全 文 ：中国农业科学 1 991 , 2 4 ( 6 ) : 1 一 10
S e i e n t i a A g r i e ul t u r a S i n i e a
普通小麦与沙生冰草 、 根茎冰草属间
杂种的产生及其细胞遗传学研究 *
李立会
(中国农业科学院作物品种资源研究所 , 北京 1 0 0 08 1)
提要 通过幼胚 拯救 , 首次获得 了普通小麦与沙生冰草、 根茎冰草两 组合 的属间杂种 。
在幼胚拯救时发现 , 无盾片的幼胚是不 能产生 杂种苗的。 对获得 的两组合杂种植株进行 了
壮苗和破莫培养繁苗 , 使来 自同一 胚 的杂种植株 数目增加 。 在获得的 F 杂种中 , 幼苗形态
和穗型似 普通小麦栽培种 。 在花粉母 细胞减数分 裂中期 工 , 中国春大 沙生冰草、 根茎冰草
两组合 杂种 F {的染色体配对频率远 远超出了期望值 。 对杂种 F !用 四倍 体和六倍体小麦回交 ,
都能很 容易获得种子 , 平均结实率都在15 % 以上 。 特别值得 注意的是两 组合 的属间杂种 均
具有自交可育性 , 自交结实率分 别为0 . 4 6% 和。 . 15 % 。 文章讨论了 : 1 . 杂交成功的经验 ;
2
.
P与 A 、 B 、 D 染色体组间特殊遗传关系的理 论分析 3 . F l 自交结实的原因 4 .
壮苗培养和 破粟培养繁苗在小麦远 缘杂交中的重要作用。 小麦属 与冰草属 问 自交和 回交后
代的首次获得 , 在理论 上对前人所认为的 P 杂色体 组在小麦族中的高度独立 遗传性 , 提供
了直接 的相反证据 ; 在实践上 , 使产生异源 附加 系 、 代换系甚至易位系 , 进而为利用 P 染
色体 组中的期望基因变得相对的容易。
关键词 普通小 麦 ; 沙生冰草 ; 根 茎冰草; 属间杂种 ; 胚 培养 ; 无性繁苗 ; 染色体 配
对 ; 自交可育性
冰草属 ( A 召ro 了D ro ” G a er tl . ) 在文献中的概念往往模糊不 清 。 过去 常把 小 麦族
(知 itc ea e Duln or t . ) 中每穗轴节上一个小穗的种统归为冰草属 , 或鹅观草属 ( R o ge ne
彻 C . K o c h . ) 今 ’。 · ’ 7〕 现在多数植物分类学家的观点是只把含有P 染色体组的冠状 冰草
复合群 ( e r e s t e d w h e a t盯 a s s e ( )m p l e x )称为冰草属 一 2 、 3 、 b 、 ’ 3, ’ 5 , 23〕。 它包括冰草 [入 . e汀 -
s 故ut m (L
.
) G a e r t n
. 〕 、 沙生冰草 [A . 威筑 rt0 川 , ( F i s e h
.
) S
e h u l t
.
]
、 根茎冰草 ( A .
, 比h肋 i R os he v . )、 西伯利亚冰草 〔A , 力视9 2云 ( R ot h . ) C a n d . 」、 沙芦草 ( A . 观o 刀召口 -
l ic “ 阴 K e飞 ) 等约1 0个种 。
冰草属植物均有很高的饲用价值 。 同时 , 它们也有很强的抗旱 、 抗寒性能和适度的
耐盐性 : “ , ’ ` 〕。 经初步鉴定 , 有些材料对小麦病害的抗性表现突出 ’ 」。
至于小麦属与冰草属间的杂交 , 在本世纪30 年代后期 , W ll iet 洲 和 S m it h `比尝试过 ,
均未取得成功 ; 即使采用近来先进的杂交技术 , 也未奏效 〔 “ : ; 直到 1 98 9年 , C ll e n 等〔 “ 〕才
报道了普通 小麦与四倍体冰草间杂种 F l的产生 , 但尚未见其有获得F I代以上材料的报道 。
本文 于 19 9 1年 1月 12日收到 。
· 这项研 究得到 了童玉深研究员的悉心 指导 . 周 荣华 、 杨欣 明 , 李秀 全 、 李 培 等同志给 予 了天力协助 , 在此表
示 衷心的感谢
中 国 农 业 科 学 2 4卷
纵观冰草属研究的历史 , 由于其经济上的重要性 , 除进行了大量植株外部形态 、 栽
培生理特点和牧草育种研究外 , 在小麦族的多年生属中 , 对冰草属细胞遗传学研究的资
料或许是最完整的。 但是 , 除个别例子外 , 冰草属与小麦族其它属之间的杂交研究很少 。
因而 , 冰草属被认为在小麦族中与其它属在遗传上基本无联系【6 〕。 这样 , 根据冰草属研
究的现状 , 选用原产于中国的冰草属材料与小麦杂交 , 对于在理论上探讨其间的遗传关系
和实践上将冰草属的期望性状导入到小麦中去都有重要的意义。
材 料 与 方 法
一 、 材料
本研究工作于 19 8 年 5 月到 1989 月 8月在中国农业科学院作物品种资源研究所进行 。
本试验选用的材料见表 1 。 其中冰草属材料为本课题组 19 86 年赴内蒙古等地考察时
采集的 (材料分布于典型草原 , 在冰草属内有较大的代表性 )O
表 l 试验亲本材料
T a b le 1 M
a t er i a ls us
e d i n t h is e x p e r im e nt
种 名 S「祀c ie s 编号 A c仪 ion N o . 倍性 P lo ld y 染色体组 G e n o m e 来源 or l , n
沙生冰草 2 5 92 4 X P P P P 中国内蔽
A g那扮 lo 。 苗左而~ In n e r2 6 1: 3 4 x P P P P M o n g ( li a
In C拓 11 a
