全 文 ：第 35 卷 第 10 期
2016 年 10 月
分析测试学报
FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)
Vol. 35 No. 10
1338 ～ 1342
收稿日期:2016 － 03 － 23;修回日期:2016 － 04 － 13
基金项目:信阳职业技术学院院级科研项目(14QN07)
* 通讯作者:樊轻亚，硕士，讲师，研究方向:药物提取分离及分析，Tel:0376 － 6281969，E － mail:
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fqy2006hn@ 163. com
实验技术
doi:10. 3969 / j. issn. 1004 －4957. 2016. 10. 021
树脂法分离纯化倒提壶生物碱的研究
樊轻亚1* ，张宏辉1，王万好2
(1． 信阳职业技术学院 药学院，河南 信阳 464000;2． 河南同源制药有限公司，河南 信阳 464000)
摘 要:采用阳离子交换树脂和大孔吸附树脂联用的方法，将倒提壶生物碱提取液依次经过阳离子交换树脂
和两次大孔吸附树脂，对其中的天芥菜碱和毛果天芥菜碱进行分离纯化。结果表明，倒提壶生物碱溶液采用
阳离子交换树脂经过水洗和 NaCl洗脱与大孔吸附树脂两次经乙醚和 50%乙醇洗脱后，毛果天芥菜碱与天芥
菜碱的纯度分别从 0. 73%和 2. 2%提高至 81. 6%和 79. 2%，提取量分别由 4. 6 mg /g和 10. 7 mg /g提高至 50. 6
mg /g和 92. 7 mg /g。该文所建立的分离纯化方法具有成本低、污染小、周期短、操作简便和分离纯化效率高
等特点，适合工业化生产。
关键词:阳离子交换树脂;大孔吸附树脂;倒提壶生物碱;天芥菜碱;毛果天芥菜碱;分离;纯化
中图分类号:O657. 72;TQ460. 72 文献标识码:A 文章编号:1004 － 4957(2016)10 － 1338 － 05
Ｒesearch on Separation and Purification of Alkaloids in
Cynoglossum amabile Stapf et Drumm with Ｒesin
FAN Qing-ya1* ，ZHANG Hong-hui1，WANG Wan-hao2
(1． College of Pharmacy，Vocational and Technical College School of Xinyang，Xinyang 464000，China;
2． Henan Pharmaceutical Tong-yuan Ltd．，Xinyang 464000，China)
Abstract:A novel method was established to separate and purify alkaloids from Cynoglossum amabile
Stapf et Drumm with cation exchange resin(CEＲ)coupled with macroporous adsorption resin(MAＲ)
based on dynamic tests． The result indicated that the alkaloids extracted were eluted with water and
NaCl through CEＲ and twice with ether and 50% ethanol through MAＲ，then the purities of heliotrine
and lasiocarpine were up to 81. 6% and 79. 2% from 0. 73% and 2. 2%，respectively． Extraction
yields were up to 50. 6 mg /g and 92. 7 mg /g from 4. 6 mg /g and 10. 7 mg /g，respectively． The
method has the advantages of low cost，low pollution，short cycle，high efficiency and simple opera-
