全 文 ： 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (2): 243−249 · 243 ·
过表达内源 PMT 和 H6H基因对颠茄发根托品烷类生物碱合成的影响
龙世平 1, 卢 衍 1, 王亚雄 1, 杨春贤 1, 兰小中 2, 廖志华 1*
(1. 西南大学生命科学学院, 重庆市甘薯工程技术研究中心, 重庆 400715;
2. 西藏农牧学院生物技术教研室, 西藏 林芝 860000)
摘要: 颠茄是我国药典规定的托品烷类生物碱包括东莨菪碱和莨菪碱最主要的商业栽培的药源植物。本研究
采用基于发根的基因表达系统, 农杆菌介导遗传转化颠茄, 潮霉素筛选获得转颠茄自身 PMT 和 H6H 基因发根;
基因组 PCR鉴定转基因发根; 液体摇床培养后, HPLC测量莨菪碱和东莨菪碱含量; qPCR检测颠茄 PMT和 H6H
基因表达水平。基因组 PCR检测获得 5个双基因共转化颠茄发根系, 其中 2个发根系 (PH2和 PH14) 的总生物
碱含量得到显著提高, 最高的 PH2总生物碱含量为非转基因发根的 2.7倍; 另外 3个转基因发根系总生物碱含量
与对照相比没有显著性差异。4个转基因发根系 (PH2、PH32、PH14和 PH20) 东莨菪含量都有提高, 其中 PH2
东莨菪碱含量比对照提高了 8.2倍。基因表达量与生物碱含量结果基本一致, 说明颠茄发根中 PMT和 H6H两者
同时维持高水平表达可以极大程度的促进东莨菪碱积累。
关键词: 东莨菪碱; 颠茄; N-甲基−腐胺−转移酶; 莨菪碱 6β-羟化酶
中图分类号: R931 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2013) 02-0243-07
Enhancement of tropane alkaloids production in transgenic hair roots of
Atropa belladonna by overexpressing endogenous genes AbPMT and AbH6H
LONG Shi-ping1, LU Yan1, WANG Ya-xiong1, YANG Chun-xian1, LAN Xiao-zhong2, LIAO Zhi-hua1*
(1. Chongqing Engineering and Technology Center for Sweetpotato, School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing
400715, China; 2. Department of Biotechnology, Tibet Agricultural and Animal Husbandry College, Nyingchi 860000, China)
Abstract: Atropa belladonna L. is the officially medicinal plant species and the main commercial source of
scopolamine and hyoscyamine in China. In this study, we reported the simultaneous overexpression of two
functional genes involved in biosynthesis of scopolamine, which respectively encoded the upstream key enzyme
putrescine N-methyltransferase (PMT; EC 2.1.1.53) and the downstream key enzyme hyoscyamine 6β-hydroxylase
(H6H; EC 1.14.11.11) in transgenic hair root cultures of Atropa belladonna L. HPLC results suggested that
four transgenic hair root lines produced higher content of scopolamine at different levels compared with non-
transgenic hair root cultures. And scopolamine content increased to 8.2 fold in transgenic line PH2 compared
with that of control line; and the other four transgenic lines showed an increase of scopolamine compared with
the control. Two of the transgenic hair root lines produced higher levels of tropane alkaloids, and the content
increased to 2.7 fold in transgenic line PH2 compared with the control. The gene expression profile indicated
that both PMT and H6H expressed at a different levels in different transgenic hair root lines, which would
be helpful for biosynthesis of scopolamine. Our studies suggested that overexpression of A. belladonna
endogenous genes PMT and H6H could enhance tropane alkaloid biosynthesis.
Key words: scopolamine; Atropa belladonna; putrescine N-methyltransferase; hyoscyamine 6β-hydroxylase
收稿日期: 2012-10-16; 修回日期: 2012-11-12.
基金项目: 国家高技术研究发展计划 (863 计划) 资助项目 (2011AA100605).
