全 文 ： 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (12): 1913−1919 · 1913 ·
转 NtPMT 和 HnH6H转变莨菪碱型颠茄为东莨菪碱型颠茄
权 红 1, 4, 夏 科 2, 曾俊岚 2, 陈 敏 3, 兰小中 4, 廖志华 2, 5*
(1. 西藏农牧学院高原生态研究所, 西藏 林芝 860000; 2. 西南大学生命科学学院, 重庆 400715;
3. 西南大学药学院, 重庆 400715; 4. 西藏农牧学院药用植物研究中心, 西藏 林芝 860000;
5. 西南大学−西藏农牧学院药用植物联合研发中心, 重庆 400715)
摘要: 颠茄 (Atropa belladonna) 是生产药用托品烷类生物碱 (tropane alkaloids, TAs) 的商业药用植物。颠茄
中莨菪碱含量远高于东莨菪碱, 其化学型属于莨菪碱型, 提高其东莨菪碱含量, 使其化学型转变为东莨菪碱型是
该产业追求的共同目标。本课题组在已经获得的 T0 代转 NtPMT 和 HnH6H 颠茄基础上, 采用自交法培育出 T1
代转基因颠茄并在西藏林芝进行了田间试验。在 T1代转基因颠茄中能同时特异性地扩增出 461 bp的 NtPMT和
1 077 bp的 HnH6H片段, 在野生型颠茄中则不能, 表明获得了阳性的 T1代转基因颠茄。RT-PCR表明 NtPMT和
HnH6H在转基因颠茄叶片有表达。HPLC检测莨菪碱和东莨菪碱结果表明: T1代转基因颠茄叶片和茎杆几乎没
有莨菪碱, 东莨菪碱是主要的生物碱; 野生型颠茄叶片和茎杆绝大多数为莨菪碱 (东莨菪碱含量极低)。T1 代转
基因颠茄叶片中东莨菪碱含量比野生型颠茄叶片提高了 15～36倍; T1代转基因颠茄茎杆中东莨菪碱含量比野生
型颠茄茎杆提高了 37～108倍。NtPMT和 HnH6H双基因过表达使得莨菪碱转化为价值更高的东莨菪碱, 大大提
高了颠茄药用和商业价值。
关键词: 颠茄; 东莨菪碱; 腐胺-N-甲基转运酶; 莨菪碱-6β-羟化酶; 代谢工程
中图分类号: R931 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2016) 12-1913-07
Overexpression of NtPMT and HnH6H changed hyoscyamine-rich
Atropa belladonna to scopolamine-rich varieties
QUAN Hong1, 4, XIA Ke2, ZENG Jun-lan2, CHEN Min3, LAN Xiao-zhong4, LIAO Zhi-hua2, 5*
(1. Institute of Plateau Ecology, Tibet Agricultural and Animal Husbandry College, Nyingchi 860000, China;
2. School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. College of Pharmaceutical Sciences, Southwest
University, Chongqing 400715, China; 4. Medicinal Plants Research Center, Tibet Agricultural and Animal Husbandry College,
Nyingchi 860000, China; 5. SWU-TAAHC Medicinal Plants Joint R&D Centre, Chongqing 400715, China)
Abstract: Atropa belladonna L. is the commercial plant material for production of tropane alkaloids,
including hyoscyamine and scopolamine. The wild-type Atropa belladonna is characterized by the hyoscyamine-
rich chemotype, in which the hyoscyamine content is much higher than the scopolamine content. It is the
common goal for the pharmaceutical industry to increase the content of scopolamine in A. belladonna. Based
on the T0 progeny of transgenic A. belladonna with NtPMT and HnH6H overexpression, T1 progeny of
transgenic A. belladonna were obtained through self-pollination and used in a field trial. The 461 bp fragment
of NtPMT and the 1 077 bp HnH6H were simultaneously expressed from T1 progeny of transgenic A. belladonna,
收稿日期: 2016-03-24; 修回日期: 2016-06-03.
