全 文 ：颠茄 PMT·TR-I和 H6H基因植物高效表达载体的构建
成 瑜1，杨春贤1，王贵君1，李郑娜1，杨颖舫1，冯国庆1，陈 敏2，廖志华1*
(1.西南大学生命科学学院，重庆 400715;2.西南大学药学院，重庆 400715)
摘要 ［目的］构建 1，4-丁二胺 －氮 －甲基转移酶(Putrescine N-methyltransferase，PMT)基因、托品酮还原酶-I(Tropinone reductase-I，TR-
I)基因和莨菪碱 6-β-羟化酶(Hyoscyamine 6β-Hydroxylase，H6H)基因的植物高效表达载体。［方法］采用 RT-PCR方法从颠茄中克隆到
PMT、TR-I和 H6H基因编码区序列，并连接到植物表达载体 pCAMBIA1304 +(p1304 +)中。［结果］成功构建了植物高效表达载体
p1304 + -PMT、p1304 + -TR-I、p1304 + -H6H、p1304 + -PMT-H6H、p1304 + -TR-I-PMT和 p1304 + -TR-I-H6H，并转化农杆菌，获得可直接用于遗传
改良颠茄的工程菌。［结论］该研究为利用植物基因工程技术提高东莨菪碱的产量奠定了基础。
关键词 东莨菪碱;颠茄;1，4-丁二胺-氮-甲基转移酶;托品酮还原酶-I;莨菪碱 6-β-羟化酶;载体构建
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2010)14 －07211 －03
Construction of Plant Expression Vectors of PMT，TR-I and H6H
CHENG Yu et al (School of Life Sciences，Southwest University，Chongqing 400715)
Abstract ［Objective］To constrct the plant expression vectors of putrescine N-methyltransferase(PMT)，tropinone reductase-I(TR-I)and hyo-
scyamine 6β-hydroxylase (H6H).［Method］The coding sequences of PMT，TR-I and H6H were obtained by the method of RT-PCR and ligated to
the plant expression vector pCAMBIA1304 +(p1304 +). ［Result］The expression vectors p1304 + -PMT，p1304 + -TR-I，p1304 + -H6H，p1304 + -
PMT-H6H，p1304 + -TR-I-PMT and p1304 + -TR-I-H6H were constructed and transferred to Agrobacterium successfully. Engineered bacteria were
obtained that can meliorate Atropa belladonna L. . ［Conclusion］It establishes the base of improving production of scopolamine by genetic engi-
neering technology.
Key words Scopolamine;Atropa belladonna L.;Putrescine N-methyltransferase;Tropinone reductase-I;Hyoscyamine 6β-Hydroxylase;Vector
construction
基金项目 重庆市自然科学基金计划项目。
作者简介 成瑜(1983 － )，女，山西霍州人，硕士研究生，研究方向:植
物次生代谢产物。* 通讯作者，教授，硕士生导师，E-mail:
zhliao@ swu. edu. cn。
收稿日期 2010-03-29
颠茄(Atropa belladonna L.)为茄科(Solanaceae)颠茄属
(Atropa)多年生草本植物，原产于亚洲西部和欧洲中、南部，
我国主产地为山东、湖北和新疆等地。颠茄各部位均富含生
物碱，主要为莨菪碱(Hyoscyamine，C17 H23 O3N)和东莨菪碱
(Scopolamine，C17H21 O4N)。东莨菪碱是一种莨菪烷类生物
碱(Tropane alkaloids，TA)，在临床上应用广泛。初期用于麻