*通讯作者 Tel / Fax: 86-23-68367146, E-mail: zhliao@swu.edu.cn
DOI:10.16438/j.0513-4870.2013.02.016
· 244 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (2): 243−249
托品烷类生物碱 (tropane alkaloids, TAs) 包括
莨菪碱和东莨菪碱 (图 1), 是来自于茄科植物如颠茄
(Atropa belladonna L.)、莨菪 (Hyoscyamus niger) 和
曼陀罗 (Datura stramonium) 等的生物碱类天然产
物, 具有多方面的药用价值。颠茄是东莨菪碱和莨菪
碱最主要的商业栽培药源, 也是我国药典规定的托
品烷类生物碱的药源植物[1]。由于东莨菪碱在阻断副
交感神经和抑制中枢神经系统上比莨菪碱具有更强
的药理作用和更小的毒副效果, 因此市场需求量很
大, 从而使得其价格也更昂贵[2]。在野生颠茄中东莨
菪含量极低, 仅为干重的 0.01%～0.08%。因此, 利用
代谢工程技术培育高产东莨菪碱的颠茄是东莨菪碱
相关产业的共同追求目标。
Figure 1 Structures of scopolamine and hyoscyamine
颠茄中 TAs生物合成途径重要酶促反应步骤已经
比较清楚, 其合成起始于鸟氨酸和精氨酸的脱羧反应。
N-甲基−腐胺−转移酶 (putrescine N-methyltransferase,
PMT) 是东莨菪碱生物合成途径中上游的第一个分
支点酶, 它将腐胺从初生代谢 (多胺代谢) 转向次生
代谢TAs合成, 因此是TAs合成途径上的第一个限速
酶[3]; 莨菪碱 6β-羟化酶 (hyoscyamine 6β-hydroxylase,
H6H) 催化莨菪碱的羟基化生成山莨菪碱 (anisodamine)
及山莨菪碱的进一步环化两步反应, 最终生成东莨
菪碱, 这是东莨菪碱生物合成途径上的最后一个限
速步骤[4]。在颠茄中单独过表达烟草 PMT 基因不足
以提高 TAs 含量[5], 过表达莨菪 H6H 基因可以将莨
菪碱很大程度上转化为东莨菪碱[6]; 研究表明在莨菪
发根中同时过表达烟草 PMT和莨菪H6H基因可以推
动代谢流更多的向东莨菪碱生物合成方向流动, 极
大地提高东莨菪碱产量[7]。目前, 颠茄中的 PMT 和
H6H基因已经被克隆并得到详细的生化分析[8], 为利
用颠茄自身基因开展 TAs 代谢工程研究提供了必要
的候选基因。
本文采用双基因共转化策略, 在颠茄发根中同
时过表达颠茄 TAs 生物合成途径上游和下游的自身
限速酶基因 PMT和 H6H, 以期打破 TAs合成的关键
瓶颈步骤, 探讨自身 PMT和 H6H基因过表达在莨菪
碱和东莨菪碱合成中的作用, 并为利用转基因发根
生产东莨菪碱提供一种新方法。
材料与方法
颠茄 颠茄种子及无菌苗由本实验室保存。
载体及工程菌 植物高效表达载体 p1304+-
PMT-H6H由成瑜等[9]构建, 转化“disarmed”的根癌
农杆菌 C58C1 (携带有发根质粒 pRiA4) 获得工程菌
C58C1-p1304+-PMT-H6H, −80 ℃保存用于颠茄发根的
遗传转化。构建好的载体 p1304+-PMT-H6H的 T-DNA
区包含颠茄 PMT和H6H两个基因的表达框和潮霉素
抗性基因 Hygrr的表达框, 均由 CaMV35S 启动子驱
动 (图 2)。
颠茄发根的遗传转化及分子检测 参照 Yang
等[10]的方法用工程菌 C58C1-p1304+-PMT-H6H 转化
颠茄叶盘获得转化发根。除菌完全的发根 (每个月继
代一次, 连续继代培养 6 次) 用 SDS 法抽提基因组
DNA, 电泳检测合格后做模板, PCR检测Hygrr基因、
致发根基因 rolC和目的基因颠茄 PMT与 H6H, 为避
免扩增出颠茄内源的 PMT、H6H基因造成假阳性, 检
测这两个基因所用的上游引物在CaMV35S启动子区