2 6 1`〕 4 x P P P P
根茎冰草 2 6 2- 一 4 X P P P P
月召阳勿哟 〕 , . 滋” 0 1 2 618 4 X P P P P
中 国 春 6 X A A B B DD
:cn 尸了月自八切 七夕臼百公 “阴
e v C h in e ,训三 s p t i呀
F u kb 6 x A A B B DD J乳a广T a邵瓦` u祝 仁v F l一k o
西截半野生小麦 T 132 1 6 x A A B B D D 中国西截
T
己及巧互公 . , ” s户户 蕊加2份“ 抓 T lbe t In C h l n aT 142 6 x 之、 A B B D D
波斯小麦 P S S 4 x AA B B 德 国
口
G e r 们 la n y
二 、 方法
19 8 8年 5 月 , 以小麦属的种为母本 , 冰草属内的材料为父本 , 在大田进行杂交 。 穗
刚抽出旗叶时去雄 , 1 一 2 天后授粉 。 部分穗翌日重复授粉 。 授粉 24 小时后 , 用 75 p pm
G A 3 滴柱头一次 。 授粉后 12 天取下杂种穗 , 剖出杂种幼胚 , 置于除去种皮的中国春胚乳
上 , 然后接种在 N 6无机盐+ 5 111 9 / 1 I B A + 40 m g / L L H + 5%蔗糖培养基上培养 。
当试管苗有 3 片叶时 , 壮苗培养。 即剪掉根和叶 , 在 N 6无机盐+ 1 50 m g / L 天门冬酞
胺 + 10 m g / L IA A + 8 % 蔗糖的培养基上培养。 当试管苗有 3 一 4个分萦时 , 将分萦植
株一劈为二 , 分别放入 N 6无机盐 + I Om g / L I A A + 8 %培养基上培养 。 如此25 天左右繁
苗一 次 , 直至移栽前停止 。
试管苗于 9 月底移栽于花盆中。 1 月下旬部分花盆移入正常温室 (由于当年该温室
环境条件较差 , 这部分杂种植株仅用于形态学观察 ) ; 部分花盆移入冷凉温室 ( < 10 ℃ ) ,
使植株越冬 ; 翌年三月将冷凉温室内的花盆搬出 , 使植株在自然条件下抽穗 , 开花 , 并
套袋 自交和用小麦回交 。
6期 李立会 :普通小麦与沙生冰草 、根茎冰草属间杂种的产生及其细胞遗传学研究
在试管苗移栽前和花盆移入谧室前 , 剪取 l 一 2 厘米长的根 , 冰水预处理 ( O ℃ 2
24 小时 , 然后用C ar n o y液 ( 95 % 乙醉 : 醋酸 = 3 : 1) 固定 1 一 4 天 , 醋酸洋红染色或标
准孚尔根技术压片 。 花粉母细胞染色体减数分裂观察 , 采用 C ar n o y 液固定 , 改良苯酚品
红染色压片。
结 果
一、 属间杂种的产生
(一 ) 普通小麦与沙生冰草属间杂种 F l的产生 以沙生冰草为父 本共做了 6 个杂交
组合 , 58 75 朵花 , 获得杂种种子 25 粒 , 其中有胚的17 粒 (见表 2 泥
衰 2 小密口与沙生冰草的杂交结果
T a b le 2 Res u l t s o f h yb
r i d iz a t i o n b以 w e en T月 ict u阴 a n d A . de se 而用邢
组 合 杂交花数 结 实 率 成 胚 率
Hy b r一d N o of p o l l一 N o o f 盯 a l n s N O . of e 们 l br y韶
e om b in a ti o n 盼 te d f lo er t s o b t a i n ed %( ) o b ta in ed (% )中国春 x 沙生冰草 2 5蛇 6 60 1 0 . 15 2 1 0 . 15 2
C S x A 山 , 汀 。用州 2 5 92
中国春 x 沙生冰草 2 613 16 2 0
C S x A d“ ` 月`川玩 2 613
中国春义沙生冰草 2 619 37 57 2 3 0 . 6 12 l 6 0 42 6
C S只 A 已己, 刁。川饥 2 61 9
波斯小麦火 沙生冰草 2 619 152 1 0 . 65 8 ! ) ()
里 加邓别阴 x A 之云洛吧痴用从 2 6 19
西藏半野生小麦 T 132 沐沙生冰草 2 6 19 394 0
T a es 呀v “抓 “ 户 肋 `阮 u阴 T 132 x
A 记人 s` ,么〕川阴 2 6 19
西藏半野生小麦 T I栏 义 沙生泳草 2 619 7 50 0
T 酬百洲州 护产 红乙坑 “ 州 T 1 42 冰
A
. 己努 `月 `八优 2 6 19
合 计 T o t a l 58 75 1 25 1 l 7 0 . 57 8
(二 ) 普通小麦与根茎冰草属间 lF 杂种的产生 普通小麦与根茎冰草间的杂交是相
当困难的。 两份根茎冰草 2 6 11 、 2 168 材料的花粉被集中授于母本中国春。在共做的33 45
朵花中 , 产生了 6 粒杂种种子 , 其中只有 3 粒有胚 , 结实率和成胚率分别平均为 0 . 1 8%
和 0 . 09% 。 有胚的 3 粒杂种全部来自中国春 义根茎冰草 2 6 18 组合 。 中国春 K 根茎冰草
2 6 11组合仅产生了 l 粒无胚的种子 。
二 、 组织培养
(一 ) 杂种幼胚培养 远缘杂交中合适的胚龄对幼胚拯救能否成功至关重要。 为此 ,
授粉 5 天后开始调查受精结实情况 , 发现已受精的子房明显膨胀 ; 8天后 , 杂种种子的
雏形明显可见 ; n 天时部分种子开始收缩 ; 12 天时将大部分杂种穗从植株上取下以备取