醉前给药、抗晕动药、治疗帕金森症和改善微循环等［1］。随
着对东莨菪碱药理作用的研究深入，其已逐渐广泛用于戒毒
脱瘾和治疗农药中毒等。随着东莨菪碱新功能的不断开发，
奈莨菪碱的需求迅速增长。目前，东莨菪碱都是从天然植物
中提取，而颠茄是其最主要的商业栽培药源。但是天然的颠
茄中托品烷类生物碱的含量很低［2］，而且东莨菪碱的含量比
莨菪碱的含量要低得多。
随着对 TA代谢途径的深入研究和基因克隆及高效遗传
转化系统的发展［3 －11］，利用遗传代谢工程手段在植物细胞中
大量生产高附加值的次生代谢产物早已成为研究热点。颠
茄次生代谢工程的主要目的是提高代谢流向 TA流动以及将
莨菪碱转变为更有价值的东莨菪碱。为此，笔者构建颠茄
PMT、TR-I和 H6H基因的高效植物表达载体，以期为通过遗
传转化的方法提高颠茄中东莨菪碱的产量奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 研究对象。颠茄，采自陕西安康，栽培于西南大学生
命科学学院植物园，常规培养。
1. 1. 2 菌株。大肠杆菌 DH5α 感受态细胞、发根农杆菌
C58C1、根癌农杆菌 LBA4404 和质粒 pCAMBIA1304 +均由西
南大学生命科学学院天然产物与代谢工程实验室保存。
1. 1. 3 主要试剂。植物组织 RNA提取试剂盒，由上海华舜
生物工程有限公司生产;RT-PCR试剂盒，由 TaKaRa 公司生
产;胶回收(小量)试剂盒，由天根生化科技(北京)有限公司
生产;质粒提取(小量)试剂盒，由上海华舜生物工程有限公
司生产;DNA Ligation 试剂盒，由 TaKaRa公司生产;pMD19-T
Vector试剂盒，由 TaKaPa 公司生产;DNA PCR 试剂盒，由
TaKaRa公司生产;DNA分子量标准 DL2000、荧光染料 Gold-
view，均由上海生工生物工程技术服务有限公司生产;氨苄青
霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福霉素(Rif)和链霉素(Str)
均由北京鼎国生物技术有限公司生产。
1. 2 方法
1. 2. 1 目的基因编码区的克隆。以颠茄幼苗为材料，用
RNA提取试剂盒提取总 RNA，RT-PCR 反转录成 cDNA，以
cDNA为模版，进行 PCR扩增。根据已报道的颠茄 PMT(登
录号:AB018570)、H6H(登录号:AB017153)和西南大学生命
科学学院天然产物与代谢工程实验室成员克隆的 TR-I编码
区序列，分别设计 3个目的基因的特异性引物，其中 PMT和
H6H因为试验需要所设计的酶切位点不同，均有 2 对引物，
TR-I只有 1对引物(表 1)。
以 TR-I基因为例，目的基因编码区的 PCR扩增体系为:
反转录产物 1. 0 μl，10 × PCR反应缓冲液 5. 0 μl，25 mmol /L
MgCl2 3. 0 μl，200 μmol /L dNTPs 1. 0 μl，2. 5 U Taq DNA聚合
酶 0. 5 μl，引物各 1. 0 μl，最后用灭菌双蒸水补足为 50 μl。
PCR扩增程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 45 s，56 ℃退
火 45 s，72 ℃延伸 1 min，28 个循环;72 ℃延伸 8 min。PCR
产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，回收目标产物;纯化后与
pMD 19-T载体连接，转化 DH5α感受态细胞;，挑选阳性白色
菌落单克隆测序，并在 LB + 100 mg /L Amp液体培养基中振
荡扩大培养。利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，经 Bgl II
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci. 2010，38(14):7211 － 7213 责任编辑 姜丽 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.14.081
和 BstE II双酶切、PCR检测验证及测序确认序列后，将获得
的重组质粒命名为 T-easy + TR-I。
用同样的方法可以获得 T-easy + PMT(Bgl II /Bst EII);
T-easy + PMT(Sma I /Sca I)、T-easy + H6H(Xba I / Sac I)和
T-easy +H6H(Sma I /Sca I)重组质粒。
