全 文 ：刘　婵 ,王　博 ,段　青 ,等.滇山茶基因组 DNA不同提取方法效果比较 [ J] .江苏农业科学 , 2010(6):49-50.
滇山茶基因组 DNA不同提取方法效果比较
刘　婵 , 王　博 , 段　青 , 黄海泉
(西南林学院园林学院 ,云南昆明 650224)
　　摘要:选取 3个滇山茶品种(“早桃红”、“柳叶银红”及 “菊瓣”)采用 4种方法(CTAB法 、改良的 CTAB法 、SDS法
及改良的 SDS法)进行基因组 DNA提取 ,并对提取效果进行了比较分析。结果表明 , CTAB法提取效果最佳 ,其次为
改良的 CTAB法 ,而 SDS法不能有效地提取 DNA。同时发现 , 不同品种之间 DNA提取效果也存在差异 , 柳叶银红
DNA提取浓度及纯度最高(D
260 nm/D280nm=1.976 2), 其次为菊瓣 , 最差为早桃红。本研究为下一步进行滇山茶分子
标记研究与应用奠定了基础。
　　关键词:滇山茶;基因 DNA;提取方法;效果比较
　　中图分类号:Q781　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)06-0049-02
(上接第 48页)
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　　滇山茶(CamelliareticulataL.)为山茶科山茶属的常绿灌
木或小乔木 ,系原产云南高原的特有种 ,被列为 “云南八大名
花 ”之首 ,常作年宵花卉 ,是兼生态效益 、经济效益和社会效
益于一身的优良园林树种之一 。据统计 ,滇山茶现有品种已
达 100多个;但目前还是主要从形态学等方面对其进行鉴定 ,
且无统一标准 。因此 ,同种异名或异种同名的现象较突出 ,资
源家底不清也是限制进一步研究与发展的首要障碍 。
现代分子生物学标记技术为植物的系统分类和品种鉴定
收稿日期:2010-02-02
基金项目:云南省教育厅基金(编号:08Y0200);省部级重点学科及
校实验室共享平台资助项目。
作者简介:刘　婵(1985—),女 ,重庆人 ,硕士研究生 ,研究方向为园
林植物遗传育种。 E-mail:goodfish@yeah.com。
通信作者:黄海泉 ,博士 ,副教授 ,从事园林植物基因工程和遗传育种
研究工作。 Tel:(0871)3863976;E-mail:haiquanl@163.com。
等研究提供了新工具 ,但基因组 DNA提取质量往往是影响试
验结果的关键因素 [ 1 ] 。滇山茶叶片中含有较多的次生代谢
物(如酚类 、多糖等),影响基因组 DNA分离质量 ,这类含较
多次生代谢物影响基因组 DNA分离的植物被标为顽拗植物
(recalcitrantplant)[ 2 ] 。因此 ,研究和探讨滇山茶基因组 DNA
分离和提取的最适方法 ,将为后期开展滇山茶分子标记及分
子生物学研究奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
3个滇山茶供试品种早桃红(EarlyCrimson)、柳叶银红
(WilowLeafSpinelPink)、菊瓣(ChrysanthemumPetal)叶片样
本 ,均采自中国科学院昆明植物研究所山茶园 ,采集样本于
-70 ℃保存 。
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA提取方法　(1)CTAB法 [3 ] 。 (2)改良的
—49—江苏农业科学　2010年第 6期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.06.166
CTAB法:步骤 1和步骤 2与 CATB法相同 ,加入 3% CTAB液
1.2mL,搅匀 ,水浴 1 h,离心 ,将上清液转入 2 mL离心管中 ,
加入等体积的氯仿—异戊醇—乙醇混合液 (80 ∶4 ∶16),轻
轻摇匀 。取上清液转入另一离心管中 , 加入 1 /10体积的
10% CTAB液 ,摇匀 ,再加入等体积氯仿—异戊醇—乙醇混合
液(80∶4 ∶16), 轻轻摇匀 , 其余步骤同 CTAB。 (3)SDS
法 [ 4 ] 。(4)改良的 SDS法:材料研磨后加 1.2 mL提取液
(0.4 mol/L葡萄糖 、3%可溶性 PVP、 10 mmol/Lβ -巯基乙
醇),摇匀 , 12 000 r/min离心 10min,弃上清液 ,加 1.2 mL提
取液 ,悬浮 , 12 000r/min离心 10min,弃上清液 ,用 1.2mL裂