胚培养 , 另外留下个别杂种穗作进一步观察 。 授粉后 1 3天 , 或许是由于受当夭高温 (3 9℃ )
的影响 , 杂种完全干瘪无法进行解剖处理 。 因此 , 在北京夏季大 田环境条件下 , 对普通
小麦与冰草属的远缘杂种进行胚拯救的种龄 , 一般为12 天 。
对所有小麦属与冰草属的杂种种子进行解剖 , 只有极个别种子有稀薄的胚乳 , 其余
4 中 国 农 业 科 学 2 4卷
均无胚乳 。有胚的杂种中, 幼胚形态的差异较大 , 从无盾片的小鱼鳞状到几乎接近正常的带
有盾片的心形 (见表 3 凡 胚发育程度的这种差异 , 不仅表现于组合间 , 亦可见于同一组合
中的不同胚 。 在获得杂种幼胚较多的组合— 中国春 x 沙生冰草中 , 有两个幼胚发育状况接近正常 。而在获得杂种幼胚少的组合 - 一中国春 x 根茎冰草中, 幼胚约分畜不完整 。
表 3 幼胚发 , 状况与培养结果
T a b le 3 D e v e l o Pm e n t e o n d i t i o n o f im m a t u r e e m b r y o s a n d e u l t ur
e d r e s u lt s
组 合 获得 胚 的 发 培养 直 接 形成愈伤 转入 M S分化培养基
C om b lan tl o n 胚数 育 状 况 胚数 成苗数 组 织 数 T ar 们 s几 r e a l ll ,n to M S
N o o f eD ve l
o pm e n t N O o f N O of N O o f d l ft e er n t一a t e d n正 d l也 n
e m br y o e o n dl ti o n em br y o d一r e e t ]y f 0 l l l】a l俪Z e ( l
O b ta l n曰】 o f e m br yo C u lt盯 e d 匹 od uc ed Ca l l璐 分化根 分化芽
s曰刻 il ng D i ff er D if e r -
en t ia t ed e n t la t ed
T 0 0 t S s h o o t s
中国春 x l 7 接近正常带有盾片的心形 2 2 . 0
沙生冰草 A l m o st n o r r n a l he a rt
C S X A s ha 】洲 1 w i th 跳 ut e llum
山 s召廊川爪
带有小盾片的微球形 5 l * * 4 2 0
V e r y s m a ll g lo bu la r
期 th l it t le 义吐 e l lU I们
无盾片的小鱼礴形 10 0 7 3 0
S m a ll 咒 a le 朝 t h o u t
访 s飞bl e sc u t e l lu印
中国春 x 3 带有很小盾片的鱼幼形 2 l l 0 0
根茎冰草 Se a le w i th ve r y
C S x A s n la ll 义吐 e l lu 三刀
抓` 泊” 口2
无盾片的小鱼翻形 l 0 1 0 0
S m a ll 义 a le w l t h o lt
协 sl b le sc u t e l lu r l
* 分别编号为杂种 l , 2 号
* * 编号为杂种 3 号。 lt ls
T h e y a r e n a m闭 h y b r i ds N o
na m e d hv价 一d 卜J n 3
月叻 N o Z , res l减兄 it ve ly
幼胚的发育程度直接影响到对其培养的结果 (见表 3 ) 。 在中国春 x 沙生冰草组合中 ,
两个接近正常的胚 7 天后直接发育成苗 , 并且幼苗生长正 常。 对于那些带有小盾片的鱼
鳞状或微球形胚 , 在 N 6培养基上也有直接成苗的可能 , 但需培养的时间长 (约 1 个月 ) ,成苗
率低 ,且幼苗较弱 , 大部分这样的幼胚是不能直接成苗的 , 而是在培养一个月后形成愈伤
组织 。 如在中国春 x 沙生冰草组合中 5 个带有小盾片的微球形胚中有 1个直接培养成苗 ,
4 个产生了愈伤组织 ; 中国春 x 根茎冰草组合 , 2 个带有很小盾片的鱼鳞状胚中 1个直接
成苗 , 1个形成了愈伤组织 。 至于 那些无盾片的小鱼鳞状幼胚 , 在 N 6培养基上则完全不
可能直接发育成苗 , 而是经长时间的培养后形成微弱的愈伤组织 , 这种愈伤组织无论 从
质量上还是数量上明显小于带有小盾片的胚产生的愈伤组织 。
要想从发育较差的幼胚所产生的愈伤组织中 , 分化出绿苗是困难的 。 从表 3 可见 ,
对 N 6培养基上产生的所有愈伤组织 , 经转入M S分化培养基后 , 一般都是在维持一段时间
后相继衰亡 。 尽管有些愈伤组织还能分化出根 , 其中带有小盾片的胚分化出根的能力要比
无盾片的胚强一些 , 但均无芽的分化 这样 , 结果在中国春 义 沙生冰草组合中经拯救后共产
生了 3个植株 , 分别编号为杂种 1 、 2 、 3 号 ; 中国春 义 根茎冰草组合产生了 1个植株 。
6期 李立会: 普通小麦与沙生冰草 、 根茎冰草属间杂种的产生及其细胞遗传学研 究
(二 )试管苗的无性繁殖 中国春 x沙生冰草的杂种 1、 2号植株在三叶期经壮苗
培养后 , 很快长出了粗壮的新根并出现了 4 个和 3 个分雍。 对 这些分萦经 3 次繁苗培
养 , 到移栽前共获得杂种 1 、 2 号植株群各为 6 株。 平均每株有分栗5 . 7个 , 生长健壮 ,
绝大多数粗壮的根长在1 . 0一 2 . 0厘米之间 , 移栽入花盆后全部成活直到收获。