设计, 引物序列见表 1。PCR检测时均采用颠茄无菌
苗 DNA作为阴性对照模板, 工程菌菌液煮沸 10 min
后 4 000 r·min−1离心 2 min, 取上清液作为阳性对照
模板。加样体系: 10×PCR Buffer 2.5 μL, 25 mmol·L−1
MgCl2 2 μL, 10 mmol·L−1 dNTP 0.5 μL, 上游引物 (10
µmol·L−1) 0.5 μL, 下游引物 (10 µmol·L−1) 0.5 μL,
DNA模板 1 μL, Taq DNA聚合酶 (5 U·μL−1) 0.5 μL,
Figure 2 Structure of T-DNA region of p1304+-PMT-H6H vector. LB: Left border; RB: Right border; 35SP: CaMV35S promoter;
35ST: CaMV35S terminator; NOS T: Nos terminator; Hygrr: Hygromycin-resistance gene
龙世平等: 过表达内源 PMT和 H6H基因对颠茄发根托品烷类生物碱合成的影响 · 245 ·
Table 1 The primers used for PCR detection of A. belladonna
hair roots
Primer name Primer sequence (5−3)
frolC TAACATGGCTGAAGACGA CC
rrolC AAACTTGCACTCGCCATGCC
fHygr CGATTTGTGTACGCCCGACAG TC
rHygr CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG
fPMT AGCGTTGAAGATGCCTCTGCCGA
rPMT CCACTGCCTCGAAGAATGACC
fH6H CCGGAATTCGGATCCCAACGTATAGATTCTTC
rH6H CGGGAATTCGGATCCCAAACCATCACTGCAAT
ddH2O 17.5 μL, 总体积 25 μL。反应条件: 95 ℃预
变性 5 min, 33 个循环 (94 ℃变性 30 s, 退火 Hygrr
58 ℃, rolC 55 ℃, PMT 58 ℃, H6H 55 ℃, 各退火
30 s, 72 ℃延伸 1 min), 最后 72 ℃后延伸 8 min。
发根中生物碱的提取与 HPLC 检测及质谱分析
剪取 3 根长 3～4 cm 且生长旺盛的发根根尖接种于
150 mL MS液体培养基中, 100 r·min−1 25 ℃摇床暗培
养 35天后取适量材料于 −80 ℃保存, 用于提取 DNA
和 RNA 检测相关基因, 剩余发根于 40 ℃干燥 24 h
至恒重, 研磨成粉, 按 Zhang 等[7]的方法提取托品烷
类生物碱, 并检测莨菪碱和东莨菪碱的含量。标准品
购自 Sigma公司。每个发根克隆设 3个生物学重复。
色谱条件: 岛津 LC-60A 高效液相色谱仪 (泵:
LC-6AD、柱温箱: CTO-10AS vp、控制器: SPD-20A),
色谱柱为 Phenomenex Gemini C18 110A液相色谱柱
(250 mm × 4.6 mm, 5 μm), 流动相为乙腈−乙酸铵
(1% 甲酸, 氨水调至 pH 4) 10∶90, 流速 1 mL·min−1,
柱温箱 30 ℃, 检测波长 226 nm, 进样量 20 μL。
质谱条件: 采用电喷雾离子源 (ESI), 鞘气流速
为 35 单位, 辅助气流速 5 单位, 喷雾电压为 5 kV,
毛细管温度为 320 ℃, 毛细管电压为 30 V, RF透镜
补偿电压 −4.7 V, RF检测器温度 40 ℃, RF发生器温
度 23 ℃。
总 RNA 提取及 cDNA 合成 发根总 RNA 提取
使用 TIANGEN公司的 RNAsimple Total RNA Kit试