解液 [ 0.1 mol/LTris(pH值 8.0)、 20 mmol/LEDTA、
0.5mol/LNaCl、 1.5% SDS)] 裂 解 , 65 ℃水浴 1 h,
12 000 r/min离心10min。将上清液移入新的离心管中 ,加入
等体积的氯仿—异戊醇—乙醇混合液(80 ∶4 ∶16),轻轻混
匀 ,室温静置 10min, 12 000r/min离心 10 min,步骤 4同 SDS
法 ,将离心管从冰箱中取出 , 12 000r/min离心 10 min,弃上清
液 ,转入 0.3 mLTE[ 10mmol/LTris(pH值 8.0), 1mmol/L
EDTA(pH值 8.0)]中 ,加入 1/10体积的 3 mol/LNaAc(pH
值 5.2)及 2倍体积无水乙醇 , -70 ℃放置 30 min,离心 ,弃上
清液 ,其余步骤同 SDS法 。
1.2.2　基因组 DNA提取效果检测 　琼脂糖凝胶电泳检测 ,
采用紫外可见分光光度计检测基因组 DNA的浓度及纯度 。
2　结果与分析
2.1　电泳检测结果
由于 SDS法在采用异丙醇沉淀基因组 DNA时出现分
层 ,并没有很好地提取出 DNA,因此 SDS法不适用于滇山茶
基因组 DNA提取 。
2.2　基因组 DNA纯度分析
由表 1可知 , CTAB法提取滇山茶基因组 DNA效果最
好 ,其中品种柳叶银红的 D260 nm/D280 nm =1.976 2 , 2>(D260 nm/
D280 nm)>1.8 ,说明不是蛋白质 , RNA的含量极微 ,符合基因
组 DNA的纯度要求 [ 5 ] 。改良的 SDS法提取效果最差 ,其中
品种早桃花的 D260 nm/D280 nm =1.480 9。
表 1　滇山茶基因组DNA不同提取方法的纯度比较
品种 CTAB
D260nm D280nm (D260 nm/D280 nm)均值
改良的 CTAB
D260nm D280nm (D260 nm/D280nm)均值
改良的 SDS
D260 nm D280nm (D260nm/D280nm)均值
早桃红 0.109 1 0.068 6 1.591 8 0.080 0 0.047 6 1.681 5 0.090 6 0.061 3 1.480 9
0.109 0 0.068 4 0.078 7 0.047 0 0.090 2 0.060 8
0.109 1 0.068 5 0.078 5 0.046 4 0.090 3 0.0610
柳叶银红 0.155 2 0.078 5 1.976 2 0.168 9 0.087 6 1.927 9 0.207 1 0.109 9 1.892 2
0.154 9 0.078 4 0.169 6 0.088 2 0.207 5 0.109 5
0.154 9 0.078 4 0.169 7 0.087 8 0.207 4 0.109 4
菊瓣 0.104 8 0.056 9 1.841 8 0.074 1 0.041 1 1.823 3 0.112 3 0.062 3 1.796 1
0.104 6 0.056 7 0.073 4 0.040 2 0.111 0 0.062 4
0.104 6 0.056 7 0.073 3 0.039 8 0.111 5 0.061 8
3　结论与讨论
本研究发现所用的 4种方法中 ,由于 SDS法在加入异丙
醇沉淀 DNA时 ,经过离心后出现异常现象 ,离心管内的液体
出现分层 ,并且未出现 DNA絮状沉淀 ,因此该方法不能有效
地提取滇山茶基因组 DNA。本试验同时发现 ,相同品种材料
不同方法提取 DNA的效果存在差异 ,同种方法不同品种材料
DNA提取结果也存在差异 。综上所述 ,能有效提取滇山茶基
因组 DNA的方法为 CTAB法 、改良的 CTAB法和改良的 SDS
法 ,而 SDS法不能有效地提取滇山茶基因组 DNA。本试验不
同品种不同方法提取 DNA的实际效果比较结果为:C2 >C2′
>S2′>C3 >C3′>S3′>C1′>C1 >S1 ′(代号同图 1)。
研究过程中还发现 ,基因组 DNA提取的材料以新鲜的嫩
叶样品最好 ,其次是低温保存的嫩叶样品 ,在滇山茶叶基因组
DNA提取过程中 ,所有操作步骤都应尽量在低温下进行 [ 6] 。
由于滇山茶叶片受伤后 ,其中的多酚类物质很快地被氧化 ,因
此 ,在提取前叶片的处理十分关键 ,应将其存放在 -70 ℃冰
箱中 ,且在与提取缓冲液接触前 ,慎防冰冻样品融化 。
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