中国春 x 沙生冰草的杂种 3 号植株 , 是由带有小盾片的微球形胚经长时间的培养后
产生的 。 本身表现叶片狭窄 , 根部发育不良且生长迟缓 。 在经过两次壮苗培养后 , 每次
均只长出一条细长的根 , 始终没有分孽。 移栽入花盆后 , 生长到四叶期时死亡 (由于此
株生长很弱 , 故未能剪根尖观察染色体数目 , 估计它或许有特殊的遗传结构 o)
中国 春火根茎冰草组合唯一的杂种植株 , 来自带有小盾片的鱼鳞形胚 , 起初其幼苗
形态 , 与由胚发育状况相近的中国春 X 沙生冰草间所产生 的 3 号植株相似 。 但经一次壮
苗培养后 , 发育状况明显得到改善。 经两 次繁苗培养后 , 来自同一胚的杂种植株繁殖成
4 株 。 移栽入花盆后 , 全部成活 , 到收获时仍生长健壮 。
三 、 杂种 「l的形态学
杂种植株形态上 , 无论是当年冬季生长于正常温室 , 还是来年 3 月从冷凉温室中搬
出生长于 自然环境条件下 , 中国春 x 沙生冰草 lF 在植株群间和群内看不出有什么差异 。
与其亲本相比 , 植株生长较为茂盛 , 表现出一定的杂种优势。 幼苗期似其母本中国春 ,
但生长旺盛 , 分孽较多 , 特别是越冬后的杂种植株 , 有效分孽多达 20 个以上 。 5 月上旬
抽穗 , 茎秆硬而有弹性 , 高 78 一 86c m 。 穗部形态倾向于母本中国春。 中国春 x 根茎冰草
lF 植株群在形态上的表现有些特殊 。 苗期生长旺盛 , 分孽较多 , 但发育缓慢 。 5 月下旬
抽穗 ,茎秆粗壮而有弹性 , 高 72 一 8c2 m 。 穗型似生产上推广的普通小麦品种 一一棒状或纺
锤型 , 穗轴及小穗上密被柔毛一一这一性状可能来自寸父本根茎冰草 。 颖及外秤的先端具长芒 , 特别以上部小穗最为明 显 这是双亲都不具有的性状。
四 、 亲本及 F l杂种的细胞学观察
(一 ) 亲本的细胞学观察 对亲本种的体细胞染色体数 目和其染色体在减数分裂时
的行为进行了考证 , 与前人 的观察结果相似 , 属正常范围。
(二 ) 杂种 F I的细胞学观察 考虑到来自同一胚的杂种植株群在壮苗和繁苗过程中
可能发生遗传变异 , 对每一植株群的各个单株分别做了染色体数目统计观察 。 镜检结果
表明各个单株的染色体数目全与期望值相符, 为 Z n = 35 (图版 1, 1 、 2 o) }
1
. 中国春 x 沙生冰草杂种 F l的花粉母细胞染色体减数分裂观察 。 中国春 x 沙生冰
草杂种 lF花书拇细胞减数分裂时的染色体配对情况见表 4 。 对杂种 F l的 1 、 2号植株群
的染色体配对分别作了统计 , 可以看出 , 两个植株群间无明显差异。 在中期 I , 每个细
胞中出现 5 一 7 个单价体的频率为65 % (图版 I , 3 ) , 有多价体出现的细胞频率为61 %
(图版 I , 4 )o 后期 I , 35 条染色体在移向两极的过程中 (图版 I , 5 ) , 以 14 一 7 一 14
方式分离的细胞占37 % , 最后处于赤道板中央的 7 条染色体随机移向两极或以染色单体
的形式移向两极 , 多数 ( 占47 % )形成两极各有17 和18 条染色体 (图版 I , 6 ) ; 此外 , 在
一些细胞中还可以看到染色体桥 。 在末期 n 四分体期 , 亦可见到有小核的出现 。
6 中 国 农 业 科 学4 2 卷一 -一 -一一一 -一 -表 T a b l e4 4 中国奋 x沙生冰草杂种F l及亲本在减傲分裂 时的染色体配对分布M n a e eh r oms o om ep ai ri n g and n r a g v a els u e of pn ar e ts n adS CxA . 亡北 s召尸勿翔舰F h v br ld s材 料 黑篡翠 观 察细胞 染色体配对 。 句 ms o。爬 四 ` n n gM a ten a】 sN仓 f oe e】 l lR n l11 gR阅1 1 声D J ta11 1 11 ]份 V砚毖 r od e中黔A D B1 4 2 2 岁了飞( ::念 ;弋 摆 ;1 )沙生冰 草 }, F 2 8 25 (泄飞 、 :几 (子咒 (了弋 岁当) 犷戈滩 故 已猪月御 刹加( 中国容 火 A B D I JF 3 5 67 扩氛 睿兔 ( ;氛 (曹蕴 之咒 岁少飞〕 怂 , 黑 )沙生冰 草 ) N” l
(C S x A 苗出 厂
勿 产别闹 N认 1
〔中国套 火 沙 A B D I, P 35 55 ( ;
)几 (了几 。 :练 (管氛 (浮咒, 〔 ;少飞撰 ) 撰生冰 草 ) N o Z
c( S水 A 公男 r
尹卯忍用 ) N住 2
两杂种植株群平均 6 6 2 8 24 4 16 12注 0 0 . 57 0 35 。 .肠 。 . 。
M e a n
2
. 中国春 x 根茎冰草杂种 lF 花粉母细胞减数分裂观察。 中国春 x 根茎冰草杂种 lF
植株群体中 , 同样出现了远高于预期的二价体和多价体频率 (表 5 ) 。 中期 I , 每个细胞中
有12 一 16 个二价体的频率为81 . 2% (图版 n , 7 ) .且有 70% 的细胞出现多价体 (图版 n ,
8 )
。 后期 I , 3 5条染色体开始向两极移动过程中比较普遍地有 5 条染色体滞后 (图版 n ,
9 )
,最后滞后的 5 条染色体通常以染色单体的形式随机移向两极 (图版 1 , 10) ,但多数
