全 文 ：第一作者 Tel:13757170891;E － mail:leozhwt@ 163． com
HPLC法同时测定颠茄片 5 个指标成分含量及特征图谱分析
张文婷1，高杰1，岳超1，黄伟2，赵维良1
(1. 浙江省食品药品检验所，杭州 310004;2. 浙江医学高等专科学校，杭州 310053)
摘要 目的:建立不同生产企业颠茄片中 5 个指标成分的含量和专属的颠茄片特征图谱检测方法。方法:采用Welch XB － C18
(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇 － 0. 05%磷酸，梯度洗脱，流速 1. 0 mL·min －1，检测波长 344 nm柱温 30 ℃。
结果:5 个指标成分东莨菪苷、绿原酸、山柰素 － 3 － O －半乳糖 －(6→1)鼠李糖 － 7 － O －葡萄糖苷、东莨菪内酯和芦丁在含量
分析测定条件下，各组分分离，线性范围分别为 32. 60 ～ 978. 0、10. 00 ～ 300. 0、31. 90 ～ 957. 0、36. 3 ～ 1089 和 10. 10 ～ 303. 0 ng，
加样回收率在 97. 6% ～ 99. 7%之间;在特征图谱研究中，以东莨菪内酯为参照峰，标定了 16 个共有峰，分析的 13 批颠茄片与
共有模式之间有良好的相似性，相似度在 0. 9 以上。结论:建立的含量测定及特征图谱分析方法灵敏度高、结果准确、专属性
强，可用于颠茄片的质量控制。
关键词:颠茄片;东莨菪苷;绿原酸;山柰素 －半乳糖 －鼠李糖 －葡萄糖苷;东莨菪内酯;芦丁;指标成分;特征图谱;高效液相色谱
中图分类号:A 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2014)12 － 2154 － 06
Study on simultaneous determination of five main marker components in
belladonna tablets and fingerprint analysis by HPLC
ZHANG Wen － ting1，GAO Jie1，YUE Chao1，HUANG Wei2，ZHAO Wei － liang1
(1. Zhenjiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 310004，China;2. Zhejiang Medical College，Hangzhou 310053，China)
Abstract Objective:To establish a simultaneous determination of five main marker components and specific
HPLC fingerprint method for the quality evaluation of belladonna tablets from different manufactories． Methods:A
Welch XB － C18column(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)was adopted with methanol － 0. 05% phosphoric acid as the mo-
bile phase for gradient elution at a flow rate of 1. 0 mL·min －1;the detection wavelength was 344 nm and the col-
umn temperature was 30 ℃ ． Ｒesults:The result showed that five main marker components(scopolin，chlorogenic
acid，kaempferol － 3 － O － β － D(6 － O － α － L － rhamnogalactoside)－ 7 － O － β － D － glucoside，scopoletin and
rutin)were separated well． The correlation coefficients were 0. 9998，0. 9996，0. 9995，0. 9994 and，0. 9994 respec-
tively，the linear ranges of five components were 32. 60 － 978. 0，10. 00 － 300. 0 ng，31. 90 － 957. 0，36. 30 － 1089
ng and 10. 10 － 303. 0 ng，respectively，and the average recoveries ranged from 97. 6% to 99. 72%. Totally 16 com-