剂盒, 紫外分光光度计测定其在 260 nm和 280 nm处
的吸收度, 2.1 > A260/A280 > 1.8, 表明RNA无蛋白和DNA
污染。使用 TaKaRa公司的 PrimeScript® RT reagent Kit
Perfect Real Time试剂盒将各发根的 RNA进行反转
录, 得到 cDNA 第一链作为荧光定量 PCR 检测的模
板。加样体系: 5×PrimeScript® Buffer (for Real Time)
2 μL, PrimeScript® RT Enzyme MixI 0.5 μL, Oligo
dT Primer (50 µmol·L−1) 0.5 μL, Random 6 mers
(100 µmol·L−1) 0.5 μL, Total RNA 1 μL, 补足 RNase
Free H2O至 10 μL, 反转录反应条件: 37 ℃ 15 min,
85 ℃ 5 s。
引物设计与 qPCR 根据 NCBI上已发表的颠茄
PMT 和 H6H 序列, 使用 Beacon designer 软件设计
qPCR引物, 见表 2。使用 IQTM5 Multicolor Real-Time
PCR仪, 参照 SYBR® Premix ExTaqTM II (Perfect Real
Time) 试剂盒说明书进行 qPCR反应。反应体系: 2×
SYBR Premix ExTaqTM 10 μL, 上游引物 (10 µmol·L−1)
0.8 μL, 下游引物 (10 µmol·L−1) 0.8 μL, cDNA模板
0.5 μL, RNase-Free H2O 7.9 μL, 总体积 20 μL。反应
程序: 95 ℃ 30 s, 接着进行 40个扩增循环 (95 ℃ 5 s,
退火 30 s, 72 ℃ 20 s, 延伸结束后采集荧光), 退火温
度 PMT 56 ℃, H6H 56 ℃, PGK 59.5 ℃; 融解曲线分
析: 60 ℃到 95 ℃逐渐升温, 每间隔 0.5 ℃保温 10 s,
采集一次荧光。以 PGK基因作为内参, 根据 2− CT△△
方法计算各基因的相对表达量。
Table 2 The real time qPCR primers
Primer name Primer sequence (5−3)
fqH6H GCCCAGACCCAAGTTCAAC
rqH6H CAGCAATCCAGGTAGCATCC
fqPMT GAACACCTCAACGGCTACC
rqPMT CATTGTCATGGCTGATTGTCC
fqPGK CAGATACCGTCCTAGTCTCAAC
rqPGK CAGCCTTGCGACCATACTC
结果与讨论
1 发根诱导及分子检测
p1304+质粒上 T-DNA区携带有潮霉素抗性基因,
所以经工程菌 C58C1-p1304+-PMT-H6H 转化后的发
根具有潮霉素抗性[9]。用叶盘转化法转化颠茄叶片,
在含 10 mg·L−1的潮霉素抗性平板上进行发根的筛选
诱导, 10天左右从叶片伤口处开始长出发根 (图 3A),
待其生长到 3～5 cm 长时剪下, 在 MS 加头孢菌素
的培养基中继带多次进行除菌培养, 再转入无抗生
素的MS固体培养基中, 发根很快能在没有植物激素
培养基上快速生长, 而且多分支, 失去向地性, 根毛
十分发达 (图 3B), 呈现典型的发根形态[10]; 通过检
测的发根, 摇床培养 35天后生物量达到最大, 可用于
后续分析 (图 3C)。转化根呈现出的这些形态是由于
pRiA4携带的 rol基因家族导致的, rol基因家族含有
能够合成生长素的基因, 使得转化根能进行激素自
养并维持在发根状态进行无限生长[10]。基因组 PCR结
果显示在具有潮霉素抗性的发根中能够同时检测到
800 bp的 Hygrr基因片段 (图 4)、626 bp的 rolC基因
· 246 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (2): 243−249
