全 文 ：第33卷第 5期　　　　　　　　　 西南 大学 学 报(自然科学版)　　　　　　　　　　　2011年5月
Vol.33　No.5 Journal of Southw est Unive rsity (N atural Science Edi tion) May　2011
文章编号:1673-9868(2011)05-0184-05
蝎子草醇提浸膏对
金黄色葡萄球菌抗菌机制的研究＊
江震献1 , 　彭　霞1 , 　张晓林1 ,
朱　玲1 , 　李海霞1 , 　陈章宝1 , 2
1.西南大学 药学院 , 重庆 400715;2.重庆市兽药工程技术研究中心 , 重庆 400715
摘要:目的:研究蝎子草醇提浸膏(Girard inia suborbiculata C.J.Chen e thanol ex tract , GSEE)对金黄色葡萄球菌
的抗菌机制.方法:测定蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC), 通过 GSEE 对菌体生长曲线 、
菌体可溶性蛋白的表达和菌体核酸合成等的影响来对 GSEE的抗菌机制进行研究.结果:GSEE对金黄色葡萄球菌
的 MIC 为 100 mg/ mL , 可明显抑制金黄色葡萄球菌对数生长期的菌体分裂;SDS-PAGE 电泳表明 , 金黄色葡萄球
菌的可溶性蛋白含量在 GSEE 作用后的条带明显少于对照组;同时 , 通过 DAPI 染色显示 , GSEE 对菌体的核酸合
成具有显著抑制作用.结论:GSEE 对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌作用 , 其抗菌机制可能通过抑制菌体可溶性
蛋白的表达和菌体核酸的合成等方面来实现抑制金黄色葡萄球菌的生长.
关　键　词:蝎子草;抗菌机制;抗菌活性
中图分类号:R285.5;Q93 文献标志码:A
蝎子草(Girardinia suborbiculata), 为荨麻科(Urticaceae)一年生 、多年生草本或半灌木植物.蝎子
草 , 别名红藿毛草 、火麻草 , 是民间常用药荨麻的主要来源之一.其味苦 、辛 , 性凉 , 有小毒;全草祛风除
痰 、利湿解毒 、利气消痰 , 治小儿惊风 、中风不语.目前对蝎子草的研究主要集中在抗炎[ 1-2] 、抗风湿[ 3] 、
镇静作用[ 1-2] 的研究 , 但对其抗菌机制方面的报道较少 , 本研究主要从菌体生长曲线 、菌体可溶性蛋白的
表达和菌体核酸的合成对 GSEE的抗菌机制进行探讨 , 为深度开发蝎子草的利用提供基础资料.
1　材　　料
1.1　蝎 子 草
采自重庆 , 经鉴定确认品种为荨麻科蝎子草属植物蝎子草(Girardinia suborbiculata C.J.Chen).
1.2　菌　　种
金黄色葡萄球菌(S taphy lococcus aureus , 菌种号:CMCC26003), 菌种购于国家医学菌种保藏管
理中心.
1.3　试　　剂
4, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DA PI)(重庆奥哲科技有限公司);其余试剂均为分析纯.
＊收稿日期:2010-08-30
基金项目:重庆市科委重点攻关资助项目(CSTC ;2009AB1181).
作者简介:江震献(1986-), 男 , 福建永定人 , 硕士研究生 , 主要从事微生物与生化药学.
通信作者:陈章宝 , 副教授 , 硕士生导师.
DOI :10.13718/j.cnki.xdzk.2011.05.029
1.4　培 养 基
肉汤液体培养基:蛋白胨 10 g , 牛肉膏 5 g , 氯化钠 5 g , 定容至 1 000 mL , 121 ℃灭菌 30 min.
肉汤固体培养基:肉汤液体培养基中加入 2%的琼脂粉.