mon peaks were calibrated with scopoletin as the reference peak． There were good similarities between the standard
fingerprint chromatogram and each fingerprint chromatogram of the thirteen samples with their similarity coefficients
no less than 0. 9． Conclusion:The method is fast，accurate，sensitive and suitable for the quality control of bella-
donna tablets．
Key words:belladonna tablet;scopolin;chlorogenic acid;kaempferol － rhamnogalactoside － glucoside;scopoletin;
rutin;marker compound;fingerprint;HPLC
颠茄片由颠茄浸膏制成，为抗胆碱药，用于胃及
十二指肠溃疡，胃肠道、肾、胆绞痛等。颠茄浸膏的
原料为茄科植物颠茄 Atropa belladonna L．的干燥全
草，原产欧洲，1809 年英国药典已有收载，20 世纪传
入中国，浙江省温州地区为传统的种植基地，现在山
东、湖南等地有引种，主要作为提取颠茄流浸膏和颠
茄浸膏的原料使用［1］，其主要成分为莨菪类生物碱
及黄酮类、香豆素类化合物等［2］。黄伟、张楠等应
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用 ＲP － HPLC测定了颠茄草［3 － 4］、颠茄片［4］中阿托
品、山莨菪碱、东莨菪碱的含量;姜家书、王全华、杨
志明等学者采用 HPLC［5 － 7］、薄层扫描［8］和毛细管
电泳 －电致化学发光法［9］等技术测定了颠茄流浸
膏或莨菪浸膏或维 U颠茄铝胶囊中阿托品的含量，
但目前对颠茄草制剂的报道仅限于阿托品、东莨菪
碱、山莨菪碱的含量测定。由于质控指标的欠缺，颠
茄片及其原料出现化学勾兑现象，黄伟等［10 － 11］通过
薄层色谱显色法对市售颠茄片和颠茄流浸膏进行筛
查，结果多批颠茄片和颠茄流浸膏中有添加阿托品
现象，张文婷等［12］采用特征图谱技术鉴别颠茄流浸
膏和颠茄浸膏的真伪，结果约 16%的产品被检出不
含颠茄草成分。针对颠茄片质量的风险点，本文采
用 HPLC法对颠茄片生物碱外的其他类特征成分进
行了研究，测定了不同企业生产的颠茄片中 5 个成
分的含量，并采用相同色谱条件建立了颠茄片特征
指纹图谱，为科学评价颠茄片质量提供依据。
1 仪器与试药
Agilent 1100 系列高效液相色谱仪(G1322A 脱
气机，G1311A四元泵，G1313A自动进样仪，G1316A
柱温箱，G1314A 紫外检测器，Chemstation 色谱工作
站) ;甲醇为色谱纯(德国 Merck 公司) ，水为注射用
水，其他试剂均为分析纯。
对照品绿原酸(批号 110753 － 200413，含量测
定用)、东莨菪内酯(批号 110768 － 200504，含量
测定用)、芦丁(批号 100080 － 200707，含量测定
用)均购自中国食品药品检定研究院;东莨菪苷、
山柰素 － 3 － O －半乳糖 －(6→1)鼠李糖 － 7 － O
－葡萄糖苷均为自制，纯度 ＞ 98%。颠茄片样品
共 16 批，分别由各药品生产企业提供，颠茄草、颠
茄流浸膏、颠茄片相关性研究样品等由烟台鲁银
药业有限公司提供。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件
色谱柱:Welch XB － C18(250 mm × 4. 6 mm，
5 μm) ;流动相:A 相为甲醇，B 相为 0. 05%磷酸溶
液，梯度洗脱条件见表 1;流速:1. 0 mL·min －1;柱
温:30 ℃;检测波长:344 nm;进样量:10 μL。
表 1 梯度洗脱程序
Tab 1 Gradient steps of elution program
时间(time)/min A /% B /%
0． 00 3 97
5. 00 15 85
60. 00 60 40
2. 2 溶液制备
2. 2. 1 混合对照品溶液 精密称取以五氧化二磷
为干燥剂减压干燥 24 h的对照品适量，加 50%甲醇
制成每 1 mL含东莨菪苷、绿原酸、山柰素 － 3 － O －
半乳糖 －(6→1)鼠李糖 － 7 － O －葡萄糖苷、东莨菪
内酯、芦丁为 32. 56、14. 98、42. 52、14. 50、和 6. 20