滞留将可能形成小核或丢失 。 出现染色体桥的细胞是普遍的 (图版 1 , n 入在四分体期 ,
每个细胞平均有小核 1 . 4个 (图版 1 , 12 )。
表 5 中国移 x 根茎冰草杂种 lF 及亲本减擞分裂时染色体配对分布
T a b l e 5 M
e a n e h r o m o s o m e p a ir i眼 a n d r a n g e v a lu es o f p a r e n t s a n d
C S x A
. 水比h ” o i F : h y玩 id s
材 料 染色 染色 观察 染色体配对 C hr om os m e 胆 lr i呀
M a te r一a ls 体组 {卞数 细胞
G e n o l l . e N众 of N 认 o f I R】 n g 11 R od 11 T o t a l 11 IU 扮 V
C hr 众 e e l l
咒 o r e d
肾 A AB B D D 42 21 0<飞 摆:1〕 ( {咒) 摆;1 )
恨茎冰草 P PP P 28 25 岁竺) 。犷氛 (子翼) (了弋 忿 )A . 解灿” o 考
中国春 x 根茎冰草 A B DP P 35 52 (』几 犷骂 、 :戈) 乃九 (:兰 撰〕 黑 )C S x A 脚幼内” o 甘
五 、 2F 及 B cl 种子的产生
在中国春 x 沙生冰草、 根茎冰草两组合的植株抽穗前后 , 均采取 3 种处理 : 部分穗
用于组织培养 , 保持其无性繁殖系 (结果将另文报道 ) ; 部分穗套袋自交 ; 部分穗用小麦
属内的不同材料回交 。 两杂交组合自交和回交的结果如下:
(一 ) 中国春 只 沙生冰草组合的自交 (凡 ) 和回交 (B C , )结实率 中国春 x 沙生冰
草 F ,自交和用小麦回交都能结实 。 在自交的 12 95 朵花中 , 仅获得了 6 粒种子 , 结实率为
6 期 李立会: 普通 小麦与沙生冰草、 根茎冰草属 间杂种的产生及其细胞遗传学研究
0
.
4 6 %
。 用六倍体普通小麦材料回交6 组合 , 4 4 朵花 , 结实 67 粒 , 结实率 15 . 1% ; 用 四
倍体小麦回交 2 组合 , 120 朵花 , 结实18 粒 , 结实率巧 . 0% 。
(二 ) 中国春 x 根茎冰草组合的自交 ( F Z ) 和回交 ( B C I ) 结实率 当 5 月下旬 lF
植株开始抽穗时 , 由于回交亲本小麦的花期大都已过 , 仅用普通小麦品种 F u k 。和波斯小
麦的花粉各做回交穗 1 个 , 而对大部分穗套袋 自交 。 结果获得 自交种子 ( 2F ) 2 粒 , 自交
结实率为0 . 巧% , 仅为中国春 x 沙生冰草 F , 自交结实率的1 / 3。 但是 , 无论用六倍体还是
四倍体小麦回交却比较容易获得种子 , 结实率分别为 21 . 5% 和21 . 0% , 共获得回交种子
( B C ; ) 5 粒 。
讨 论
一 、 小麦与冰草属的可杂交性
(一 ) 杂交双亲的选择在克服远缘不亲合性上的作用 有很大遗传变异范围的可杂
交性 , 不仅存在于栽培种中 , 而且存在于野生种及其近缘植物中 。 小麦栽培种间可杂交
性的变异是由位点的多态性引起的〔2] 。 在大麦属与小麦属的杂交中 , M at in 等『14] 发现 , 智
利大麦 口2白dre “ 阴 ch i le毗e) 很容易与小麦属内的一些种杂交 , 而大麦属内的另一些种
与小麦属间的杂交几乎不可能 。
小麦属与冰草属之间的杂交 , 已被许多学者 L“ 、 21 26] 证明是困难的 。 在这些失败的例
子中 , 被选做亲本的小麦属材料有当时生产上用的普通小麦品种 、 硬粒小麦和波斯小麦 ;
被选做亲本的冰草属材料通常是草原上推广种植的冰草和沙生冰草 。 在本试验中 , 先后
选用了小麦属中的两份普通小麦品种中国春和 F u k。 , 两份普通小麦亚种西藏半野生小麦 ,
波斯小麦 P S S等和冰草属内分布于中国境内的野生种共计5份材料为亲本进行了杂交。 在
这些组合中 , 通过幼胚培养 , 只有普通 小麦品种中国春与 沙生 冰 草 2 6 1 9 、 根茎冰草
2 61 8之间的杂交获得了成功 。 这一结果表明 , 在杂交困难性比较大的小麦属与冰草属之
间 , 除了现在通常所采用的幼龄去雄 、 授粉和赤霉酸处理柱头之外 , 对杂交父 、 母本进
行双方面的选择是必要的 , 特别是对期望性状的载体 ~— 小麦近缘植物的选择 。 本试验发现分布在不同地区的异花授粉的冰草属植物材料在可杂交性上 , 确实具有相对的遗传
异质性 。 在本试验中与中国春杂交成功的沙生冰草 、 根茎冰草均来自我国的内蒙古 , 生
长于 自然野生环境条件下 。 C h e] 1等「5 〕获得的中国春与四倍体冰草间杂种 F I植株 , 其冰
草也恰是来 自内蒙古 。
(二 ) 杂交小花数与克服远缘杂交不亲和性 在大 田环境条件下 , 由于受各种因素
的影响较大 , 杂交小花数在 1 0 0 朵以上 , 可能是排除不利外界环境效应和获得杂种幼胚
的有效途径 。 本试验中获得成功的两个组合 , 所做的杂交小花数均在2 0 0 朵以上 。
二、 普通小麦与冰草属间杂种高染色体配对分析
在中国春 x 沙生冰草 、 根茎冰草各自的 lF 植株花粉母细胞减数分裂时 , 出现了过多
的二价体和多价体 。 理论上 F I的染色体构型为21 个单价体 ( A 十 B + D ) 和不多于 7 个
二价体 (冰草属中相应种的 P P ) 。 实际上却分别出现了 12 . 40 和 12 . 39 个二价体和较多的
