全 文 ：3　讨论
3.1　 2005年版中国药典收载的鸡冠花炒炭方法 。
该法为手工炒制 ,其炒制的温度和时间较难控制 ,劳
动强度大 ,翻动药物频繁 ,饮片易破碎 ,灰屑较多 ,器
具敝开 ,原药气味散失大 ,其火候掌握完全依靠药工
技术而定 ,质量评价亦多是外观描述等主观性较强
的指标 ,而且质量标准差异较大 。因此 ,亟需逐步统
一规范 。
3.2　本实验以鸡冠花炭的凝血时间为指标 ,采用
正交试验法对其炮制工艺进行优选。由表 1可看出
样品 5组最符合中国药典鸡冠花炭外观质量标准
(外焦黑色 ,内焦褐色)。表 2可知鸡冠花炭各炮制
品对小鼠的凝血时间均有明显缩短作用 ,尤以样品
5组的凝血作用最好 ,且样品 5组与对照组比较 P<
0.05,差异性显著。综合鸡冠花炭的外观性状标准
和对小鼠凝血时间等因素 ,故可确定鸡冠花炭的最
佳工艺为 220℃、加热 5min,烘制。
3.3　本方法可靠 ,操作简单 ,测定结果能反映客观
实际 ,是对实现鸡冠花炭炮制条件统一和规范的重
要尝试与探索 ,也为鸡冠花炭饮片进一步的质量标
准研究奠定了基础 。
参 考 文 献
[ 1] 国家药典委员会 .中华人民共和国药典 [ S] .一部 .北
京:化学工业出版社 , 2005:135, 附录 20.
[ 2] 陈奇 .中药药理研究方法学 [ M] .北京:人民卫生出版
社 , 1993:480.
·鉴别 ·
广东土牛膝色谱指纹图谱研究
谢晓玲 1 ,徐新军1＊ ,陈　孝 2 ,万金志 1 ,闫李丽1 ,杨得坡 1
(1.中山大学药学院 ,广东 广州 510006;2.中山大学附属第一医院 ,广东 广州 510080)
　　摘要　目的:建立广东土牛膝药材的指纹图谱。方法:采用高效液相色谱法建立 10批广东土牛膝药材的指纹
图谱 , 用液相色谱-质谱联用技术标记指纹图谱中的主要色谱峰。结果:获得的指纹图谱有 16个共有峰 ,聚类分析
结果将 10批药材分为两类 ,根据质谱提供的信息标记了 5个共有峰。结论:广东土牛膝药材指纹图谱的特征性及
专属性强 , 可用于药材的质量控制。
　　关键词　广东土牛膝;指纹图谱;液相色谱-质谱联用;聚类分析
　　中图分类号:R282.5/R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)07-1068-04
收稿日期:2009-11-04基金项目:广东省科技厅国际合作基金(2008A050200005);科技部国际合作项目(2008TR1005)作者简介:谢晓玲(1984-),女,硕士研究生 ,研究方向:中药质量标准和药代动力学研究;Tel:13828413513, E-mail:cambyxxl@hotmail.com。＊通讯作者:徐新军 , Tel:13924061779, E-mail:xxj2702@sina.com。
　　广东土牛膝为菊科植物华泽兰 Eupatorium
chinenseL.的干燥根 ,具有清热解毒 、凉血利咽 、抗
炎镇痛的功效〔1, 2〕 , 有喉科圣药之称 ,收载于 2004
年版《广东省中药材标准 》第一册。笔者采用高效
液相色谱法建立其指纹图谱 , 运用聚类分析方法进
行考察 ,并采用液相色谱-质谱联用技术对部分成分
进行初步定性 ,以期为全面评价药材的质量提供客
观 、科学的依据。
1 　仪器与材料
　　Waters1525型高效液相色谱仪(自动进样器 ,
2996型二极管阵列检测器 , Empower色谱工作站);
FinniganTSQ型液相色谱-串联质谱联用仪(配有四
元梯度输液泵 ,自动进样器 ,二极管阵列检测器 、电
喷雾离子源及 Xcalibur1.3数据处理系统);Metler
toledo电子天平;宁波新芝超声波清洗器 。乙腈为
色谱纯 ,水为重蒸馏水 ,其他试剂均为分析纯 。
　　12, 13-二羟基泽兰素和泽兰素对照品为笔者从
广东土牛膝药材中分离得到 , HPLC检测其纯度均
大于 98%。
　　实验用广东土牛膝药材来源见表 1。经中山大
学药学院徐新军副教授鉴定为菊科植物华泽兰 Eu-
patoriumchinenseL.的干燥根 。
2　方法与结果
2.1 　色谱条件　DiamonsilC18柱 (250 mm×4.6