片段 (图 4)、916 bp的 PMT (携带有部分 CaMV35S
启动子序列) 基因片段和 699 bp的H6H (携带有部分
CaMV35S 启动子序列) 基因片段 (图 5); 在阳性对
照中上述 4 个基因片段也能够同时检测到; 但是在
阴性对照中上述 4个基因片段未能检测到 (图 4, 5)。
基因组 PCR 检测最终筛选出 5 个双基因共转化发根
克隆, 依次编号为 PH2、PH14、PH16、PH20和 PH32
(图 4, 5)。
2 托品烷类生物碱含量测定
采用 HPLC 检测转基因颠茄发根和对照发根的
东莨菪碱和莨菪碱含量。东莨菪碱和莨菪碱标准品的
出峰保留时间分别为 12.15 min和 14.61 min (图 6A)。
样品中东莨菪碱和莨菪碱保留时间分别为 12.31 min
和 14.39 min (图 6B)。样品与标准品的保留时间基本
一致。
转基因颠茄发根 LC-MS 分析结果中, 强度最强
的准分子离子峰分别为 m/z 306 (图 7A) 和 m/z 304
(图 7B)。根据与莨菪碱和东莨菪碱标准品保留时间对
比可知 m/z 306 = [M1 + NH3]+, m/z 304 = [M2 + H]+, 其
中 M1即为莨菪碱, 其分子量为 289; M2即为东莨菪
碱, 其分子量为 303。表明本研究中转基因颠茄发根
确实含有莨菪碱与东莨菪碱。
在 5个共转化颠茄自身 PMT和H6H双基因发根
系中, 有 2个发根系 (PH2和 PH14) 的总 TAs含量得
到了显著提高, 其中 PH2的总 TAs含量 (5.22 mg·g−1
DW) 为非转基因发根对照 (1.93 mg·g−1 DW) 的 2.7
倍; 另外 3 个转基因发根系 (PH32、PH14 和 PH20)
的总 TAs 含量与非转基因发根对照 (NC) 相比没有
显著性差异 (图 8)。这可能是由于 TAs 生物合成途
径中上下游两个限速步骤的限制作用没有同时打破,
从而使部分转基因发根中总 TAs 没有显著提高。转
基因发根系 PH2、PH32、PH14 和 PH20 中东莨菪
Figure 3 Induction and culture of A. belladonna hairy roots. A: The hairy root induced from the leaf disks on media with hygromycin;
B: The cultivation of hairy roots on the MS; C: Hairy root cultures in liquid MS medium
Figure 4 PCR analysis Hygrr and rolC genes of A. belladonna hairy roots induced by p1304+-PMT-H6H. M: DL2000 marker;
P: Positive control; N: Negative control; PH2−PH32: Different transgenic monoclonal hairy root lines
Figure 5 PCR analysis PMT and H6H genes of A. belladonna hairy roots induced by p1304+-PMT-H6H. M: DL2000 marker;
P: Positive control; N: Negative control; PH2−PH32: Different transgenic monoclonal hairy root lines
龙世平等: 过表达内源 PMT和 H6H基因对颠茄发根托品烷类生物碱合成的影响 · 247 ·
Figure 6 HPLC analysis of scopolamine and hyoscyamine. A:
Authentic sample of scopolamine and hyoscyamine (retention