基金项目: 国家“863”计划资助项目 (2011AA100605); 国家自然科学基金资助项目 (31370333); 教育部新世纪人才支持计划资助项目 (NCET-
12-0930); 西南大学中央高校基本科研业务费专项资助项目 (XDJK2013A024).
*通讯作者 Tel: 86-23-68367146, Fax: 86-23-68367637, E-mail: zhliao@swu.edu.cn
DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-0275
· 1914 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (12): 1913−1919
but were not obtained from the wild-type A. belladonna. At the transcription level, the expression of NtPMT
and HnH6H were detected in T1 progeny of transgenic A. belladonna, but were not detected in the wild-type
plants. Further, the alkaloids were analyzed by HPLC. In the stems and leaves of T1 progeny of transgenic
A. belladonna, hyoscyamine was not detected and scopolamine was detected at very high levels; in the stems
and leaves of wild-type A. belladonna, hyoscyamine was detected at much higher levels. In the leaves of
T1 progeny of transgenic A. belladonna, the content of scopolamine was 15−36 folds higher than that of wild-
type leaves; in the stems of T1 progeny of transgenic A. belladonna, the scopolamine content was 37−108 folds
higher than that of wild-type stems. In conclusion, overexpression of NtPMT and HnH6H greatly enhanced
conversion of hyoscyamine into high-value scopolamine and improved the commercial value of A. belladonna.
Key words: Atropa belladonna; scopolamine; putrescine-N-methyltransferase; hyoscyamine-6β-hydroxlase;
metabolic engineering
托品烷类生物碱 (tropane alkaloids, TAs) 包括
莨菪碱 (hyoscyamine)、山莨菪碱 (anisodamine)[1]和
东莨菪碱 (scopolamine)[2], 主要提取自茄科植物的
次生代谢产物, 如天仙子属 (Hyoscyamus)、曼陀罗属
(Datura)、颠茄属 (Atropa) 和莨菪属 (Scopolia) 等[3]。
莨菪碱和东莨菪碱在临床医学上常常作为抗胆碱药
物被广泛应用于副交感神经系统[4], 尤其是东莨菪碱,
是中枢麻醉药的主要成分[5], 其不良反应比莨菪碱小
且药效更强, 因而价格更高。全球市场对东莨菪碱的
需求量非常大, 仅在 2004年, 其销售额已达到 15亿
美元[6]。在大多数茄科植物中, 莨菪碱的含量远高于
东莨菪碱, 在过去的 10年中, 常采用脱毒、杂交育种、
射线诱变育种和多倍体育种等常规育种方法来提高