μg的混合溶液，即得。
2. 2. 2 供试品溶液 取本品 100片，精密称定，研细，
精密称取约相当于 50片的量，置 100 mL锥形瓶中，精
密加入 50%甲醇 25 mL，称定重量，超声处理(功率 400
W，频率58 kHz)15 min，放冷，再称重量，用50%甲醇补
足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2. 3 多指标成分含量分析
2. 3. 1 标准曲线 精密量取上述混合对照品溶液
1、2、5、10、15、20、30 μL，分别按照“2. 1”项下色谱
条件进样测定，记录峰面积，以峰面积 Y 为纵坐标，
进样量 X(ng)为横坐标进行线性回归，结果表明各
成分在各自浓度范围内线性关系良好，见表 2。
表 2 各成分标准曲线
Tab 2 Linear equation for different compounds
成分(component)
回归方程
(linear equation)
r
线性范围
(linear range)/ng
东莨菪苷(scopolin) Y =1. 652 × 103X + 3. 995
× 103
0. 9999 32. 6 － 978. 0
绿 原 酸 (chlorogenic
acid)
Y =1. 982 × 103X + 3. 302
× 103
0. 9998 10. 0 － 300. 0
山柰酚 － 3 － O －半乳
糖 －(6→1)鼠李糖 －
7 － O － 葡 萄 糖 苷
［kaempferol － 3 － O －
β － D(6 － O － α － L －
rhamnogalactoside) －
7 － O － β － D – gluco-
side］
Y =1. 468 × 103X + 6. 857
× 103
0. 9997 31. 9 － 957. 0
东莨菪内酯(scopole-
tin)
Y =3. 723 × 103X + 1. 846
× 104
0. 9997 36. 3 － 1089. 0
芦丁(rutin) Y =1. 561 × 103X + 2. 226
× 103
0. 9997 10. 1 － 303. 0
2. 3. 2 精密度试验 分别精密吸取混合对照品溶液
10 μL，连续进样 6 次，以峰面积值为指标计算 ＲSD
(n =6) ，考察方法精密度。结果东莨菪苷、绿原酸、山
柰酚 －3 －O －半乳糖 －(6→1)鼠李糖 －7 － O －葡萄
糖苷、东莨菪内酯和芦丁的 ＲSD 分别为 0. 1%、
0. 1%、0. 3%、0. 3%和 0. 3%，表明精密度良好。
2. 3. 3 重复性试验 按照“2. 2. 2”项下方法制备
—5512—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(12)
供试品溶液 6 份，分别以“2. 1”项下色谱条件进样
测定 5 个成分的含量，计算 ＲSD，考察方法重复性。
结果东莨菪苷含量为 0. 218 mg·g －1，ＲSD为 1. 4%
(n = 6) ;绿原酸含量为 0. 055 mg· g －1，ＲSD 为
2. 7%(n = 6) ;山柰酚 － 3 － O －半乳糖 －(6→1)鼠
李糖 － 7 － O －葡萄糖苷含量为 0. 158 mg·g －1，ＲSD
为 2. 7%(n = 6) ;东莨菪内酯含量为 0. 097 mg·
g －1，ＲSD为 1. 4%(n = 6) ;芦丁含量为 0. 037 mg·
g －1，ＲSD为 2. 6%(n = 6)。
2. 3. 4 回收率试验 取“2. 3. 3”项下已测知含量
的样品 6 份，每份 1. 5 g，分别精密加入对照品溶液
适量(东莨菪苷 0. 3256 mg、绿原酸 0. 0749 mg、山
柰酚 － 3 － O －半乳糖 －(6→1)鼠李糖 － 7 － O －
葡萄糖苷 0. 6803 mg、东莨菪内酯 0. 1450 mg、芦丁
0. 0620 mg) ，按“2. 2. 2”项下方法制备供试溶液，
以“2. 1”项下色谱条件分别测定各成分的量并计
算回收率，考察方法准确度(回收率)。结果东莨
菪苷、绿原酸、山柰酚 － 3 － O －半乳糖 －(6→1)鼠
李糖 － 7 － O －葡萄糖苷、东莨菪内酯和芦丁平均
加样回收率(n = 6)分别为 97. 7%、99. 7%、
98. 2%、99. 7% 和 99. 4%，ＲSD 分别为 2. 5%、
3. 1%、1. 7%、2. 0%和 2. 6%，说明本法的准确度
良好。
2. 3. 5 稳定性试验 取同一份重复性试验供试品
溶液，在 0、1、2、4、8、12、24 h分别按“2. 1”项下色谱
条件进样分析，以峰面积为指标计算 ＲSD，考察供
试品溶液稳定性。结果东莨菪苷、绿原酸、山柰酚 －