tion，and is suitable for popularization in industry production．
Key words:cation exchange resin;macroporous adsorption resin;Cynoglossum amabile Stapf et
Drumm alkaloid;heliotrine;lasiocarpine;separation;purification
倒提壶(Cynoglossum amabile Stapf et Drumm)是紫草科琉璃草属植物，分布于不丹及中国的西藏、
云南、贵州、四川等地。倒提壶全草入药，其味苦、性凉，有清热利湿，散瘀止血、止咳、镇痛之功
效。倒提壶可内服或外用，常用以治疗疟疾、肝炎、痢疾、咳嗽、风湿性关节炎、尿道炎等症［1 － 3］。
生物碱为本属植物的主要成分，具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗菌、抑制微生物等。刘清华等［4］
对天芥菜碱和毛果天芥菜碱的药理活性作了大量研究。
20 世纪 70 年代末，树脂吸附逐渐用于天然药物有效成分的提取分离，由于其物理化学稳定性高，
吸附选择性独特，再生简便，使用周期长，宜于构成闭路循环，节省费用等诸多优点，在中药有效成
分的提取分离方面迅速得到广泛运用，并成功地用于生物碱、黄酮、皂苷等多类成分的提取
纯化［5 － 17］。
本文采用大孔吸附树脂分离纯化倒提壶提取液中的生物碱成分，通过比较不同类型树脂的性质，
第 10 期 樊轻亚等:树脂法分离纯化倒提壶生物碱的研究 1339
图 1 天芥菜碱(A)和毛果天芥菜碱(B)的化学结构
Fig. 1 Chemical structures of heliotrine(A)and
lasiocarpine(B)
研究了 pH 值、上样液浓度、洗脱剂类型对分离
纯化的影响，并采用高效液相色谱(HPLC)法对
天芥菜碱和毛果天芥菜碱(结构式见图 1)含量进
行分析，研究了树脂的吸附和解吸附性能，获得
了适合天芥菜碱和毛果天芥菜碱的分离纯化
工艺。
1 实验部分
1. 1 仪器、试剂与材料
DFY －200 摇摆式高速中药粉碎机(温岭市大
德中药机械有限公司);B －260 型恒温水浴(上海雅荣生化设备仪器有限公司);SHZD(A)型循环水真
空泵(天津华鑫仪器厂);AY － 120 电子天平(日本 Shimaduz 公司);CＲ3i 紧凑型离心机(德国 Thermo
Scientific公司);Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国 Agilent公司)。
天芥菜碱、毛果天芥菜碱对照品(纯度 98. 5%，成都普瑞法科技开发有限公司);盐酸、氢氧化
钠、无水乙醇、乙酸、甲醇、氯仿、乙醚、氨水(分析纯，郑州德众化学试剂厂);甲醇、乙腈(色谱
纯，美国 Merck 公司);倒提壶(安徽亳州市药材有限公司)经信阳职业技术学院中药鉴定学教研室吴
长忠老师鉴定为倒提壶(Cynoglossum amabile Stapf et Drumm)全草;001 × 732 阳离子交换树脂(蚌埠市
辽源新材料有限公司);BS － 65，BS － 30，CAD － 45，D101 大孔吸附树脂(蚌埠市辽源新材料有限公
司);HPD －400 树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司);实验用水为去离子水。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 树脂的预处理 阳离子交换树脂于水中浸泡 24 h 后取出，置于 2 mol /L HCl 溶液中浸泡 4 h，
然后用水洗涤至中性，用 2 mol /L NaOH 浸泡 4 h，再用水洗涤至中性，浸泡于 2 mol /L HCl 溶液中备
用，临用前用水洗涤至中性即可。
大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡 24 h使其充分溶胀后取出，用无水乙醇洗去其中的添加剂，直至不
产生白色浑浊为止，再浸泡于无水乙醇中备用，临用前用水洗涤至无醇味即可。
1. 2. 2 上样液的制备 将处理好的树脂徐徐加入层析柱中，同时打开活塞，使树脂在溶剂的流动作