1.5　主要仪器
RE-2000旋转蒸发仪 , 上海亚荣生化仪器厂;高速台式冷冻离心机 , SIGMA 3 K15;SW-CJ-1D型超净
工作台 , 苏州净化;LDZX-50FBS高压灭菌锅 , 上海申安医疗器械厂;DYCZ-24DN型电泳仪 , 北京市六一
仪器厂;F-4500荧光分光光度计 , 日本 HITACHI;FA2104A 分析天平 , 上海精天电子仪器厂;U-1800分
光光度计 , 日本 HITACHI;BX51荧光显微镜 , 日本 O LYMPUS.
2　方　　法
2.1　GSEE的制备
取干燥蝎子草全草 1 kg , 用 70%乙醇 5 L 回流提取 1.5 h , 过滤 , 药渣再加入 5 L 70%乙醇回流提
取1 h , 过滤 , 合并 2 次滤液 , 减压浓缩至粗浸膏.粗浸膏加水 5 L , 无水乙醇 8 L , 放置 24 h沉淀浸膏中
的叶绿素 , 在 8 500 r/min , 4 ℃下离心 10 min , 取上清液减压浓缩至浸膏(1 g 浸膏相当于生药 10 g), 得
到 GSEE.
2.2　GSEE最低抑菌浓度(MIC)测定
用两倍稀释法[ 4] 将GSEE 稀释成浓度分别为 400 , 200 , 100 , 50 mg/mL 的溶液.分别移取 1 mL 菌悬
液(菌体浓度为 108 个/mL), 加入温度在 60 ℃左右的肉汤固体培养基 , 充分混匀 , 迅速倒入培养皿 , 待培
养基完全冷凝后 , 用打孔琼脂扩散法[ 5-6] 测定最低抑菌浓度.
2.3　GSEE的抗菌机制
2.3.1　金黄色葡萄球菌生长曲线测定
将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌菌液 , 按 1%的接种量(菌体浓度为 108 个/mL)分别接种至含
100 mg/mL GSEE的肉汤液体培养基中 , 于 37 ℃, 150 r/min摇床振荡培养 , 每 4 h 取样 , 用分光光度计
在 540 nm下测 OD值 , 连续测 24 h , 以时间为横坐标 , OD值为纵坐标 , 绘制生长曲线.以不加 GSEE的
菌体培养液作对照.
2.3.2　GSEE对菌体细胞可溶性蛋白表达的影响
将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌液 , 按 1%的接种量(菌体浓度为 108 个/mL)分别接种至含
100 mg/mL GSEE的肉汤液体培养基中 , 于 37 ℃, 150 r/min摇床振荡培养 , 以不加 GSEE 的菌体培养液
作对照.分别于 0 , 8 , 12 , 16 , 24 h取样.将样品于 8 000 r/min 离心 10 min , 收集的菌体用100μL 无菌水
重悬 , 再加入 50 μL 的 5×SDS 上样缓冲液 , 煮沸 5 m in , 12 000 r 离心 10 min , 取 10 μL 上清液上样进行
SDS-PAGE 电泳(15%PAGE分离胶).
2.3.3　GSEE对金黄色葡萄球菌核酸的影响
2.3.3.1　GSEE 对金黄色葡萄球菌菌体荧光强度变化的检测
将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌 , 按 1%的接种量(菌体浓度为 108 个/mL)分别接种至含
100 mg/mL GSEE的肉汤液体培养基中 , 于 37 ℃, 150 r/min摇床振荡培养 24 h , 取菌液 10μL 稀释 200
倍后 , 取 100 μL 稀释后的菌液滴加到载玻片上 , 同时滴加等体积的 DA PI 染色液 , 混匀后在黑暗中静置
10 min , 在倒置荧光显微镜下观察 、照相.以不加 GSEE 的菌体培养液作对照.