东莨菪碱含量, 但均没有取得显著性的成效。随着植
物生物技术不断发展, 利用代谢工程技术提高东莨菪
碱产量已成为最近 10年来该产业共同追求的目标。
颠茄 (Atropa belladonna) 是生产 TAs的商业药
用植物, 也是我国药典规定的 TAs 的药源植物[7], 但
野生型颠茄中东莨菪碱含量极低 , 仅为干重的
0.01%～0.08%[8], 而莨菪碱的含量远高于东莨菪碱
的含量, 其化学型属于莨菪碱型, 因此, 将颠茄从莨
菪碱型转变为东莨菪碱型能够大幅度提高其药用和
商业价值。在茄科植物中 TAs合成起始于鸟氨酸和精
氨酸的脱羧反应, 其代谢途径如图 1所示, 研究表明
腐胺-N-甲基转运酶 (putrescine-N-methyltransferase,
PMT; EC 2.1.1.53) 是合成途径中的第一个限速酶[9],
也是由初生代谢转向次生代谢的第一个关键酶, 催
化腐胺 (putrescine) 的甲基化生成 N-甲基腐胺 (N-
methylputrescine), 为 TAs 的合成提供前体物质。莨
菪碱-6β-羟化酶 (hyoscyamine-6β-hydroxlase, H6H;
EC 1.14.11.11) 是 TAs生物合成途径中最后一个限速
酶[10], 也是一个双功能酶, 具有羟基化和环氧化的
Figure 1 The biosynthetic pathway of tropane alkaloids in
Solanaceous species. ODC: Ornithine decarboxylase; ADC:
Arginine decarboxylase; PMT: Putrescine N-methyltransferase;
MPO: N-Methylputrescine oxidase; TRI: Tropinone reductase
I; TRII: Tropinone reductase II; CYP80F1: Littorine mutase/
monooxygenase; H6H: Hyoscyamine 6β-hydroxylase
作用, 通过催化莨菪碱的羟基化生成山莨菪碱, 而后
继续催化山莨菪碱的环化生成东莨菪碱。PMT 和
H6H 分别是 TAs 生物合成途径上的两个限速酶, 对
东莨菪碱含量的积累起着重要的作用[11, 12], 因此编码
PMT和 H6H的两个基因常被用于研究 TAs合成。本
研究是在获得的 T0代转 NtPMT和 HnH6H颠茄基础
权 红等: 转 NtPMT和 HnH6H转变莨菪碱型颠茄为东莨菪碱型颠茄 · 1915 ·
上, 采用自交法培育出 T1 代转基因颠茄并进行田间
试验, 通过 RT-PCR证明了 NtPMT和 HnH6H在转基
因颠茄叶片均有表达, 采用 HPLC分析了两种 TAs含
量, 结果表明过表达 NtPMT和 HnH6H后, T1代转基
因颠茄东莨菪碱含量远高于非转基因颠茄东莨菪碱
含量, 同时也发现 T1 代转基因颠茄东莨菪碱含量高
于 T0 代, 实现了莨菪碱型颠茄向东莨菪碱型颠茄的
转变, 从而大幅度地提高了颠茄的药用和商业价值。
材料与方法
材料 供试 T0 代转基因颠茄材料由西南大学
培育, 采用颠茄无菌苗叶片为外植体, 根癌农杆菌
LBA4404 转化, 卡那霉素筛选获得转基因材料, 在
转基因颠茄过表达烟草 PMT和天仙子 H6H基因, 该
工作已经报道[13]。T1 代转基因颠茄由西藏大学农牧
学院繁育。采用 T0 代组培苗, 炼苗存活后移栽到西
藏大学农牧学院药用植物园苗圃, 待其出现花蕾时,
用硫酸纸袋对花蕾套袋直到出现果实, 然后移除纸
袋, 对果实进行标记, 待果实完全成熟后采收即获得
T1 代种子。T1 代种子直接萌发成苗, PCR 检测, 获
得转基因阳性苗, 用于田间试验。T1 代颠茄苗在温
室长到 10 cm左右时, 移栽至田间, 9月初植物果实
完全成熟, 采集叶片和茎杆开展相关研究。对于分子
检测材料, 采集后立即置于液氮速冻, −80 ℃保存备
用; 对于生物碱含量分析材料, 采集后 40 ℃烘干至
恒重, 保存备用。
试剂 总 RNA提取试剂盒为 RNA Simple Total
RNA Kit (TIANGEN); RNA 反转录试剂盒为 Fast