用下沉降并堆积成树脂床后，用水洗去原来的溶剂，然后将水放出直至液面与树脂床床面相平，关闭
活塞。对于阳离子交换树脂，流出液应冲洗至中性，对于大孔吸附树脂，流出液无醇味即可。
干燥后的倒提壶药材进行粉碎，过筛得 100 目药材粉末。称取药材粉末 60 g 于 500 mL 圆底烧瓶
中，加入 360 mL 0. 3%的 HCl溶液，在 90 ℃下回流提取 1. 5 h，过滤，收集滤液。重复 3 次，合并 3
次滤液，混合均匀即得提取液。将提取液在 3 500 r /min 下离心 5 min，取上清液为上样液。上样液在
低温下贮藏，备用。
1. 2. 3 样品的分离纯化 ①阳离子交换树脂洗脱:取处理好的 001 × 732 阳离子交换树脂 20 mL 进行
湿法装柱，上样液放至室温，用 2 mol /L HCl溶液调至 pH 2. 0 后进行上样，上样量为 100 mL，流速控
制为 2 mL /min，用 100 mL 水洗去非离子性成分，再用 520 mL的 1 mol /L NaCl溶液以相同流速进行洗
脱，收集洗脱液，备用。
样品检测:取 5 mL NaCl 洗脱液，用 2 mol /L 的 NaOH 溶液调至 pH 10. 0，挥干后加 10 mL 甲醇，
超声处理后过滤，滤渣加 10 mL甲醇，超声后过滤，合并滤液，挥干，甲醇定容至 5 mL，进行 HPLC
分析。
②第一次大孔吸附树脂洗脱:取处理好的 BS － 65 大孔吸附树脂 80 mL进行湿法装柱，阳离子交换
树脂的洗脱液用 2 mol /L NaOH碱化至 pH 10. 0 后以 2 mL /min的流速进行上样，采用 160 mL pH 9. 0 的
碱水洗去水溶性杂质后，在相同流速下用 100 mL的乙醚洗脱得到天芥菜碱，改用 200 mL的 50%乙醇
水溶液洗脱即得毛果天芥菜碱。各自挥干，定容，进行 HPLC分析。
③第二次大孔吸附树脂洗脱:取乙醚洗脱液水浴挥干，用 50 mL水溶解，调至 pH 10. 0 后，用 100
mL pH 9. 0 的碱水洗去水溶性杂质，通过 80 mL的大孔吸附树脂 BS － 65，用 100 mL 乙醚以 2 mL /min
1340 分析测试学报 第 35 卷
的流速洗脱，收集洗脱液，得天芥菜碱溶液。挥干，定容，进行 HPLC分析。
取 50%乙醇水溶液洗脱液水浴挥干，用 50 mL水溶解，调至 pH 10. 0 后，以 100 mL pH 9. 0 的碱
水洗去水溶性杂质，通过 80 mL的大孔吸附树脂 BS － 65，用 200 mL 50%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱
液，得毛果天芥菜碱溶液。挥干，定容，进行 HPLC分析。
1. 2. 4 色谱分析条件 ①HPLC 分析［16 － 17］:将上述处理液用 0. 45 μm 滤膜过滤，按以下色谱条件测
定:色谱柱 Phenomenex Luna C18(5 μm，250 mm × 4. 6 mm)，流动相二元梯度洗脱:乙腈(A)，含
0. 1%三乙胺的水溶液(B)，流速:1. 0 mL /min，检测波长:220 nm，柱温:室温，进样量:20 μL，
梯度洗脱条件:0 ～ 10 min，15%～30%A;10 ～ 40 min，30%～50%A。
②TLC分析:取适量天芥菜碱和毛果天芥菜碱，溶于甲醇后，制成天芥菜碱和毛果天芥菜碱的混
合标准溶液，混标液与待测样品按以下色谱条件分析:固定相:2% NaOH硅胶 G薄层板;展开剂:氯
仿 －甲醇 －浓氨水(4. 5 ∶ 0. 6 ∶ 0. 3);显色剂:碘化铋钾。
2 结果与讨论
2. 1 大孔吸附树脂纯化条件的考察
2. 1. 1 大孔吸附树脂的选择 选择 AB －8，BS － 65，BS － 30，HPD －400 和 CAD －40 5 种树脂按照实
验方法进行静态吸附和解吸附试验，考察了不同树脂对天芥菜碱和毛果天芥菜碱的吸附量、吸附率、
解吸率和回收率。
精密称取上述树脂各约 2. 0 g，置于 150 mL 带塞锥形瓶中，精密加入浓度分别为 1 042. 8 μg /mL
和 1 006. 0 μg /mL的天芥菜碱和毛果天芥菜碱原料药溶液 100 mL，置于恒温振荡器中，在 100 r /min，