多价体 , 这与C h e n等 『5〕在中国春 X 四倍体冰草 lF 杂种植株中观察到 n . 8 个二价体和较
多多价体的结果相似。 不过 , 本试验结果中出现环状二价体的频率更高一些 。 Che n 等认
8中 国 农 业 科 学 2 4卷
为这种现象是由于 P染色体的同源配对和冰草属内可能存在抑制 h P效应的基因所引起的
小麦中部分同源染色体配对所致 。 笔者认为 , 除此之外 , 还不能不考虑到以下 3 种可能 :
(一 ) 在冰草属中存在有促进染色体配对的因子 (P or m ot io n g e n e) 。 小麦中的促进配
对基因 , 已有大量的报道 【18] 。 通过端体和单体系统分析 , 岁现在长穗僵麦草中也有促进
染色体配对的因子 〔 , 〕。 本试验中, 在排除 P 染色体同源配对 (不多于 7 n ) 和抑制hP 基
因效应外 , 亦然有 1 一 2 个二价体和部分多价体 , 说明在 P 染色体组中可能还存在着促
进染色体配对基因 。
(二 )冰草属的 P 染色体组与普通小麦的 A 、 B 、 D 染色体组间存在一定的同源性。
以前人们所认为的冰草属在小麦族中有遗传上的高度独立性 , 仅是依据杂交困难性的一
种推测 。 新近的染色体组配对资料一一两个二倍体种 , 长穗堰麦草了了火动之崔之, 7 况阴 e lo 儿孕 2-
ut 阴 L vo e , 2n = 14 , E )E x 沙芦草 F : 杂种在减数分裂时染色体配对表明 , P 染色体组
与 E染色体组间有着相 当高的同 ’源性〔25] 。 长穗堰麦草 火 节节麦 (A eg “ 〔7sP sq 、 ~
C o s
,
2n 二 2x = 14 , D D ; 普通小麦的 D 染色体组来源种 )的杂种中每个细胞形成多至
5个二价体这一 情况表明 , E 染色体组与小麦属的 D 染色体组间有部分同源性〔 , 、 “ , 。此外 ,
冰草属内的种与小麦族内其它各属间的杂种 , 并不具有其同普通小麦间的杂种如此高的
染色体配对频率 〔“ 、 2` 2 5 , 。 从 上述资料来看 , P 组与 A 、 B 、 D 组间可能存有部分同源性 。
( 三 ) p 染色体组的双份剂量诱导 了普通小麦中部分同源染色体间的配对 。 冰草属的多
倍体类型为节段异源多倍体 , 有一个基本相同的染色体组 P 。 iR l e y等【l6j 观察到当黑麦
( eS ca le “ ear le L
.
,
2n = 2x = 14
,
R )R 的 R染色体组剂量从一份增加到两份时 , 小麦
的部分同源染色体联会形成的二价体从 0 . 24 个增加到2 . 25 个 。 因此 , 对于存在有双份 P
染色体组的普通小麦与四倍体的沙生冰草、 根茎冰草等的杂种 , 高的染色体配对频率也
许是由于 P 染色体组有类似于 R染色体组的作用引起的。
三 、 杂种 F l的自交可育性
在小麦远缘杂交中 , 几乎所有的属间杂种都是完全不育的【l9j 。 即使直接用普通小麦
的 P h基因突变体曲 1与小麦亲缘关系最近的山羊草属 ( A `?ig l口PS L . )种杂交 , 虽然它们
之间的杂种也有相当高的染色体配对频率 , 然而不仅其杂种 F l自交不育 , 而且 回交亦不
结实〔20] 。 另外 , 与本试验非常相近的杂交组合 , Che n 等【5 〕获得的中国春与四倍体冰草间
的杂种 F 中, 亦未见有自交结实的报道 。 中国春与沙生冰草和根茎冰草两杂交组合中的
lF 能自交结实 , 笔者认为除主要与杂种中高的染色体配对频率 , 特别是有较多的环状二价
体有关外 , 以下两个处理也可能起着重要的作用 (因为未 自交结实的中国春 x 冰草杂种
F
l 『 5〕恰恰未做这两个处理 ) : 其一是壮苗和破雍培养繁苗 。壮苗培养 , 加强了幼苗的生长
势 ; 破萦繁苗 , 扩大了杂种植株群体 ; 而在分孽状态下越冬 , 又增加了有效分集。 这些
都大大增加了可用于自交的小花数 。 如果没有扩大 lF 群体 , 是很难保证诸如中国春 x 沙
生冰草 F I的。 . 46 % 和中国春 x 根茎冰草 F l的0 . 巧夕断这样低的自交结实率能够结实的。 其
二是幼苗越冬的作用 。 幼苗越冬不仅增加了有效分孽 , 而且使其生育期延长 , 这有可能
使 lF 实现一定的生理遗传适应性 , 进而影响自交结实性 。
四 、 组织培养技术在远缘杂交上的应用
(一 ) 幼胚拯救 自从 K r us e 〔, 引 首次应用赤霉酸溶液刺激子房和受精卵发育 , 接着
6 期 李立会 :普通小麦与 沙生冰草 、 根茎冰草属间杂种的产生及其细胞遗传学研究
对小麦x 大麦 (厅u v 如r e) 的杂种幼胚在人工培养基上拯救成功后 , 近年来通过这一
技术已产生了许多新的小麦远缘杂种 【“ 、 ’ 9] 。
在以前对远缘杂种幼胚拯救方面的报道中 , 幼胚拯救成功与否 , 常常是以其长度单
位来衡量的。 对普通小麦 x 沙生冰草 、 根茎冰草杂种幼胚培养观察结果表明 , 盾片的有
无是至关重要的。 本试验中 , 那些无盾片的小鱼鳞状幼胚在直接成苗的N 6 培养基上仅
形成微弱的愈伤组织 , 将此愈伤组织转入M S 分化培养基后也不能分化出植株 , 即使个
别的有根的分化 , 而这种发育不健全的幼肠 在小麦族的属间杂种中可能是经常遇到的 。
看来 , 解剖和幼胚培养技术的改进已成为小麦远缘杂交进一步发展的限制因子 。 所以 ,