2.3.3.2　菌体 DNA及 RNA 含量变化的测定
参照王海涛等[ 7] 的做法测定菌体 DNA ,RNA 含量 , 对其作了略微修改.将培养至对数生长期的金黄色
葡萄球菌 , 按 1%的接种量(菌体浓度为 108 个/mL)分别接种至含 100 mg/mL GSEE的肉汤液体培养基
中 , 于 37 ℃, 150 r/min摇床振荡培养.分别取经 GSEE作用 0 ,4 ,8 ,12 ,16 , 20 ,24 h后的菌体样液0.4 mL ,
加入 20μL 的 DA PI染色液 , 振荡10 min , 使其混匀 , 然后立即在荧光分光光度计下测定.当测定 DNA含
量变化时 , 其荧光参数为 ex=364 nm , em=450 nm , 狭缝 5 nm;当测定 RNA 含量变化时 , 其荧光参数为
ex=400 nm , em=465 nm , 狭缝 5 nm.每组试验重复 3次.以不加 GSEE的菌体培养液为对照.
185第 5期　　　　　　江震献 , 等:蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌抗菌机制的研究
3　结　　果
3.1　GSEE的MIC测定
不同浓度的 GSEE对金黄色葡萄球菌的 M IC试验结果见表 1.由表 1可知 , GSEE对金黄色葡萄球菌
具有明显的抑制作用 , GSEE浓度为 400 mg/mL时 , 抑菌作用最强 , 抑菌圈直径达到 15 mm , 随着 GSEE
浓度降低 , 抑菌圈直径逐渐减小 , 抑菌效果减弱.当 GSEE 浓度为 50 mg/mL , 抑菌圈直径只有 6 mm , 因
打孔琼脂扩散法用的打孔器直径为 6 mm , 表明在此浓度下没有抑菌效果;当 GSEE 浓度为 100 mg/mL
时 , 抑菌圈直径为 10 mm , 因此 , GSEE的 M IC为 100 mg/mL .
表 1　GSEE对金黄色葡萄球菌的MIC
GSEE 浓度/(mg·m L-2) 400 200 100 50 对照
抑菌圈直径/ mm 15 12 10 6 6
图 1　蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌
生长曲线的影响
3.2　GSEE对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响
GSEE对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响见图
1.从图1中可知 , 对照中金黄色葡萄球菌迅速进入了
对数生长期 , 而加入了 GSEE后 , 金黄色葡萄球菌的
生长明显受到抑制 , 菌体的生长一直处于较低的水
平 , 表明 GSEE能够抑制金黄色葡萄球菌对数生长期
的菌体分裂生长.
3.3　GSEE对菌体细胞可溶性蛋白表达的影响
GSEE对菌体细胞可溶性蛋白表达的影响见图
2.从图 2结果可知 , GSEE 作用后的金黄色葡萄球菌
可溶性蛋白 SDS-PAGE 电泳图谱与对照的金黄色葡
注:M 为 Marker;泳道 1 , 3 , 5 , 7 , 10分别为对照的 0 , 8 , 12 , 16 , 24
h;泳道 2 , 4 , 6 , 8 , 9分别为 GSEE作用 0 , 8 , 12 , 16 , 24 h.
图 2　GSEE作用后的金黄色葡萄球菌
的 SDS-PAGE电泳图
萄球菌可溶性蛋白 SDS-PAGE电泳图谱 , 呈现明
显的差别.经 GSEE作用后 , 金黄色葡萄球菌可溶
性蛋白含量在 SDS-PAGE 电泳图中条带稀少 , 而
对照组中的金黄色葡萄球菌可溶性蛋白含量在逐
渐增加 , 条带也越来越深.
上述分析可表明 , GSEE 对金黄色葡萄球菌的
可溶性蛋白表达具有明显抑制作用.
3.4　GSEE对金黄色葡萄球菌核酸的影响
3.4.1　GSEE对金黄色葡萄球菌菌体荧光强度变
化的影响
GSEE作用 24 h 后的金黄色葡萄球菌的荧光
显微镜观察结果见图 3.由图 3可知 , 对照的核酸
含量明显高于GSEE.这表明 GSEE 抑制了金黄色
葡萄球菌菌体核酸的合成 , 从而 GSEE的核酸含量明显低于对照.
3.4.2　菌体 DNA 和 RNA 含量变化的影响
菌体 DNA含量变化见图 4 , 菌体 RNA 含量变化见图 5.由图4 、图 5可知 , 经GSEE作用后的金黄色
葡萄球菌的核酸含量受到了明显抑制 , 均小于对照 , 其一直处于较低的水平.GSEE 的核酸含量明显低于
对照 , 表明 GSEE 可抑制金黄色葡萄球菌核酸的合成.