time: 12.15 min and 14.61 min); B: Scopolamine and hyoscyamine
analysis in transgenic hairy roots (retention time: 12.31 min and
14.39 min)
Figure 7 LC-MS analysis of hyoscyamine (A) and scopolamine
(B) in transgenic A. belladonna hairy roots
碱含量与对照比有不同程度显著的提高。在东莨菪
碱含量提高最多的发根系 PH2 中, 东莨菪碱含量
(2.16 mg·g−1 DW) 比非转基因发根 (0.26 mg·g−1 DW)
提高 8.2倍, 莨菪碱含量 (3.06 mg·g−1 DW) 比非转基
因发根 (1.66 mg·g−1 DW) 提高 1.8倍 (图 8)。这是由
于上游颠茄 PMT 和下游 H6H 基因同时过表达 能够
打破 TAs 合成途径中上下游两个限速步骤, 从而促进
总 TAs 尤其是东莨菪碱的积累。虽然在 PH32 和
Figure 8 Contents of scopolamine and hyoscyamine in A. bel-
ladonna hairy roots. NC: Non-transgenic hairy root; PH series:
Transgenic lines
PH20这 2个转基因发根系中总 TAs没有显著性提高,
但是东莨菪碱含量得到显著提高 (图 8), 表明转基因
(尤其是颠茄 H6H基因) 仍然有效的改变了总 TAs组
成比例, 使得低价值的莨菪碱更多的向高价值的东
莨菪碱转化。
3 发根中目的基因相对表达量
根据预实验确定的最佳退火温度和体系制作荧
光定量引物的标准曲线并计算扩增效率, 同时进行
融解曲线分析。实验得到 PGK、PMT和 H6H基因的
扩增效率分别为 96.3%、93.0% 和 96.6% (有效统计范
围 90%～105%), 高的扩增效率能准确地将Ct值转化
为用于相对定量的原始数据; 所得标准曲线的相关
性系数 R2均在 0.99以上, 且融解曲线都只有单一峰,
无引物二聚体和非特异扩增, 表明设计的 PGK 内参
基因和目的基因荧光定量引物均符合要求。
以 PGK 基因作为内参, 采用实时荧光定量 PCR
检测目的基因颠茄 PMT和H6H在各发根系中的相对
表达情况, 其结果与生物碱含量检测的结果基本一
致。2个总 TAs含量提高的转基因发根单克隆 (PH2
和 PH14) 的双基因共同表达水平都比对照高 (图 9,
10)。在总 TAs 和东莨菪碱含量都为最高的 PH2 中,
PMT 表达量是所有转基因发根中最高的, 为对照的
5.63 倍; H6H 基因表达量也达到对照的 5.39 倍 (图
10), 仅次于表达量最高的 PH32 (图 9)。PH32中 H6H
基因表达量虽然高于其他发根系, 但 PMT 基因表达
量与对照相比没有显著性差异, 从而导致 PH32中总
TAs与对照相比没有显著增加, 而东莨菪碱与对照相
比却显著提高。这是由于在 PH32 中 PMT 基因表达
量受到限制而使下游得不到充足的底物, 故总 TAs 没
有显著性提高; 但下游的 H6H 充分表达促使莨菪碱
大量转化为东莨菪碱, 所以东莨菪碱含量显著提高。
PH14 和 PH16 的 PMT 基因表达量高于对照,
· 248 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (2): 243−249
Figure 9 Relative expression analysis of PMT gene in A.
belladonna hairy roots. NC: Non-transgenic hairy root; PH
series: Transgenic lines
Figure 10 Relative expression analysis of H6H gene in A.