3 － O －半乳糖 －(6→1)鼠李糖 － 7 － O －葡萄糖苷、
东莨菪内酯和芦丁峰面积的 ＲSD(n = 7)分别为
1. 7%、0. 9%、0. 2%、0. 8%和 1. 8%，表明供试品溶
液在 24 h内稳定。
2. 3. 6 专属性试验 颠茄片为颠茄浸膏加适量辅
料制成的单方制剂，经试验，辅料无干扰。
2. 3. 7 不同生产企业颠茄片含量测定结果 用本
实验建立的 HPLC方法，测定不同生产企业 13 个不
同批号的颠茄片中东莨菪苷、绿原酸、山柰酚 － 3 －
O －半乳糖 －(6→1)鼠李糖 － 7 － O －葡萄糖苷、东
莨菪内酯和芦丁的含量，结果见表 3。
表 3 颠茄片样品含量测定结果(μg·片 －1)
Tab 3 Content determination of the five active components in belladonna tablets(μg per tablet)
企业(manufactory)
东莨菪苷
(scopolin)
绿原酸
(chlorogenic
acid)
山柰酚 －3 － O －半乳糖 －(6→1)鼠李糖 －
7 － O －葡萄糖苷(kaempferol
－ 3 － O － β － D(6 － O － α － L － rhamnogalactoside)
－7 － O － β － D– glucoside)
东莨菪内酯
(scopoletin)
芦丁
(rutin)
天津力生(Lisheng，Tianjin)1 11. 604 0. 999 9. 449 2. 378 1. 257
2 9. 850 0. 632 7. 610 2. 098 1. 205
3 12. 207 0. 860 8. 846 2. 944 1. 640
天津华津(Huajin，Tianjin) 9. 990 0. 700 10. 856 3. 928 2. 427
河北长天(Changtian，Hebei)1 6. 796 0. 830 7. 305 6. 413 1. 730
2 4. 955 0. 698 6. 783 3. 349 2. 139
3 4. 326 0. 574 5. 955 2. 842 1. 794
烟台鲁银(Luyin，Yantai)1 6. 260 2. 560 18. 867 4. 873 3. 936
2 7. 854 2. 853 18. 341 6. 364 2. 760
3 5. 312 2. 081 16. 618 4. 185 3. 478
西安利君(Lijun，Xi’an)1 11. 443 3. 958 17. 800 6. 963 3. 182
2 5. 199 1. 407 10. 352 4. 677 3. 377
3 6. 182 1. 540 12. 098 5. 206 3. 360
企业(manufactory)A 未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
B 未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
C 未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
未检出
(not detected)
2. 4 特征图谱分析
颠茄片 5 个成分的含量测定和特征图谱采用相
同的前处理条件和色谱系统，在色谱图中，东莨菪内
酯出峰时间居中，含量相对较高，故选择以东莨菪内
—6512— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(12)
酯为参照峰，采用国家药典委员会中药色谱指纹图
谱相似度评价系统(3. 0 版)进行评价，共标定了 16
个共有峰，见图 1。
图 1 颠茄片 HPLC图谱
Fig 1 HPLC chromatograms of belladonna tablets
3. 东莨菪苷(scopolin) 4. 绿原酸(chlorogenic acid) 9. 山柰酚 －
3 － O －半乳糖 －(6→1)鼠李糖 － 7 － O －葡萄糖苷(kaempferol － 3 －
O － β － D(6 － O － α － L － rhamnogalactoside)－ 7 － O － β － D － gluco-
side) 11. 东莨菪内酯(scopoletin) 12. 芦丁(rutin)
2. 4. 1 精密度试验 在含量测定相同色谱条件下，
取同一份供试品溶液，连续进样 6 次，记录色谱图，
并按国家药典会提供的中药色谱指纹图谱相似度评
价系统对其相似度进行评价，考察方法精密度，结果
相似度均大于 0. 990。
2. 4. 2 重复性试验 按照“2. 2. 2”项下方法制备
供试品溶液 6 份，以“2. 1”项下色谱条件进样，记录