Quant RT Kit (TIANGEN); Taq DNA 聚合酶 Trans
Taq® DNA Polymerase High Fidelity; 本研究所用引
物由上海英骏生物技术有限公司提供, 其他试剂均
为国产分析纯试剂。
T0 代转基因颠茄的获得 将含有 PXI (PXI 携
带有 NtPMT和 HnH6H, 分别由 35S启动子驱动) 的
LBA4404农杆菌转化颠茄叶盘, 通过含有 kanamycin
抗性的 MS分化培养基筛选出具有抗性的颠茄, PCR
鉴定后得到 T0代转基因颠茄[13]。
DNA 的提取及 PCR 的阳性鉴定 SDS 法[14]抽
提颠茄基因组 DNA, 经电泳检测合格后用于 PCR检
测, PCR检测均采用野生型颠茄的基因组 DNA作为
阴性对照, 携带 NtPMT和HnH6H的 PXI质粒作为阳
性对照。分别检测 NtPMT和 HnH6H, 引物序列见表
1。反应体系为: 2.5 μL 10 × PCR buffer、2.5 μL 2.5
mmol·L−1 dNTPs、10 μmol·L−1上下游引物各 0.5 μL、
0.25 μL Taq DNA polymers (5 U·μL−1)、DNA模板 1 μL,
ddH2O补至 25 μL。反应程序为 94 ℃预变性 10 min,
35个循环 (94 ℃变性 30 s, 适当温度退火 45 s, 72 ℃
延伸 45 s), 最后 72 ℃延伸 8 min。NtPMT的退火温度
为 56 ℃, HnH6H的退火温度为 55 ℃。
Table 1 Primers designed for PCR and RT-PCR detection
Primer name Primer sequences (5−3)
F-NtPMT GCCATTCCCATGAACGGCC
R-NtPMT CCTCCGCCGATGATCAAAACC
F-HnH6H GGATCCCAACGTATAGATTCTTC
R-HnH6H GGATCCCAAACCATCACTGCAAT
Fq-NtPMT GAACACCTCAACGGCTACC
Rq-NtPMT CATTGTCATGGCTGATTGTCC
Fq-HnH6H GCCCAGACCCAAGTTCAAC
Rq-HnH6H CAGCAATCCAGGTAGCATCC
Fq-18S CAGATACCGTCCTAGTCTCAAC
Rq-18S CAGCCTTGCGACCATACTC
RNA提取与 cDNA合成 取适量颠茄样品在液
氮中研磨, 按照 RNA Simple Total RNA Kit说明书提
取总 RNA, 用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完
整性, HITACHI U-3010 紫外可见分光光度计检测
RNA纯度和浓度。按照Fast Quant RT Kit (TIANGEN)
试剂盒说明书反转录获得第一链 cDNA。
RT-PCR检测外源基因的表达情况 取 1 μL反
转录获得的第一条 cDNA链为模板, 分别检测 NtPMT
和 HnH6H 表达情况, 以 18S 作为内参基因, 引物序
列见表 1, 反应体系为: 2.5 μL 10 × PCR buffer、2.5 μL
2.5 mmol·L−1 dNTPs、10 μmol·L−1上下游引物各 0.5
μL、0.25 μL Taq DNA polymers (5 U·μL−1)、cDNA模
板 1 μL, ddH2O补至 25 μL。反应程序为 94 ℃预变性
10 min, 94 ℃变性 30 s, 适当温度退火 30 s, 72 ℃延
伸 20 s, 最后 72 ℃延伸 5 min。NtPMT的退火温度为
58.6 ℃, 循环数为 35; HnH6H的退火温度为 58.2 ℃,
循环数为 35; 18S的退火温度为 57 ℃, 循环数为 35。
生物碱的提取及 HPLC 检测 颠茄叶片和茎杆
40 ℃烘干至恒重, 研磨成粉, 然后参照文献[15]发表
的方法提取TAs用于HPLC检测。标准品均购自Sigma
公司。HPLC检测使用岛津 LC-60A高效液相色谱仪
(泵: LC-6AD、柱温箱: CTO-10ASvp、控制器: SPD-