186 西南大学学报(自然科学版)　　　　　ht tp://xbbjb.sw u.cn　　　　　第 33卷
注:A:对照组;B:GSEE组.
图 3　GSEE作用的金黄色葡萄球菌 24 h后的荧光显微镜图谱(×400)
图 4　GSEE作用后金黄色葡萄球菌 DNA 含量 图 5　GSEE作用后金黄色葡萄球菌 RNA含量
4　讨　　论
本文研究 GSEE 对金黄色葡萄球菌的抗菌作用.GSEE 显示出对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌作用 ,
其 MIC为 100 mg/mL.
微生物 OD值是反映菌体生长状态的一个指标[ 8] , OD值越高 , 代表其菌体密度越大.GSEE能够抑制
金黄色葡萄球菌对数生长期的菌体分裂 , 对数生长期是细菌细胞分裂的主要时期 , 也是核酸 、蛋白质合成
的主要时期 , 因此 , 根据本研究结果可以推测 GSEE对金黄色葡萄球菌的抑制作用可能通过抑制菌体核酸
或可溶性蛋白质的合成来实现.由于试验采用紫外分光光度计测菌体OD540值 , 只能测定菌体的总量 , 因此
活菌数和死菌数未能分别体现出来.
可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类 , 测其含量是了解生物体内总代谢的一个重要指标.
GSEE对金黄色葡萄球菌可溶性蛋白具有抑制作用.SDS-PAGE图谱表明 GSEE 对金黄色葡萄球菌的可溶
性蛋白含量具有明显的抑制作用 , 这可能是由于 GSEE 影响了菌体可溶性蛋白的正常表达或影响了其功
能 , 导致部分蛋白酶不能正常合成或失去原有的酶活性 , 从而影响了菌体的生长 、繁殖.该结果与 Xin Ke
等[ 9]关于壳聚糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体蛋白表达的影响结果相似.
DAPI 是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料 , 能与 DNA 和 RNA 结合[ 10-11] , 核酸量越大 , 荧光亮度
越强.DAPI染色常用于细胞凋亡检测 , 染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测[ 12] .DA PI染色结果显
示 , GSEE能明显抑制金黄色葡萄球菌菌体核酸的合成 , 以致可能影响菌体繁殖 、生长.该试验结果与王海
涛等[ 7] 关于大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌菌体的核酸变化影响结果相似 , 也与 Ulanow ska[ 1 3] 利用放射性同
位素研究染料木素抑制 E.co li和 V.harveyi的核酸结果相似.
对GSEE的抗菌机制作了初步探讨 , 其抗菌机制可能通过抑制菌体可溶性蛋白的表达和菌体核酸的合
成等方面来实现抑制金黄色葡萄球菌的生长.但有关 GSEE的分子抗菌机制还有待进一步深入研究.
187第 5期　　　　　　江震献 , 等:蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌抗菌机制的研究
参考文献:
[ 1] 陶　玲 , 支　娜 , 柏　帅 , 等.大蝎子草抗炎镇痛活性部位研究 [ J] .时珍国医国药 , 2009 , 20(6):1403-1405.
[ 2] 　向少能 , 刘　媛 , 王　洁 , 等.蝎子草浸膏的抗炎 、 抗痛风及镇静作用研究 [ J] .西南师范大学学报:自然科学版 ,
2010 , 35(3):162-167.
[ 3] 　郑庆霞 , 李洪庆.大蝎子草提取物抗风湿活性的初步研究 [ J] .山地农业生物学报 , 2009 , 28(5):429-431.
[ 4] 　HE FENG , YANG YING , YANG GUANG , et al.Studies on Antibacterial Activity and Antibacterial Mechanism of a
Nove l Po ly saccharide fr om S treptomyces virginia HO3 [ J] .Food Cont rol , 2010(21):1257-1262.