30 ℃条件下静态吸附 3 h;过滤树脂，收集吸附后的溶液待测，然后用水洗吸附后树脂，滤干后置于
150 mL干净的带塞锥形瓶中，精密加入 100 mL 95%乙醇，置于恒温振荡器中，在 100 r /min，30 ℃条
件下静态解吸附 3 h，过滤树脂，收集洗脱液待测。
表 1 不同树脂对天芥菜碱及毛果天芥菜碱的吸附和解吸附情况
Table 1 Adsorption and desorption of heliotrine and lasiocarpine with different resins
Compound Ｒesin type
Adsorption
quality(mg /g)
Adsorption
rate(%)
Desorption
rate(%)
Ｒecovery(%)
Heliotrine AB － 8 38. 9 79. 4 92. 3 95. 4
BS － 65 46. 3 89. 8 89. 5 97. 1
BS － 30 35. 0 72. 3 92. 4 96. 6
HPD － 400 43. 5 82. 4 88. 9 94. 2
CAD －40 38. 3 78. 1 85. 8 92. 7
Lasiocarpine AB － 8 13. 8 27. 8 51. 9 93. 4
BS － 65 20. 1 37. 9 52. 1 98. 1
BS － 30 13. 6 24. 9 52. 3 95. 7
HPD － 400 15. 9 31. 1 51. 8 96. 2
CAD －40 14. 8 28. 2 53. 2 96. 5
采用静态吸附实验，通过表 1 结果对比，发现 BS － 65 大孔吸附树脂对天芥菜碱和毛果天芥菜碱的
吸附量和回收率均明显优于其他型号的树脂。大孔吸附树脂可以有效地吸附具有不同化学性质的各种
类型化合物，其吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质，即树脂的极性(功能基)和空间结构(孔径、
比表面积、孔容)，表 1 中只有 AB －8 和 BS － 65 是非极性树脂，其在极性溶剂(加水)中吸附非极性物
质，并且 BS － 65 的比表面积比 AB － 8 大，BS － 65 适合分离纯化生物碱成分，因此选择 BS － 65 对天
芥菜碱和毛果天芥菜碱进行分离。
2. 1. 2 pH值对树脂吸附量的影响 称取 BS － 65 大孔吸附树脂 0. 5 g 于 100 mL 带塞三角烧瓶中，分
别加入 pH 5. 0，7. 0，9. 0，10. 0，11. 0 的上样液 25 mL，置于摇床中，在 30 ℃，100 r /min 下振荡 12
h，取上清液，分别测定吸附前后溶液中天芥菜碱和毛果天芥菜碱的浓度，并计算其静态饱和吸附量。
结果显示，两生物碱的吸附量均随 pH值的升高而逐渐增大，这是因为随着 pH值的增大，天芥菜碱和
毛果天芥菜碱主要以分子形式存在于溶液中，增强了其与 BS － 65 大孔吸附树脂的吸附作用力，有利于
两种生物碱在 BS － 65 树脂上的吸附。但当 pH≥10 时趋于平衡，吸附量基本不变化。因此，本实验在
第 10 期 樊轻亚等:树脂法分离纯化倒提壶生物碱的研究 1341
利用 BS － 65 树脂对天芥菜碱和毛果天芥菜碱进行分离时，选择上样液的 pH值为 10. 0。
2. 1. 3 洗脱剂的选择 考察了石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、无水乙醇、50%乙醇水溶
液 7 种洗脱剂的洗脱效果。结果显示，石油醚的洗脱液中无天芥菜碱或毛果天芥菜碱，可能是因为石
油醚的极性过低，对天芥菜碱和毛果天芥菜碱的洗脱不利;丙酮、正丁醇和乙酸乙酯洗脱液中虽均含
有天芥菜碱和毛果天芥菜碱，但分离效果不理想;在无水乙醇洗脱液和 50%乙醇洗脱液中，均含有较
高浓度的毛果天芥菜碱，但无水乙醇洗脱液中还含有较多杂质。乙醚洗脱液中也含有天芥菜碱和毛果
天芥菜碱，但天芥菜碱的含量明显减少。从结构上看，天芥菜碱和毛果天芥菜碱均属于吡咯里西啶生
物碱。天芥菜碱母核结构上含有两个羟基，毛果天芥菜碱母核结构上含有的两个羟基已形成酯基，故
天芥菜碱的极性大于毛果天芥菜碱，50%的乙醇水溶液由于极性较大，故主要洗脱天芥菜碱，乙醚极
