结合形成复合物时［13］，
存在快速平衡 →S + L S － L，可得二者结合常数 K
= c(S － L)/c(S)c(L) ，游离的 TAB，BSA 及其结合
物在电泳中的迁移率由游离分子和结合物的浓度共
同决定:
μi =
c(S)
c(S)+ c(S － L)μf +
c(S － L)
c(S)+ c(S － L)μe
(1)
可得:
μi =
μf + μeKc(L)
1 + Kc(L) (2)
式中，c(L)为受体分子即 BSA 的游离浓度，c(S)为
配体分子即 TAB 的游离浓度，c(S － L)为 BSA 与
TAB结合物的浓度，μi 为 TAB 的表观迁移率，μf 为
TAB的自由迁移率，μe 为结合物的迁移率，K 为结
合常数。
(μi － μf)=
(μi － μf)Kc(L)
1 + Kc(L) (3)
将式(2． 3)整理为
(μi － μf)
c(L) = － K(μi － μf)+ K (μe － μf) (4)
这就是著名的 Scatchard方程，也可称为 x －倒数法，
式(2． 4)又可变形为:
c(L)
(μi － μf)
= 1
(μi － μf)
c(L)+ 1
(μe － μf)K
(5)
式(2． 5)称为 y －倒数法［14 － 15］。分别测定不同 BSA
浓度下电泳淌度的变化，以 c(L)/(μi － μf)对 c(L)
281 四川大学学报(工程科学版) 第 45 卷
线性回归，所得直线的斜率为 1 /(μe － μf) ，截距为
1 /K(μe － μf) ，斜率与截距相比即得 K。
在 pH 7． 4 的 1． 0 × 10 －2 mol /L硼砂缓冲体系下
电流稳定，约 35μA 左右，且基线平稳。图 1 为 37
℃下柳叶水甘草碱在不同 BSA 浓度缓冲溶液中的
毛细管电泳图。
a． 0 mol /L;b． 3． 0 × 10 －6 mol /L;c． 6． 0 × 10 －6 mol /L;
d． × 10 －6 mol /L;e． × 10 －6 mol /L;f． 1． 5 × 10 －6 mol /L;
g． 1． 8 × 10 －6 mol /L。
图 1 TAB在不同 BSA浓度下的电泳谱图
Fig．1 Electropherogram of TAB under different BSA concentrations
表 1 给出了 25、30、37 ℃下实验所得的结合常
数 K，其数量级均在 106L /mol，说明柳叶水甘草碱与
血清白蛋白有较强的结合能力，可以在体内被血清
白蛋白储存转运。温度对其结合常数影响较大，温
度升高 K值明显降低。
表 1 毛细管电泳所得不同温度下 TAB与 BSA结合常数
Tab． 1 Binding constant between TAB and BSA under dif-
ferent temperature
T /℃ K /(L·mol － 1) R2
25 8． 00 × 106 0． 999 7
30 5． 19 × 106 0． 999 4
37 2． 38 × 106 0． 998 1
2． 1． 2 热力学参数测定
药物与生物分子间的作用力主要有疏水作用、
静电作用、范德华力及氢键作用。通常根据蛋白结
合过程中热力学参数的值可判断它们二者之间的作
用力的种类。结合过程中的焓变(ΔH) ，熵变(ΔS)
以及吉布斯自由能的变化(ΔG)等热力学参数可以
由如下方程来计算:
ln K = － ΔH /RT + ΔS /R (6)
ΔG = ΔH － TΔS (7)
根据实验所得不同温度下结合常数，可求得结合过
程中的 ΔH、ΔS及 ΔG。以对作图，ΔH与 ΔS 可分别
由直线的斜率和截距求得，ΔH与 ΔS 在所研究温度
范围内被认为是一个常数，进而得出各个温度下的
ΔG。
表 2 中所列为 ACE法测定的 TAB与 BSA结合