[ 5] 　周　英 , 王慧娟 , 段　震 , 等.民族药响铃草的体外抑菌活性研究 [ J] .时珍国医国药 , 2009 , 20(1):67-68.
[ 6] 　姜延伟 , 王懿萍 , 吴玉娟 , 等.黄连多糖抑菌活性初探 [ J] .时珍国医国药 , 2009 , 20(1):48-49.
[ 7] 　王海涛 , 王　倩, 谢明杰.大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌的抑菌机制研究 [ J] .中国农业科学, 2009 , 42(7):2586-2591.
[ 8] 　沈　萍 , 范秀容 , 李广武.微生物学实验 [ M] .北京:高等教育出版社 , 1999:97.
[ 9] 　XIN Ke , CH EN Xi-guang , KONG Ming , et al.Effect of O leoy l-Chito san Nanopar ticles as a Novel Antibacterial Disper-
sion System on Viability , Membrane Permeability and Cell Mo rpho lo gy o f Escherichia coli and Staphy lococcus aureus
[ J] .Carbohydrate Polyme rs , 2009(76):17-22.
[ 10] L I M , WU R S , TSAI J S C.DAPI Deriv ative:A Fluo rescent DNA Dye That Can be Covalently A t tached to Biomo le-
cules [ J] .Bioorg anic &Medicinal Chemistry Letters , 2003(13):4351-4354.
[ 11] DE CAS TRO L F P , ZACHARIAS M.DAPI Binding to the DNA Mino r G roove:a Continuum Solvent Analy sis [ J] .
Journal o f Molecular Recognition , 2002(15):209-220.
[ 12] ST CHIARA HOSP , DEPT PATHOL , TRENT , et al.Flow Cy tometric Assessment of Spermato genesis in Infertile Men by
DAPI-Sulpho rodamine Staining and Vimentin/ DNA Biparametric Analysis [ J] .Cytometry Par t A , 2004(59A):132-136.
[ 13] ULANOWSKA K , TKACZYK A , KONOPA G , et al.Differ ential Antibacterial Activity o f Genistein A rising from
G lobal Inhibition of DNA , RNA and P ro tein Synthesis in Some Bacterial Strains [ J] .Archiv es o f M icrobio lo gy , 2006
(184):271-278.
Studies on Antibacterial Mechanism of Ethanol Extract from
Girardinia suborbiculata C.J.Chen on Staphylococcus aureus
JIANG Zhen-xian1 , 　PENG　Xia1 , 　ZHANG Xiao-lin1 ,
ZH U　Ling1 , 　LI Hai-xia1 , 　CHEN Zhang-bao1 , 2
1.School of Pharmaceutical Sciences , Southwest University , Chongqing 400715 , China;
2.Chongqing Engineering Technology Research Center of Zoopharmaceuticals , Chongqing 400715 , China
Abstract:The minimal inhibitory concentration(M IC)of the ethanol ex t ract f rom Girardinia suborbicula-
ta C.J.Chen (GSEE)against S taphy lococcus aureus was determined and the inf luences o f GSEE on the
grow th curve , soluble pro teins expression and cellular nucleic acid synthesis of the bacterium were detected
so as to study the antibacterial mechanism of GSEE on S.aureus.The results show ed that MIC o f GSEE
against S.aureus was 100 mg/mL .SDS-PAGE indicated that the content o f cellula r soluble pro teins in
GSEE treatment decreased markedly compared wi th that in the contro l g roup.DA PI(46-diamidino-2-phe-
nylindo le)staining assay demonst rated that GSEE had a significant inhibi to ry effect on the synthesis of cel-
lular nucleic acid.It is concluded that GSEE has a good antibacterial activi ty on S.aureus and that the an-
tibacterial mechanism is that GSEE inhibits the g row th of S.aureus by inhibi ting the synthesis of soluble
pro teins and nucleic acid.
Key words:Girardinia suborbiculata C.J.Chen;antibacte rial mechanism ;antibacterial activity
责任编辑　陈绍兰　　　　
188 西南大学学报(自然科学版)　　　　　ht tp://xbbjb.sw u.cn　　　　　第 33卷