belladonna hairy roots. NC: Non-transgenic hairy root; PH
series: Transgenic lines
PH20 的 PMT 基因表达量与对照比较没有显著性差
异; PH14和 PH20的H6H基因表达量高于对照, PH16
的 H6H 基因表达量与对照比较没有显著性差异。由
于 PH14、PH16和 PH20中 PMT和 H6H基因的表达
量没有同时提高, 因此 3个转基因发根系的总 TAs与
对照相比没有显著性差异。
讨论
东莨菪碱和莨菪碱是临床上常用的抗胆碱药物,
广泛用于镇痛、全麻的术前给药、抗晕动药、治疗帕
金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、解有机磷中毒等[11]。
最近研究表明, 东莨菪碱在小鼠模型上还具有抗抑
郁等重要活性[12]。由于代谢途径比较清晰, 途径上的
关键基因也在很多物种中得到克隆, 开展以提高托
品烷类生物碱尤其是东莨菪碱为目标的代谢工程成
为在植物中大规模生产 TAs非常有效的途径。
托品烷类生物碱生物合成主要存在于茄科不
同属植物中, 其合成途径涉及的酶促反应步骤和基
因完全相同。PMT 是 TAs 生物合成途径上的第一个
限速酶, 但由于次生代谢产物合成和调控的复杂性,
超量表达 PMT 基因在不同植物中对托品烷类生物
碱合成途径的调控作用不同 : 在颠茄和澳洲毒茄
(Duboisia hybrid) 中超量表达烟草 PMT 基因, 莨菪
碱和东莨菪碱的积累都没有增加[5]; 而在白花曼陀罗
(Datura metel) 和钝莨菪 (Hyoscyamus muticus) 中超
量表达烟草 PMT 基因, 莨菪碱和东莨菪碱的积累都
得到了显著的提高[13]。与 PMT 作用不同, TAs 合成
途径上最后一个限速酶基因 H6H 的表达量与东莨
菪碱生物合成量表现正相关性[14], 在产 TAs 的茄科
植物中超量表达 H6H 基因无一例外的都促进了东莨
菪碱的积累。在转莨菪 H6H基因的毛曼陀罗 (Datura
innoxia) 和澳洲毒茄中, 东莨菪碱含量比对照提高了
3倍多[15, 16], 在印度颠茄 (A. baetica) 发根中超量表
达莨菪 H6H, 最优的发根克隆中东莨菪碱是对照发
根的 9倍, 达到 5.6 mg·g−1 (dry weight), 其含量提高
倍数与 H6H 基因表达量之间成正比[17], 而在转莨菪
H6H 基因的颠茄植株的叶和茎中, 莨菪碱几乎全部
都转化成了东莨菪碱[6]。
由于很多代谢途径都是由多个限速酶控制, 一
个酶的过量表达常常会使后续反应受到限速, 所以
单个酶基因过量表达的结果可能会使代谢产物含量
得不到明显提高, 如上面提到的在颠茄中单转 PMT
基因, 因此代谢工程策略还应该关注生物合成中多
个基因的共同过表达和调控多个途径酶基因表达的
调节基因, 或者两者同时研究。2004年, 唐克轩课题
组[7]首次采用双基因过表达策略改造 TAs 生物合成
途径, 在莨菪发根中同时过表达上游的 PMT 基因和
下游的 H6H 基因, 东莨菪碱含量最高的克隆是单转
H6H基因发根中含量的 2倍, 其含量高达 411 mg·L−1,
直到现在仍然是东莨菪碱生物合成途径遗传改造后
东莨菪碱含量的最高记录, 证明 PMT基因和 H6H基
因在促进东莨菪碱积累上存在协同作用。
本研究通过在颠茄发根中同时过表达颠茄本身
的 PMT基因和 H6H基因, 东莨菪碱含量最高的提高
了 8.2 倍, 莨菪碱也提高了 1.8 倍。这在实际生产中
具有重要意义, 将此转基因发根系进行大规模培养,
再从中提取高价值东莨菪碱, 可为东莨菪碱生产提
供一种新型方法。但是值得注意的是, 转基因发根中
莨菪碱含量占有较大的比例, 并未完全转化为东莨
菪碱, 这是由于颠茄 H6H 蛋白的活性可能比莨菪
H6H 蛋白的活性弱[18], 不能将莨菪碱全部转化为东
莨菪碱。如果采用酶活力更高的 H6H 基因, 本研究
中获得的转基因发根中东莨菪碱含量还有进一步提
高的可能。总之, 本研究结果表明在颠茄中过表达自
身的两个限速酶基因可以对代谢产物积累起到重要
的作用, 颠茄自身 PMT 基因的过表达为下游的东莨
龙世平等: 过表达内源 PMT和 H6H基因对颠茄发根托品烷类生物碱合成的影响 · 249 ·
菪碱合成提供更为充足的前体物质, 同时 H6H 基因
的过表达能够高效转化来自于上游途径提供的代谢
流, 最大程度的合成东莨菪碱, 为颠茄托品烷类生物
碱代谢工程的发展提供依据。
References
[1] Chinese pharmacopoeia commission. Chinese Pharmacopoeia:
2010 edition (中国药典: 2010版) [M]. Beijing: China Medical
Science and Technology Press, 2010: 262.