性较小，主要洗脱毛果天芥菜碱。综合考虑，选择乙醚和 50%乙醇水溶液分别对毛果天芥菜碱和天芥
菜碱进行洗脱。
2. 1. 4 洗脱剂用量的考察 对洗脱剂用量进行 TLC跟踪，用 400 mL pH 9. 0 的碱水洗去杂质成分后以
乙醚对毛果天芥菜碱进行洗脱，结合 TLC检测结果显示，当毛果天芥菜碱洗脱完全后改用 50%乙醇水
溶液对天芥菜碱进行洗脱，直至 TLC显示天芥菜碱洗脱完全。用 HPLC 对上述洗脱液进行分析，结果
表明，分别使用 100 mL乙醚和 200 mL 50%乙醇水溶液进行洗脱可获得毛果天芥菜碱和天芥菜碱。
2. 2 分离纯化效果的比较
对上样液通过以下 4 种不同的方式进行分离纯化:仅用 BS － 65 大孔吸附树脂，仅用 001 × 732 阳
离子交换树脂，001 × 732 阳离子交换树脂与一次 BS － 65 大孔吸附树脂联用，001 × 732 阳离子交换树
脂与两次 BS － 65 大孔吸附树脂联用，结果见表 2，洗脱液色谱图见图 2。
表 2 各种分离纯化天芥菜碱和毛果天芥菜碱方法的结果比较
Table 2 Ｒesults of all kinds method of separation and purification on heliotrine and lasiocarpine
Method
Purity(%) Yield(mg /g)
Lasiocarpine Heliotrine Lasiocarpine Heliotrine
上样液 0. 73 2. 2 10. 7 4. 6
仅用 BS － 65 大孔吸附树脂 7. 7 12. 4 49. 2 21. 3
仅用 001 × 732 阳离子交换树脂 14. 9 28. 6 28. 7 13. 8
001 × 732 阳离子交换树脂与一次 BS － 65 大孔吸附树脂联用 67. 2 66. 8 75. 2 33. 2
001 × 732 阳离子交换树脂与两次 BS － 65 大孔吸附树脂联用 81. 6 79. 2 92. 7 50. 6
图 2 各种洗脱液的色谱图
Fig. 2 Chromatograms of all kinds of elution liquid
A:sample solution，B:ether elution solution by CEＲ and once MAＲ，C:ether elution solution by CEＲ and twice MAＲ，D:50% ethanol
elution solution by CEＲ and once MAＲ，E:50% ethanol elution solution by CEＲ and twice MAＲ;1． heliotrine，2． lasiocarpine
1342 分析测试学报 第 35 卷
由表 2 可知，毛果天芥菜碱与天芥菜碱的纯度分别由 0. 73%和 2. 2%提高至 81. 6%和 79. 2%;其
纯度分别提高了 111 倍和 36 倍，提取率分别由 4. 6 mg /g和 10. 7 mg /g提高至 50. 6 mg /g和 92. 7 mg /g。
对上样液(图 2A)、通过阳离子交换树脂和一次大孔吸附树脂的乙醚洗脱液(图 2B)、通过阳离子
交换树脂和两次大孔吸附树脂的乙醚洗脱液(图 2C)、通过阳离子交换树脂和一次大孔吸附树脂的
50%乙醇水溶液洗脱液(图 2D)以及通过阳离子交换树脂和两次大孔吸附树脂的 50%乙醇水溶液洗脱
液(图 2E)进行 HPLC色谱分析，结果见图 2。
根据图 2B和图 2C可知，经过两次大孔吸附树脂之后，天芥菜碱基本被洗去，可分离出毛果天芥
菜碱，由图 2D和图 2E可知，经过两次大孔吸附树脂之后，毛果天芥菜碱基本被洗去，可完全分离出
天芥菜碱。由此可知，上样液经过 001 × 732 阳离子交换树脂与两次 BS － 65 大孔吸附树脂联用进行分
离纯化，使用乙醚和 50%乙醇水溶液洗脱可将毛果天芥菜碱和天芥菜碱完全分离，提纯效果最佳。
3 结 论
本文采用阳离子交换树脂和大孔吸附树脂联用的方法，对倒提壶中的生物碱进行分离纯化，可以
完全分离出天芥菜碱和毛果天芥菜碱。本方法具有成本低、污染小、周期短、操作简单、分离纯化效
率高等特点，适合进行工业化生产。
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