对于那些没有盾片的远缘杂种幼胚 , 要想通过培养获得植株 , 就必须寻求一种新的培养
基或先经愈伤组织再进而分化出绿苗的途径 。
(二 ) 无性繁苗在小麦远缘杂交中的应用 笔者认为在小麦远缘杂交中应用破栗培
养无性繁苗技术有如下作用 :
1
. 基本上解决了试管苗的越夏问题 。 试管苗越夏是组织培养中遇到的主要问题之
一 。 一般试管苗越夏需给培养基添加生长抑制剂或整个夏季将之置于低温下处理 , 而无性
破雍培养繁苗只需要在正常的培养条件下进行。
2
. 在扩大 F l杂种群体的基础上 , 获得生长健壮的幼苗 , 从而保证了移栽的成活。 试
管苗移栽时 , 根部的发育状况是能否成活的关键 。 通过壮苗培养和无性繁殖的试管苗到
移栽时 , 其根多而粗壮 , 大都长 1 . 5厘米左右 , 分裂旺盛 移栽后在自然条件下可全部成活。
3
. 有了大的而且与原杂种植株保持遗传一致性的 R株群 , 便于对 lF 的遗传学等其
它方面进行研究 。 本试验中 , 由于来自同一杂种胚的植株较多 , 故而能对 lF 杂种进行幼植
培养 、 回交 、 自交及形态学和细胞学等比较全面的研究 , 特别是对于 自交结实性有重要作用。
结 语
本研究首次将普通小麦与沙生冰草 、 根茎冰草杂交成功 , 并首次获得了普通小麦与
冰草属间杂种的自交 ( F : )和回交 ( B C I )后代。 在杂种 F ;中 , 不仅出现了远超出期望值
的高染色体配对频率 , 而且自交可育 。 这在理论上对先前人们仅依据属间杂交困难性所
推测的冰草属 ( P 染色体组 ) 在小麦族中的高度独立遗传地位提供了直接的相反的证抵
很可能 P 染色体组与 A 、 B 、 D 特别是 D 染色体组间存在有一定的同源性 ; 在实践上 ,
使获得异源附加系和异源代换系 , 甚至异源易位系 , 进而为利用 P 染色体组中的抗病 、
抗寒 、 抗旱 、 抗盐碱等期望基因变得相对的容易 。
参 考 文 献
〕 陈尚安等 : 小麦野生近缘植物抗病性鉴定 , 中国农业科学 , 1的 0 , 23 ( 1 ) : 5 4一 59
] 耿以礼 : 中国主要植物图说 , 科学 出版社 , 1 965 , 3 40 一 4 46
] 郭本兆 冲国植物志 (第九卷 , 第三分册 ) . 科学出版社 , 1987 , 7 一 119
] BO w d
e n ,
W M
. : J
.
B oL
,
1肠爪戳 1 42 1 一 1刁4 8
〕 c触 n Q . d 目 . : c . R A。睡 趾L P ar is . se r ie m , 1韶 9 , 425 一姗」 D e w盼 D , 孔 ; I n : 16 t h S ts 山e r (哥e n e t . S y ” l p , N ew Y o r k , 19 84, 2 09 一 蕊 9」 D v o r a k, J . : C a n . J . G e n e t . C y t o l . 19 7 1 , 1 3: 90 一 94
」 D v o r a k , J . : C a n . J . G e n e t . C y t o l . , 1 98 0 , 22: 23 7 一 2 59
1 0中 国 农 业 科 学 2 4卷
r
9J D vo ra k
,
J
.
: G e n o m e
,
1 98 7
,
29 : 3 4 一 4 0
1 1川 H i t o h e o c k , A . 5 . : M a n au l o f t h e G r鱿脱 5 o f t h e U n i t e d s t a t e s , U S D A M i即 , P u悦 . , l , 5 1, 23 0一 Z s u
[ l ] I J硬, h n s o n , D
.
A
.
: I n : C r e s t e d w h e a t g r蝴, U t a h S t a t e U n i v . , L呀a n , 1 98 6 , 6 5一 叨
J ! 2 J K r姗 , A . : 刀。 了山灵顺 火 乃亩价姗 h y b r ids, He r e山 t叭 1 97 3, 7 3; 15 7 一 16 1
[ 13 ] 切 v e , A . : C o n s pe e t us o f t h e t r i t i e e a e , F e d ds . R e pe r t . , 19 8 4, 9 5: 42 5 一 52 1
以 4 J M a r七In , A . e t a ]. : C e~ J R既 仁 o m m u n
.
,
198 0, 扮 3 4 9一 3 5 )
L15 1 M e ld e r is
,
A
.
: I n : F l o r a E u r o评 e a , V o l . 5 , C a m b r id g e U n i v e r 吕it y P r e s , 1朋0 , l , o 一 2肠
几一6 ; RI le y R . e t a l. : I n : P r o e . 4 t h I n t . w h e a t Ge n e t . Sy m p . , l , 7氏 73 2 一 ” 8
S a k a m o t o
.
S G e n e t
.
,
19 64
,
3 9: 3 93 一 7 38
ew凡
一
1阳
【19 )
【2。」
〔2 1
〔2 2〕
【2 3 1
[2 4」
[ 25 ]
S e a r s E
.