[2] Wang X, Chen M, Yang C, et al. Enhancing the scopolamine
production in transgenic plants of Atropa belladonna by
overexpressing pmt and h6h genes [J]. Physiol Plant, 2011,
143: 309−315.
[3] Hibi N, Fujita T, Hatano M, et al. Putrescine N-methyltransferase
in cultured roots of Hyoscyamus albus [J]. Plant Physiol,
1992, 100: 826−835.
[4] Hashimoto T, Matsuda J, Yamada Y. Two-step epoxidation of
hyoscyamine to scopolamine is catalyzed by bifunctional
hyoscyamine 6 beta-hydroxylase [J]. FEBS Lett, 1993, 329:
35−39.
[5] Rothe G, Hachiya A, Yamada Y, et al. Alkaloids in plants and
root cultures of Atropa belladonna overexpressing putrescine
N-methyltransferase [J]. J Exp Bot, 2003, 54: 2065−2070.
[6] Yun DJ, Hashimoto T, Yamada Y. Metabolic engineering
of medicinal plants: transgenic Atropa belladonna with an
improved alkaloid composition [J]. Proc Natl Acad Sci USA,
1992, 89: 11799−11803.
[7] Zhang L, Ding R, Chai Y, et al. Engineering tropane
biosynthetic pathway in Hyoscyamus niger hairy root cultures
[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 6786−6791.
[8] Suzuki K, Yamada Y, Hashimoto T. Expression of Atropa
belladonna putrescine-methyltransferase gene in root pericycle
[J]. Plant Cell Physiol, 1999, 40: 289−297.
[9] Cheng Y, Yang C, Wang G, et al. Construction of plant
expression vectors of PMT, TR-I and H6H [J]. J Anhui Agri
Sci (安徽农业科学), 2010, 38: 7211−7213.
[10] Yang C, Chen M, Zeng L, et al. Improvement of tropane
alkaloids production in hairy root cultures of Atropa belladonna
by overexpressing pmt and h6h genes [J]. Plant Omics J,
2011, 4: 29−33.
[11] Liu Y, Zhang J, Yang J. Comparative study on the
pharmacological effects of some scopolia alkaloid derivatives
[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 1987, 22: 725−729.
[12] Ji C, Zhang J. Effect of scopolamine on depression in mice
[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2011, 46: 400−405.
[13] Moyano E, Jouhikainen K, Tammela P, et al. Effect of
pmt gene overexpression on tropane alkaloid production in
transformed root cultures of Datura metel and Hyoscyamus
muticus [J]. J Exp Bot, 2003, 54: 203−211.
[14] Jouhikainen K, Lindgren L, Jokelainen T, et al. Enhancement
of scopolamine production in Hyoscyamus muticus L. hairy
root cultures by genetic engineering [J]. Planta, 1999, 208:
545−551.
[15] Dechaux C, Boitel-Conti M. A strategy for overaccumulation
of scopolamine in Datura innoxia hairy root culture [J]. Acta
Biol Cracov Bot, 2005, 47: 101−107.
[16] Palazón J, Moyano E, Cusido RM, et al. Alkaloid production
in Duboisia hybrid hairy roots and plants overexpressing the
h6h gene [J]. Plant Sci, 2003, 165: 1289−1295.
[17] Zárate R, Jaber-Vazdekis N, Medina B, et al. Tailoring
tropane alkaloid accumulation in transgenic hairy roots of Atropa
baetica by over-expressing the gene encoding hyoscyamine
6β-hydroxylase [J]. Biotechnol Lett, 2006, 28: 1271−1277.
[18] Li J, van Belkum MJ, Vederas JC. Functional characterization
of recombinant hyoscyamine-6β-hydroxylase from Atropa
belladonna [J]. Bioorg Med Chem, 2012, 20: 4356−4363.