20A), 色谱柱为 Phenomenex Gemini 5 μ C18 110A
液相色谱柱 (250 mm × 4.6 mm), 流动相为甲醇−
0.05 mol·L−1 pH 4.6醋酸胺缓冲液 (流动相体系包含
0.002 5 mol·L−1 SDS) (58∶42), 流速 1 mL·min−1, 柱
温箱 40 ℃, 检测波长 226 nm, 进样量 20 μL。
· 1916 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (12): 1913−1919
结果与讨论
1 T1代转基因颠茄种子萌发与田间种植
将 T0 代自交法获得的 D9 系列转基因种子 (T1
代) 播入装有营养土的花钵中, 温室萌发, 温度 25 ℃,
光照 16 h。待植株长至 10 cm左右 (图 2A), 可将其
移栽至田间种植。转基因颠茄 T1代和野生型颠茄在
可见表型上没有明显区别, 这与本课题组在 T0 代转
基因颠茄和野生型颠茄上观察的结果一致[13]。果实
成熟期后, 可对地上部分材料进行分析 (图 2B)。
Figure 2 T1 progeny of A. belladonna (transgenic and non-
transgenic). A: The seedlings of A. belladonna in the pots. B:
The plants of A. belladonna in the field (Nyingchi, Tibet)
2 T1代转基因颠茄 PCR鉴定和 RT-PCR分析
通过提取 T1代转基因颠茄基因组DNA, 然后利
用基因组 DNA作为模板, 通过 PCR检测转基因植株
中 NtPMT和 HnH6H的转入情况 (图 3A), D9系列转
基因颠茄均能检测到 462 bp的 NtPMT和 1 044 bp的
HnH6H 片段, 而野生型颠茄却检测不到这两个基因,
说明所用于分析的颠茄材料是转基因阳性植株, T1
代转基因颠茄 PCR检测结果与T0代转基因颠茄 PCR
检测结果一致[13]; 通过 RT-PCR分别分析野生型颠茄
和 T1 代转基因颠茄 NtPMT 和 HnH6H 表达情况,
以 18S作为内参 (图 3B), 18S在野生型颠茄和转基因
颠茄中均有表达, 而 NtPMT和HnH6H仅在转基因颠
茄中有表达, 说明所用于分析的转基因颠茄材料是
NtPMT和 HnH6H过表达颠茄, 因此这些材料可用于
分析转基因颠茄 TAs的含量。
3 T1代转基因颠茄 TAs的含量分析
本研究采用 HPLC 分别分析野生型颠茄和转基
因颠茄叶片和茎杆中 TAs 的含量。东莨菪碱和莨菪
碱标准品的保留时间分别为 7.41 min 和 13.46 min
(图 4A), 野生型颠茄样品 (叶片) 和转基因颠茄样品
(叶片) 的东莨菪碱和莨菪碱保留时间基本与标准品
保留时间一致 (图 4B、图 4C)。
在野生型颠茄样品中, 叶片和茎杆均能检测到
莨菪碱 (图 5A), 而在转基因颠茄叶片中只有 D9-3、
D9-6、D9-8 能检测到极微量的莨菪碱, 其他转基因
株系 (叶片和茎杆) 却检测不到, 野生型颠茄叶片富
含高浓度的莨菪碱, 其在叶片中的含量很高 (5.53～
Figure 4 The HPLC trace of TAs. A: Authentic samples of
scopolamine and hyoscyamine (retention time: 7.41 min for sco-
polamine and 13.46 min for hyoscyamine); B: Scopolamine and
hyoscyamine analysis of wild-type lines (leaf); C: Scopolamine
and hyoscyamine analysis of T1 progeny transgenic lines (leaf).
1: Scopolamine; 2: Hyoscyamine
Figure 3 Detection of the transgenes, NtPMT and HnH6H, through PCR and RT-PCR. A: PCR detection of the two transgenic