mm, 5 μm);流动相 A:0.2%磷酸水溶液 , B:乙腈 ,
梯度洗脱程序:0 ～ 5min, B为 10%;5 ～ 10min, B由
10% ～ 25%;10 ～ 25 min, B由 25% ～ 48%;25 ～ 30
min, B为 48%;30 ～ 40min, B由 48% ～ 80%;检测
·1068· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 7期 2010年 7月
　表 1　 广东土牛膝药材来源
编号 来源 编号 来源
S1 广东连州 S6 广东广州
S2 广东肇庆 S7 广东佛山
S3 广西柳州 S8 广东揭阳
S4 广西梧州 S9 广东韶关
S5 湖南永州 S10 广东清远
波长:240 nm;柱温:室温;流速:1.0 mL/min;进样
量:20 μL。
2.2 　质谱条件　液相条件同前 ,进样量:10 μL,分
流比为 1∶2,离子源为电喷雾离子源(ESI源);正离
子方式扫描;质荷比扫描范围 m/z:80 ～ 800;毛细
管电压:3 500 V;加热毛细管温度:350 ℃;传输电
压:30 V。
2.3 　对照品溶液的制备　精密称取 12, 13-二羟基
泽兰素和泽兰素对照品适量 ,置 25mL量瓶中 ,用甲
醇溶解并稀释至刻度 ,配制成混合对照品溶液 ,备
用 。
2.4 　供试品溶液的制备　取干燥的广东土牛膝药
材粉末(过 140目筛)约 1 g,精密称定 ,置具塞锥形
瓶中 ,加甲醇 25 mL,密塞 ,称定重量 ,超声(功率为
600W,频率为 40 kHz)20 min,用甲醇补足减失的
重量 , 0.45 μm微孔滤膜滤过 ,作为供试品溶液。
2.5 　方法学考察
2.5.1　精密度试验:取编号为 S7的样品一份 ,按
“2.4”项下方法制备供试品溶液 ,按 “ 2.1”项下色谱
条件连续进样 6次 ,记录指纹图谱 。由于 12, 13-二
羟基泽兰素在各批样品中均为主峰 ,峰型稳定且与
其他色谱峰分离良好 ,因此选择其作为参照峰。计
算各共有峰的相对保留时间和峰面积的 RSD分别
小于 0.5%和 2.6%,表明仪器精密度良好 。
2.5.2 　稳定性试验:取编号为 S7的样品一份 ,按
“2.4”项下方法制备供试品溶液 ,分别在制备后的
0、2、4、8、12、24 h进样。各共有峰的相对保留时间
和峰面积的 RSD分别小于 0.7%和 2.7%,表明供
试品溶液在 24 h内稳定。
2.5.3 　重复性试验:取编号为 S7的样品 6份 ,制
备成供试品溶液后进样分析 ,各共有峰的相对保留
时间和峰面积的 RSD分别小于 0.6%和 2.9%,表
明方法重复性良好 。
2.6　指纹图谱的建立与主要色谱峰的标记　按上
述方法测定 10批广东土牛膝药材样品 ,根据保留时
间和紫外吸收光谱特征标定了 16个共有峰 ,色谱图
见图 1。其中 6号峰为 12, 13-二羟基泽兰素 , 13号
峰为泽兰素。
　　为了更多的了解指纹图谱中各成分的结构信
息 ,对编号为 S7的广东土牛膝药材进行了 HPLC-
MS分析 ,参考广东土牛膝的相关文献 〔3-6〕报道 ,初
步鉴定了 5个共有峰成分。成分信息见表 2,色谱
图和总离子流图见图 2。
图 1　10批广东土牛膝药材 HPLC指纹图谱
1 ～ 16.共有峰的序号
·1069·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 7期 2010年 7月
　　表 2　 广东土牛膝药材指纹图谱的化学成分指认
共有峰
序号
出峰时间/min 准分子离子峰[ M+H] + 分子式 化合物
6 22.30 250.9 C13H14O5 12, 13-二羟基泽兰素　12, 13-dihydroxyeuparin
7 29.00 202.9 C13H14O2 2-异丙烯基-5-乙酰基-2, 3-二氢苯并呋喃5-acetyl-2-isopropenyl-2, 3-dihydrobenzofuran
8 31.55 234.8 C14H10N4 2, 3-二氰基-5甲基-7-苯基-1, 4, 6H-二氮杂卓2, 3-dicyano-5-methyl-7-phenyl-1, 4, 6H-diazepine