的热力学参数，ΔG ＜ 0 表明结合反应是一个放热过
程，它们之间的结合是自发进行的;ΔH ＜ 0 和 ΔS ＜ 0
表明氢键和范德华力为二者结合过程的主要作用
力［16］。
表 2 毛细管电泳所得热力学参数
Tab． 2 Thermodynamic parameters
T /℃ ΔG ΔH ΔS 作用力类型
25 － 39． 38 － 81． 50 － 141． 01 氢键和范德华力
30 － 38． 95 － 81． 50 － 141． 01 氢键和范德华力
37 － 37． 84 － 81． 50 － 141． 01 氢键和范德华力
2． 2 蛋白构象变化的定量表征
为进一步考察 TAB对 BSA二级结构的影响，进
行了红外光谱实验。白蛋白的红外光谱根据其位置
的不同，分别称为酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中酰胺Ⅰ带和酰
胺Ⅱ带是公认的二级结构敏感带，均适合做二级结
构分析［17］。但一般蛋白质的 IR 谱中，酰胺 II 带极
弱，因此 90%的蛋白质结构的研究工作都是借助于
酰胺Ⅰ(1 600—1 700 cm －1)带，主要为氨基酸残基
的 C O 的伸缩振动。对酰胺Ⅰ带的划分较多为:
1 610 ～ 1 640 cm －1为 β －折叠;1 640 ～ 1 650 cm －1
为无规则卷曲;1 650 ～ 1 658 cm －1为 α －螺旋;1 660
～ 1 700 cm －1为 β －转角。
根据红外光谱差谱数据，通过傅立叶去卷积分
辨出蛋白质不同二级结构的吸收子带，用曲线拟合
方法定量计算出各二级结构的百分比［18］。
图 2 为柳叶水甘草碱与 BSA 相互作用前后的
蛋白质酰胺Ⅰ带的曲线拟合图。结果显示加入柳叶
水甘草碱后，因为 α －螺旋的解螺旋，白蛋白的 α －
螺旋含量减少，由 52． 10%下降到 46． 06%;β －折叠
含量增加，由 30． 32%上升到 40． 59%;β －转角含量
减少，由 17． 58%下降到 13． 35%。由此说明，柳叶
水甘草碱的结合使牛血清白蛋白结构的构象发生了
变化，改变了蛋白质的二级结构。
2． 3 分子对接
分子对接的目的是寻找底物分子和受体分子间
的最佳结合位置［19 － 20］。实验所得的最优化结果如
图 3 所示。截取药物分子周围的氨基酸残基可见，
柳叶水甘草碱分子被天冬氨酸(Asp450) ，精氨酸
(Arg194) ，谷氨酸(Glu291) ，赖氨酸(Lys294) ，丙氨
酸(Ala314)等包围。其中分子中羰基上的 O 原子
381第 4 期 吴 笛，等:柳叶水甘草碱与牛血清白蛋白的相互作用
与 Lys294 上的 H原子形成氢键，显示了氢键是柳叶
水甘草碱与 BSA作用的一种主要相互作用力，这与
热力学参数研究中作用力主要为氢键和范德华力的
实验结果相吻合。
(a)BSA
(b)BSA-TAB
图 2 BSA和 BSA-TAB体系的酰胺Ⅰ带的曲线拟合图
Fig． 2 Curve fitting of amide Ⅰ of free BSA and TAB-
BSA system
图 3 柳叶水甘草碱与牛血清蛋白相互作用的分子模型
Fig． 3 Iinteraction mode between TAB and BSA
3 结 论
在模拟生理条件下，利用亲和毛细管电泳法研
究了柳叶水甘草碱和牛血清白蛋白间的相互作用，
由所得的结合常数，热力学参数初步探明二者间的
作用机理，分子对接实验进一步证实氢键和范德华
力为二者主要作用力。药物与蛋白相互作用的研
究，对其药物代谢、转运及临床等具有重要的指导意
义。
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(编辑 黄小川)
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