genes, NtPMT and HnH6H; B: Detecting the expression of the two transgenes, NtPMT and HnH6H, using RT-PCR; M: DNA marker;
PC: Positive control; WT: Wild-type; D9: T1 progeny of transgenic A. belladonna D9 line
权 红等: 转 NtPMT和 HnH6H转变莨菪碱型颠茄为东莨菪碱型颠茄 · 1917 ·
6.06 mg·g−1), 属于典型的莨菪碱型茄科植物, 检测
的结果与已知报道结果相一致[13], 茎杆中莨菪碱含
量很低 (0.66～0.86 mg·g−1), 约为叶片莨菪碱含量的
11%～16%。
在野生型颠茄和转基因颠茄样品中, 叶片和茎杆
中均能检测到东莨菪碱 (图5B), 东莨菪碱在野生型颠
茄叶片中的含量极低 (0.25～0.30 mg·g−1), 而转基因
颠茄叶片东莨菪碱的含量很高 (4.68～9.09 mg·g−1),
约为野生型颠茄叶片东莨菪碱含量的 15～36 倍, 而
转基因颠茄茎杆东莨菪碱的含量 (1.03～2.59 mg·g−1)
约为野生型颠茄茎杆东莨菪碱含量的 37～108倍, 同
时转基因颠茄叶片东莨菪碱含量高于茎杆东莨菪碱
含量; 在野生型颠茄叶片和茎杆中主要以莨菪碱为主,
叶片中莨菪碱与东莨菪碱的比值约为 22∶1～30∶1,
茎杆中莨菪碱与东莨菪碱的比值约为 17∶1～33∶1,
而转基因颠茄叶片和茎杆中主要以东莨菪碱为主 ,
叶片中莨菪碱与东莨菪碱的比值约为 1∶115～1∶340,
茎杆中莨菪碱检测不到, 莨菪碱和东莨菪碱在野生
型和转基因型颠茄地上部分所占的比重发生了逆转。
讨论
颠茄中的莨菪碱和东莨菪碱是 TAs 中极为重要
的两种生物碱, 由于其显著的临床药用价值和巨大
Figure 5 The contents of scopolamine and hyoscyamine in
leaves and stems of A. belladonna T1 progeny. WT: Wild-type
(as control); D9: T1 progeny of transgenic A. belladonna D9 line
市场需求, 一直以来都是植物次生代谢领域研究的
方向之一。随着代谢工程技术的不断发展, 对 TAs的
合成途径的研究逐步清晰, 这得益于对烟草、曼陀罗
和莨菪等模式植物的研究, 而对于该代谢途径上两
个关键酶基因 (PMT 和 H6H), 分别在生化和转基因
方面得到了深入的研究和验证。不同物种对 PMT活
性的调控有所差异, 在 H. niger 发根中过表达 NtPMT
后, 虽然 PMT 的直接产物 N-甲基腐胺提高了 4～5
倍, 但是下游的莨菪碱和东莨菪碱却没有显著性变
化[15], 说明在 H. niger中 PMT具有很高的 N-甲基腐
胺合成能力, 然而对于莨菪碱向东莨菪碱转化的能
力是有限的; 在 D. metel 发根中过表达 NtPMT 后,
同样地, 虽然 N-甲基腐胺提高了 2～4 倍, 但是莨菪
碱和东莨菪碱以及另一条支路上的尼古丁含量却没
有显著性变化[16]; 而 Sato 等[17]在 A. belladonna 和
Nicotiana sylvestris过表达NtPMT后, 却得到了相反的
结果, 过表达NtPMT的颠茄莨菪碱和东莨菪碱的含量
没有显著性变化, 但是过表达 NtPMT 的 N. sylvestris
却提高了尼古丁含量, 说明虽然脱品烷生物碱和尼
古丁的合成共用上游的一个途径, 但是当下游途径
不同以及物种不同时对 PMT 的调控是有差别的 ;
Moyano等[18]在 Datura metel和 Hyoscyamus muticus
发根中超表达了 NtPMT 后, 莨菪碱和东莨菪碱的积
累都得到了显著的提高, 这是首次单转 PMT 后提高
TAs含量的成功例子; Suzuki等[19]的研究表明, PMT
主要在中柱鞘中表达, 是一个组织特异性表达基因,
而在 35S 启动子的驱动下, 通过改变 PMT 的表达调