11 41.42 218.9 C13H14O3 2-异丙基-5-乙酰基-6-羟基苯并呋喃5-acetyl-2-isopropyl-6-hydroxybenzofuran
13 44.57 217.0 C13H12O3 泽兰素　euparin
图 2　广东土牛膝药材的色谱图(A)和总离子流图(B)
2.7 　指纹图谱的相似度分析　采用中南大学设计
的中药指纹图谱计算机辅助相似性评价系统软件 ,
根据 10批药材的色谱图生成对照指纹图谱 ,进行相
似度分析。以相关系数(中位数)代表其相似度 , 10
批药材的相似度分别为:0.9623, 0.9406, 0.9421,
0.9575, 0.9758 , 0.6532 , 0.9321 , 0.7184, 0.9174,
0.7933。其中 ,有 7批样品的相似度在 90%以上 ,
相似度较高 , S6、S8、S10这 3批样品的相似度较低。
2.8 　聚类分析　将 10批药材指纹图谱中各共有
峰和其他主要峰的峰面积相对于参照峰进行量化处
理后输入 SPSS11.0软件进行聚类分析 。采用欧氏
距离作为样品测度 ,并用离差平方和法进行系统聚
类 ,得到 10批样品的聚类分析图 。结果显示 10批
样品大致可分成 2类 ,相似度大于 0.94的 S1、S2、
S3、S4、S5为一类 ,相似度较低的另外 5批样品为一
类 。见图 3。
图 3　广东土牛膝药材指纹图谱聚类分析图
3　讨论
3.1　提取方法和提取溶剂的选择:考察水浴回流
和超声对广东土牛膝药材的提取效果 ,发现部分极
性较小的成分受热不稳定 ,而超声获得的色谱峰较
多且操作简便 ,因此选用超声法提取。比较了甲醇 、
乙醇和乙酸乙酯 3种不同极性的溶剂对提取的影
响 ,结果表明甲醇提取的色谱峰高且多 ,效果较好。
3.2　提取条件的优化:为了进一步优化甲醇超声
提取广东土牛膝药材的条件 ,选用了正交试验考察
药材粒度 、甲醇用量和提取时间等因素 ,方差分析结
果表明药材粒度影响显著 ,甲醇用量和提取时间影
响不大 ,确定最佳提取工艺如 “2.4”项下所述 。
3.3　检测波长的考察:根据二极管阵列紫外检测
器 210 ～ 400 nm的扫描结果 ,发现 240nm检测到的
色谱峰最多 ,且基线平稳 ,干扰少 ,因此选择 240 nm
作为检测波长 。
3.4　本研究采用聚类分析方法 ,充分挖掘指纹图
谱的数据信息 ,寻找指纹特征 ,为全面控制广东土牛
膝药材的质量提供依据 。分类结果显示 ,即使是广
东省内不同地区所产的广东土牛膝药材之间仍然存
在较大的差异 ,可能和生长年限 、采收期 、土壤等有
关 ,需作进一步研究 。
3.5　本实验根据已有的华泽兰与广东土牛膝化学
成分的报道 ,采用质谱技术对药材成分进行初步定
性 ,为指纹图谱提供更多化合物方面的信息 ,使其能
更合理可靠的控制药材质量。文献 〔5, 7-9〕报道的华
泽兰全草和地上部分主要成分为倍半萜 ,而广东土
牛膝药材的化学成分标记结果显示药材主要含苯并
呋喃类化合物 ,倍半萜成分较少 ,且不是指纹图谱的
共有峰成分。在目前广东土牛膝药效成分尚未完全
阐明的情况下 ,因注意控制其药用部位 。
参 考 文 献
[ 1] 梅全喜 , 吴惠妃 .广东土牛膝的药用历史及现代研究
概况 [ J] .中医药学刊 , 2005, 23(11):1995-1997.
[ 2] 刘晓燕 ,曾晓春 , 江剑东 ,等 .广东土牛膝抗炎镇痛的研
·1070· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 7期 2010年 7月
究 [ J] .中医药学刊 , 2004, 22(8):1566-1568.
[ 3] Hussein, N.S.BenzofuransfromSeneciodesfontainei[ J] .
Pharmazie, 1992, 47(6):468.
[ 4] 李小玲 ,宋粉云 .广东土牛膝超临界流体萃取物的 GC-
MS分析 [ J] .分析测试学报 , 2001, (2):85-87.
[ 5] HerzW.ChemistryoftheEupatorinae[ J] .BiochemSyst
Ecol, 2001, 29:1115-1137.