表 1 PMT、TR-I和 H6H基因编码区克隆引物
Table 1 The clone primers of ORF of PMT，TR-I and H6H genes
引物名称
Name of
primers
引物序列(5′-3′)
Primer sequence
酶切位点
Restriction
enzyme sites
f-PMT-1 GAAGATCTATGGAGGTCAACCACAACAATG Bg lII
r-PMT-1 GGGTGACCTCAAAACTCAACCAAATCCCTC Bst EII
f-PMT-2 ACCCGGGATGGAGGTCAACCACAACAATG Sma I
r-PMT-2 GCGAGCTCTCAAAACTCAACCAAATCCCTC Sca I
f-TR-I GAAGATCTATGGAAGAATCAAAAGATAACA Bg lII
r-TR-I GGGTGACCTAAAATCCACCATTAGCAGTG Bst EII
f-H6H-1 GCTCTAGAATGGCTACTCTTGTCTCAA XbaⅠ
r-H6H-1 GCGAGCTCTTAGGCATTAATTTTATATGGC SacⅠ
f-H6H-2 ACCCGGGATGGCTACTCTTGTCTCAA SmaⅠ
r-H6H-2 GCGAGCTCTTAGGCATTAATTTTATATGGC SacⅠ
注:划线部分为酶切位点。
Note:The underlined parts are the restriction enzyme sites.
1. 2. 2 PMT、TR-I 和 H6H 基因植物高效表达载体的构建。
植物表达载体 pCAMBIA1304 + 是选用 pBI121 和 pCAM-
BIA1304为基本元件，由廖志华教授构建的［12］。构建流程
为:Hin dIII 和 Eco RI 双酶切 pBI121 和 p1304;回收 pBI121
表达试剂盒和 p1304大片段;将二者连接后转化 DH5α，在含
50 mg /L Kan的 LB平板上筛选得到单克隆，摇菌扩大培养，
抽提质粒;Hin dIII和 Eco RI双酶切验证是否获得表达载体
p1304 +。
1. 2. 2. 1 一元表达载体的构建。以 PMT为例，用 Bgl II 和
Bst EII双酶切重组质粒 T-easy + PMT(Bgl II /Bst EII)和表达
载体 p1304 +，回收 T-easy + PMT(Bgl II /Bst EII)的小片段和
p1304 +大片段。将回收产物用DNA Ligation Kit 16 ℃连接过
夜，转化 DH5α，在 LB +50 mg /L Kan 固体平板上筛选阳性克
隆，在 LB +50 mg /L Kan液体培养基中扩大培养，抽提质粒，
PCR检测，分别用 Bgl II和 Bst EII双酶切验证是否获得重组
质粒 p1304 + + PMT。
使用同样的方法，分别用 Bgl II和 Bst EII双酶切 T-easy
+ TR-I和 p1304 +，用 XbaⅠ和 Sac I 双酶切 T-easy + H6H 和
p1304 +，并验证是否获得重组质粒 p1304 + + TR-I 和 p1304 +
+H6H。
1. 2. 2. 2 双元表达载体的构建。以 TR-I 和 PMT基因构建
双元表达载体为例，用 Sma I和 Sca I 双酶切重组质粒 T-easy
+ PMT (Sma I /Sac I)和 p1304 + + TR-I，回收 T-easy + PMT
(Sma I /Sac I)的小片段和 p1304 + + TR-I大片段。将回收产
物用 DNA Ligation Kit 16 ℃连接过夜，转化 DH5α，在 LB +50
mg /L Kan固体平板上筛选阳性克隆，然后在 LB + 50 mg /L
Kan液体培养基中扩大培养，抽提质粒，PCR 检测，分别用
Sma I和 Sca I双酶切验证是否获得双元表达载体 p1304 + +
TR-I + PMT。
用同样的方法，以 p1304 + + TR-I和 p1304 + + PMT为大
骨架，分别用 Xba I和 Sac I双酶切 p1304 + + TR-I和 T-easy +
H6H (XbaⅠ/ Sac I)，分别用 Sma I和 Sca I双酶切 p1304 + +
PMT 和 T-easy + H6H(Sma I /Sca I)，并验证是否获得
p1304 + + TR-I + H6H 和 p1304 + + PMT + H6H 双元表达
载体。
1. 2. 3 农杆菌工程菌的获得。用 p1304 + + PMT、p1304 + +