控模式而不是通过提高 PMT 的活性来提高 TAs 的
含量, 从而说明了 TAs 的合成是一个非常复杂的调
控, 而这个调控会因物种的不同而有很大的差异。与
PMT 作用不同, H6H 催化莨菪碱向东莨菪碱的代谢
流动, H6H 的表达量与东莨菪碱生物合成量呈正相
关性[20], 在多种 TAs植物中过表达 H6H 后都无一例
外地提高了东莨菪碱的产量, 目前已有 10 多个物种
的 H6H 被克隆并报道。1992 年 Yun 等[21]在颠茄中
过表达 HnH6H 后, 与野生型颠茄相比, 地上部分莨
菪碱含量大幅度下降, 而东莨菪碱含量大幅度提高;
而后又有在 D. innoxia[22]和 A. baetica[23]发根中过表
达 HnH6H的报道, 东莨菪碱含量提高了 3和 9倍之
多。从上面几个例子可以看出, 相比较于其他物种的
H6H, HnH6H 是被研究的比较透彻的一个酶且活性
相对比较高[24], 因而 HnH6H常作为研究 TAs代谢途
径的候选基因。
多个限速酶控制的代谢途径, 一个限速酶量的
· 1918 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (12): 1913−1919
增加会限制后续的反应, 因而终产物提高的量不明
显, 大多数单转 PMT 所取得的效果可以例证这个观
点, 因而可以考虑采用多个关键酶的协同作用。PMT
和 H6H 是 TAs 合成途径上两个关键酶, 控制着 TAs
的代谢流程, 近 10 年来, 通过共表达 TAs 合成途径
上 PMT和 H6H两个关键酶的基因, 对提高东莨菪碱
产量取得了显著成效。2004年, Zhang等[25]在天仙子
发根中共表达 NtPMT和 HnH6H, 这两个基因的协同
作用使得东莨菪碱含量得到极大提高; 随后, 在颠茄
发根中共表达这两个基因, 东莨菪碱含量也有所提
高[26]; 2013 年, 本研究组在颠茄发根中共表达内源
PMT和 H6H[8], 4个转基因发根系东莨菪含量都有提
高, 最优提高了 8.2倍; 2011年本研究组首次获得共
表达 NtPMT和 HnH6H的 T0代颠茄植株[13], 并对获
得的 5 个转基因株系进行基因表达和东莨菪碱含量
分析, 其结果显示在 5 个转基因株系中, D9 系列的
HnH6H 表达量最高, 其东莨菪碱含量提高倍数最大,
是野生型颠茄的 7.3倍。
本文在已经获得的 T0 代东莨菪碱含量最高的
D9转基因株系的基础上, 采用自交法培育出 T1代转
基因颠茄, 同时选择在高海拔、高紫外辐射和干旱的
西藏林芝地区进行了田间试验, 并分析 NtPMT 和
HnH6H 在 T1 代转基因颠茄叶片中的表达情况及地
上部分莨菪碱和东莨菪碱的含量, 通过与 T0 代比
较, T1代转基因颠茄叶片提高东莨菪碱的倍数更高。
在茄科植物中, 生物碱的合成及储存是在植物的不
同部位进行, 生物碱主要是在须根中合成, 通过一系
列的转运蛋白运输后, 最终储存在植物叶片的液泡
中[27], 因而叶片中生物碱含量高于其他部位, 这与
Yun 等[21]在颠茄中过表达 HnH6H 所报道的结果一
致。对 AbH6H的酶活分析可知[24], 相比较于 HnH6H,
AbH6H的环氧化活性极低, 因而对于颠茄来说, H6H
的环氧化活性是 TAs 合成的限速步骤, 从而导致野生
型颠茄地上部分东莨菪碱的含量极低, 但是对于东
莨菪型的物种来说, 如天仙子, 其HnH6H的高环氧化
活性就不影响东莨菪碱的合成[28], 而共表达 NtPMT
和 HnH6H 后, 使得颠茄的环氧化活性得到加强, 打
通了下游限速瓶颈, 促使莨菪碱向东莨菪碱的转化,
同时在 NtPMT的作用下, 使得 TAs的前体物 N-甲基
腐胺不断地流向下游, 改变了颠茄本身的 TAs 合成调
控模式。利用植物代谢工程的方法来提高颠茄东莨菪
碱的含量, 实现了颠茄从莨菪碱型向东莨菪碱型的
转变, 这是用传统的方法所不能达到的效果, 因此,
可以通过选育出高产东莨菪碱的 T1代转基因颠茄进
行培育, 将有可能实现用高产东莨菪碱颠茄来代替
化学型为东莨菪碱的茄科植物如天仙子和洋金花。
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