[ 6] 李云森 , 王峥涛 ,张勉 , 等.黄亮橐吾的苯并呋喃类化合
物 [ J] .中草药 , 2005, 36(3):336.
[ 7] YangSP, HuoJ, WangY, etal.CytotoxicSesquiterpe-
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[ 8] LiawCC, KuoYH, HwangTL, etal.EupatozansinsA-C,
SesquiterpeneLactonesfrom Eupatorium chinensevar.
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[ 9] YangSP, ChengJG, HuoJ, etal.SevennewSesquiter-
peneLactonesfromEupatoriumchinense[ J] .ChineseJ.
Chem., 2005, 23:1530-1536.
三叶木通 HPLC指纹图谱研究
张　宁 1 ,肖娅萍 1, 2, 3＊ ,乐　圆 1 ,洪叶岚 1 ,吴永朋 1
(1.陕西师范大学生命科学学院 ,陕西 西安 710062;2.教育部药用植物资源及天然药物化学重点实验室 ,
陕西 西安 710062;3.西部濒危药材开发国家工程实验室 ,陕西 西安 710062)
　　摘要　目的:采用反相高效液相色谱建立三叶木通药材的指纹图谱。方法:采用 HibarC
18
(250 mm×4.6 mm,
5 μm)色谱柱;乙腈和水梯度洗脱;流速:0.8 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:210 nm。 结果:对采集的 10批三叶木
通药材进行了测定 , 标定了 14个共有峰 ,建立了三叶木通 HPLC指纹图谱。 结论:该方法准确可靠 , 重现性好 ,可
为控制三叶木通药材质量提供科学依据。
　　关键词　三叶木通;高效液相;指纹图谱
　　中图分类号:R282.5/R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)07-1071-03
收稿日期:2009-12-07基金项目:“十一五 ”科技支撑计划(2006BAI06A13-06)作者简介:张宁(1984-),女 ,在读硕士研究生 ,研究方向:药用植物生物技术;Tel:13474026347, E-mail:1ningjingdexiatian@163.com。＊通讯作者:肖娅萍 , E-mail:yapingxiao@snnu.edu.cn。
　　三叶木通 Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.为木
通科木通属落叶藤本植物 ,主产于陕西南部 、河南南
部 、湖北西部及四川 、甘肃等地 ,日本亦有分布 〔1〕。
全株均可入药。具有舒肝理气 、活血止痛 、除烦利尿
的功效 〔2〕。由于受产地 、气候和生态环境等影响 ,
不同产地的三叶木通品质各异 ,且药材市场中发现
其混淆品销售 ,因此需要建立一套能严格控制药材
质量的技术方法 。本实验按照指纹图谱的技术要
求 〔3〕 ,对 10批三叶木通药材进行测定 ,建立 HPLC
指纹图谱 ,以期为其质量控制提供有效的方法 。
1 　仪器与材料
1.1 　仪器　日本岛津 LC2010A高效液相色谱仪
(四元梯度泵 , UVD检测器);AT2201电子分析天平
(d=0.1mg);SK5200H超声波发射仪;GM-0.33Ⅱ
隔膜真空泵;HH-6B数显恒温水浴锅 (国华电器有
限公司)。
1.2 　材料　实验用三叶木通样品来源见表 1。经
陕西师范大学生命科学学院田先华教授鉴定为木通
科木通属植物三叶木通 Akebiatrifoliata(Thunb.)
Koidz.。乙腈 、甲醇为色谱纯(Fisher),其他试剂均
为分析纯 , 水为超纯水;齐墩果酸 (批号 110709-
200304)、常春藤皂苷(批号 111733-200502)对照品
购自中国药品生物制品检定所。
　表 1　 10批三叶木通药材来源
编号 产地 采集时间
S1 陕西镇安回龙镇肖家沟 2007.09
S2 陕西镇安回龙镇肖家沟 2007.09
S3 陕西秦岭沣裕口 2007.09
S4 陕西秦岭沣裕口 2007.09
S5 陕西镇安三叶木通基地 2007.09
S6 湖北神农架松柏镇 2007.09
S7 湖北神农架松柏镇 2007.09
S8 贵州施秉县石板屯 2007.04
S9 贵州施秉县石板屯 2007.09
S10 贵州施秉县石板屯 2007.09
2　方法与结果
2.1　色谱条件　色谱柱:HibarC18(250 mm×4.6
mm, 5μm);流动相:乙腈(A),超纯水(B),梯度洗
·1071·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 7期 2010年 7月