TR-I、p1304 + + H6H、p1304 + + TR-I + PMT、p1304 + + TR-I +
H6H和 p1304 + + PMT +H6H分别转化根癌农杆菌 LBA4404
和发根农杆菌 C58C1 感受态细胞，前者涂布在 YEP 平板
(YEP +50 mg /L Kan + 40 mg /L Rif + 25 mg /L Str)上，后者
涂布在 YEB平板(YEB +50 mg /L Kan +40 mg /L Rif)上。挑
取单菌落分别进行 PCR 检测，验证是否获得工程菌
LBA4404 /C58C1 + p1304 + + PMT、LBA4404 /C58C1 + p1304 +
+ TR-I、LBA4404 /C58C1 + p1304 + + H6H、LBA4404 /C58C1 +
p1304 + + TR-I + PMT、LBA4404 /C58C1 + p1304 + + TR-I +
H6H和 LBA4404 /C58C1 + p1304 + + PMT +H6H。
2 结果与分析
2. 1 目的基因编码区克隆结果 通过 PCR扩增得到长度分
别为 1 012、823、1 200 bp的 PMT、TR-I和 H6H基因的编码区
序列。
2. 2 PMT、H6H 和 TR-I 基因植物高效表达载体的构建结
果 TR-I基因编码区内部没有 Bgl II 和 Bst EII 酶切位点，
PMT基因编码区内部没有 Bgl II、Bst EII、Sma I和 Sca I酶切
位点，H6H基因编码区内部没有 Xba I、Sac I和 Sma I酶切位
点，故构建植物高效表达载体所用的酶切位点均可行。
2. 2. 1 一元表达载体的构建结果。以 p1304 + + PMT 表达
载体的构建为例:回收 PMT(Bgl II /Bst EII)、PMT(Sma I /Sac
I)和 TR-I(Bgl II /Bst EII)基因的 PCR产物后与 pMD19-T载
体连接，转化 DH5α，PCR鉴定和双酶切验证表明得到 T-easy
+ PMT(Bgl II /Bst EII)、T-easy + PMT(Sma I /Sac I)和 T-easy
+ TR-I(Bgl II /Bst EII)。用 Bgl II和 Bst EII双酶切 T-easy +
PMT(Bgl II /Bst EII)和 p1304 +，分别回收目的条带，然后连
接。p1304 +、T-easy + PMT(Bgl II /Bst EII)和 p1304 + + PMT
质粒均用 Bgl II和 Bst EII双酶切，结果 p1304 +质粒除大骨
架之外还有 1 个小片段，T-easy + PMT(Bgl II /Bst EII)和
p1304 + + PMT质粒均在 1 000 bp上方有 1条特异性条带，断
定即为 PMT编码区条带，表明 p1304 + + PMT一元表达载体
构建成功(图 1)。
同理可得到 p1304 + + H6H 和 p1304 + + TR-I 一元表达
载体。
2. 2. 2 双元表达载体的构建结果。以 p1304 + + RT-T + PMT
表达载体的构建为例:用 Sma I和 Sca I 双酶切重组质粒 T-
easy + PMT (Sma I / Sac I)和 p1304 + + TR-I，回收目的条带，
连接。PCR鉴定和双酶切验证表明，p1304 + + TR-I、T-easy +
PMT (Sma I / Sac I)和 p1304 + + TR-I + PMT质粒均用 Sma I
和 Sac I双酶切，结果 p1304 + + TR-I质粒除大骨架之外还有
1个小片段，T-easy + PMT (Sma I /Sac I)和 p1304 + + TR-I +
PMT质粒均在 1 000 bp 上方有 1 条特异性条带，断定即为
PMT编码区条带，表明 p1304 + + TR-I + PMT 双元表达载体
构建成功(图 2)。
2127 安徽农业科学 2010 年
注:1 为 λ-Hin dⅢ Marker;2 为 p1304 +质粒;3 为 T-easy + PMT
(Bgl II /Bst EII)质粒;4为 p1304 + + PMT质粒;5为 DL2000
Marker。
Note:1，λ-Hin dⅢ Marker;2，p1304 + + TR-I plasmid;3，T-easy +
PMT (Sma I / Sac I)plasmid;4，p1304 + + TR-I + PMT plas-
mid;5，DL2000 Marker.