色谱图，并对其相似度进行评价，考察方法重复性，
结果相似度均大于 0. 990。
2. 4. 3 稳定性试验 取同一份重复性试验供试品
溶液，在 0、1、2、4、8、12、24 h分别按照“2. 1”项下色
谱条件进样分析，记录色谱图，并对其相似度进行评
价，考察供试液稳定性，结果相似度均大于 0. 990。
2. 4. 5 特征图谱的建立 对所收集的 6 个生产企
业颠茄片样品进行测定，取 10 批颠茄片生成特征图
谱共有模式，见图 1。
2. 4. 6 样品测定 对 13 批颠茄片进行测定，结果
13 批样品色谱峰与共有模式相似度良好，结果见图
2、图 3 及表 4。
图 2 不同企业颠茄片特征图谱(合格)
Fig 2 Fingerprint chromatograms of belladonna tablets produced by different manufactories(qualified)
3 讨论
3. 1 提取方法选择
由于颠茄片为颠茄浸膏加辅料压制成的片剂，
颠茄浸膏易溶于 50%甲醇，为提取完全，故选择以
50%甲醇为溶剂，超声提取。
3. 2 色谱柱的比较
比较月旭公司 XB － C18柱(250 mm × 4. 6 mm，5
μm)、Agilent公司 Zorbax SB － C18柱(250 mm × 4. 6
mm，5 μm)、迪马公司 Diamonsil C18柱(250 mm ×
4. 6 mm，5 μm)以及月旭公司 XB － C18柱不同系列
号柱共 5 支，均能得到良好的分离。
3. 3 相关性试验
经对颠茄药材、颠茄提取物中间体、颠茄流
浸膏、颠茄片的特征图谱进行相关性比较，结果
原料与制剂相关性良好;对 2 家不同药品生产企
业生产的颠茄流浸膏产品进行企业间相关性比
较，结果企业间产品特征图谱也具有较好的相关
性;对我国主要产区山东和湖南产颠茄草进行特
征图谱相关性比较，结果不同产区相关性良好;
采用颠茄草原药材进行颠茄浸膏和颠茄流浸膏
模拟工艺制备，结果与本文的特征图谱也具有良
好的相关性。
—7512—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(12)
图 3 不同企业颠茄片特征图谱(不合格)
Fig 3 Fingerprint chromatograms of belladonna tablets produced by different manufactories(unqualified)
表 4 颠茄片相似度测定结果
Tab 4 The similarity of samples
企业 相似度 企业 相似度
(manufactory) (similarity) (manufactory) (similarity)
天津力生(Lisheng，Tianjin)1 0. 948 烟台鲁银(Luyin，Yantai)2 0. 963
天津力生(Lisheng，Tianjin)2 0. 937 烟台鲁银(Luyin，Yantai)3 0. 966
天津力生(Lisheng，Tianjin)3 0. 947 西安利君(Lijun，Xi’an)1 0. 961
天津华津(Huajin，Tianjin) 0. 988 西安利君(Lijun，Xi’an)2 0. 959
河北长天(Changtian，Hebei)1 0. 938 西安利君(Lijun，Xi’an)3 0. 959
河北长天(Changtian，Hebei)2 0. 982 企业(manufactory)A 无特征峰(no characteristic peaks)
河北长天(Changtian，Hebei)3 0. 984 企业(manufactory)B 无特征峰(no characteristic peaks)
烟台鲁银(Luyin，Yantai)1 0. 965 企业(manufactory)C 无特征峰(no characteristic peaks)
3. 4 样品含量测定结果分析
16 批颠茄片含量测定结果显示，其中 13 批样
品各生产企业生产的颠茄片之间虽然各成分比例相
似度较高，但整体含量仍有一定差异;另 3 家企业的
3 批颠茄片样品未检出指标成分。
3. 5 小结
样品相似度检测结果显示，5 家颠茄片生产企
业提供的 13 批颠茄片成分具良好的相似性，成分一
致性较好，另 3 家企业的 3 批样品特征图谱未检测
到特征峰。实验结果提示本特征图谱可以有效鉴别
制剂中的颠茄提取物，方法操作简便，专属性强，可
为颠茄片有效性和安全性监管提供依据。
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(本文于 2014 年 3 月 31 日收到)
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