图 1 p1304 +、T-easy + PMT(Bgl II /Bst EII)和 p1304 + + PMT
质粒酶切验证
Fig. 1 Digestion of p1304 +，T-easy +PMT(Bgl II /Bst EII)and
p1304 + +PMT plasmids
注:1为 λ-Hin dⅢ Marker;2 为 p1304 + + TR-I 质粒;3 为 T-easy
+ PMT(Sma I /Sac I)质粒;4为 p1304 + + TR-I + PMT质粒;
5为 DL2000 Marker。
Note:1，λ-Hin dⅢ Marker;2，p1304 + + TR-I plasmid;3，T-easy +
PMT (Sma I / Sac I)plasmid;4，p1304 + + TR-I + PMT plas-
mid;5，DL2000 Marker.
图 2 p1304 + +TR-I、T-easy +PMT (Sma I / Sac I)和 p1304 + +
TR-I +PMT质粒酶切验证
Fig. 2 The Digestion of p1304 + + TR-I，T-easy + PMT (SmaI /
SacI)and p1304 + +TR-I +PMT plasmids
同理可得 p1304 + + TR-I +H6H和 p1304 + + PMT + H6H
双元表达载体。
2. 3 农杆菌工程菌的获得情况 以 C58C1 + p1304 + + H6H
为例，用冻溶法将 p1304 + + H6H 重组质粒转化入农杆菌
C58C1菌株感受态细胞中，涂布在含 50 mg /L Kan 和 40
mg /L Rif的 YEB平板上，28 ℃倒置培养 48 h，在转化平板上
挑取单菌落，因为 p1304 +上存在潮霉素、rol B和 rol C抗性
标记基因，对单菌落进行 HYGR、rol B和 rol C的 PCR检测。
由图 3可知，单菌落均为阳性，证明成功获得工程菌 C58C1
+ p1304 + +H6H。
注:1为 DL2000 Marker;2为阳性对照;3为阴性对照;4 ～ 8 为菌
检单克隆。
Note:1，DL2000 Marker;2，Negative control;3，Positive control;4 －
8，Bacteria monoclones.
图 3 C58C1 + p1304 + + H6H 单克隆 HYGR、rol B 和 rol C 的
PCR检测
Fig. 3 The HYGR，rol B and rol C PCR detection of C58C1 +
p1304 + +H6H ′s monoclones
3 结论与讨论
该研究成功构建了植物高效表达载体 p1304 + -PMT、
p1304 + -TR-I、p1304 + -H6H、p1304 + -PMT-H6H、p1304 + -TR-I-
PMT和 p1304 + -TR-I-H6H，并转化农杆菌，获得可直接用于
遗传改良颠茄的工程菌。在东莨菪碱的生物合成途径上，
PMT、TR-I和 H6H起着重要的作用。因此，这 3 个基因植物
表达载体的成功构建及工程菌的获得，为通过遗传转化的方
法提高颠茄中东莨菪碱的产量奠定了基础。
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