S h a r m a
,
S h a r m a
,
S m it h
,
D
S n a pe
,
J
i
T z v e 卜v ,
昙乏
: J a 卜 J
Ge n e t i e
.
e t a l
.
c o n t r o l o f e h r o m os o m e P a ir in g i n w h e a t
,
A n n 肠 Re v . G e n e t . , 玲76 ,
C u r r e n t s t a t朋 o f w i dl h y b r宜山 z a it o n i n w h e a t , E u p h y it e氏 19 83 , 怨
1 0: 3 1 一 5 1
1 7 一 3 1
e t 臼l : Z
J
.
A叮 r i e `
P f l a n 沈 n 名u e h t g , 19 86 , 9 6: 1 一 7
R e吕. , 19 4 2 ,
之愁H e r e击 t y , 1 97 9 ,
异4 : 33 一 4 7
4 2; 2 9 1 一 29 8
r a s朋 5 o f 5 0 讨e t t rn i o n , N e w D e o h i , o x o n 认 n P r . P V T . L t已 , 19 8 3 , 146 一 2 9 8
W a n g
,
R
.
W压n g , R
.
IL
·
C
.
: G e n o m e
,
1 98 7
,
2吸 8 0 一 84
R C
.
: P r o 罗 n i邢 of hT in o p . 护u 价 e l o叩a t u m 洲助 r叹p 奋or n mo 匆 0 1切 “风 G e n o IU e , 198 7 ,
2软 7 38 一 7 43
[2 6 ] 、、飞 i t e , W . J . I n t e r g e n e r i e e r仪眨陀 旧 悦t w e e n rT i it 亡u m a n d 月口即p u邝 n , cS i
.
A g r i e
.
,
194 0
,
2 1: 1朋一 2口
P RODUC T 10 N AN D CYT OGE NE T I C ST UDY OF ! N T ERGE NER I C
HYB R! DS OF .T A E S T I V正刀廿 L . WI T H A . 刀召S 召丑 -
T O R 厄朋呀 ( FIS C H . ) S CHU LT . AND A . J叮〔万万6了 ROS HEV .
L i iL h ul
伪招 it ut et o f 价op G e r m p l a sm R e s o u 理 e s, hC i n e s e A e a d e m , o f A g r i e u l -
t u ar l gc^ i
e n e e s
, 刀` ij i即 1 0 0 0 8 1 )
AB S T RACT
l’ h r o u g h e n b r y o c ul t叹 r e , i n 亡e r罗 n e r i e h y b r i山 o f , 、 t t i〔口祝 口“ 左掀m L . w i t h A夕入叨 .
g r o n de
吕亡 r亡o r u m (n s e h
.
) S
c h u l t
·
(Z n = 4
x = 2 8
,
P P P P 、 a n d A , n 〕 p夕or 九 m i e h n o i R o s h e v .
(Z
n 二 4 x 二 2 8, P P I , P ) w e r e p r记 u c e d f o r t h e f i r s t t lm e . 之t w a s ot u n d t h a t t h e 硬泛J I) r ; d u m -
b r y o s w i t h一 u t s e u t e l l u m w e r e im P o s s i b l e t o o b t a i n s e e d li n g a f t e r t h e y w e r e r ecs ue d
o n N 6
m e d i u m
.
A l l t u b e
一 s e e d l i n g s o b t a i n e d f r o m e m b r y o e u l t u r e w e r e s u b e ul t u r e d f o r m o r e v i g
o u r
, a n d t h e n t h e i r it l le r i n g s w e r e e u t i n t o t w o 件 r ts a n d se 阳 r a it v e ly e ult u r e d i n o r de r
t o re e
o
ve r m
o
re 阳 m p l e s of 七h e sa l n e h y加诬d lP a ” t l e练 T h e 即 e d】i n g 助d jSP k e e h ar a e te rj ·
s it e s Of t h o se h y b
r ids w e
r e is m i la r t o t h o 即 of e o m m o n w h e a t . T h e a v e r a g e me i o it e e h r o
·
m os m
e , i
r i n g a t M l o f F l h y b r i` 15 i n t h o se t w o
e o m ib an t i o n
s w e r e 6
.
6 2 1+ 4
.
1 6 r do 11
+ 8
.
24 r i n g 11+ 0
.
5 7 111 + 0
.
3 5 Vl + .0 0 6 V + 0
.
0 3砚 a n d 6 . 3 9 1 + 孟 7 5 r记 11+ 民 64 r i n g 11 +
0
.
8 1 1 + 0
.
30万 + 0. 0 4V r e .碑 e t i v e l y , t地 ib v a l e n t a n d m ul it v a l e n t f o r m a t i o n s w e r e r n u ch
h i g h e r t h a n e x伴 e t e d f r o 讯 t h e g e n o m i e f o r m ul a e . T h e se e ds w e r e e a is l y o b t ia n e d f r o m
t h e b a e k e r o s o f F l p l a n ts w i t h h e x a p l o i d a n d t e t r a p l o i d w h e a t,
a n d m e a n se
e d
一
se t it n g
w as m
o r e t h a n 15%
.
I t 15 e s讲 e i a ll y w o r t h 一 w h i l e t o n o et t h a t t h e F , h y b r ids w e r e 能 lf -
f e r t i l e
,
h e r e se l f
一介 r it h t y r a t e s w e r e .0 4 6 % a n d 0 . 1 5% , r es 碑 e t i v e l y . T h e f o l l o w i n g q u ·
es ito 朋 a re d i SC u s . 汉 l 认 t油 po pe 代 L l 、 e suc ces 吐山 e x 碑~
e of 妙b r洲幽口o n 悦tw e n f帅 ·
mo
n w h ea t a nd 」g r op 口r o 月 ; 么 The t h e o r e t i e目 a n a l y翎 of 日p 阮园 r e l a t io 诩h iP of P g e n o m e
fo A
,
B
.
D 罗no ~ ; 3 T he r e a 以m f or se 廿
一
fe r仙 t y in t h e FI h y b r i电 魂 T址 苗, 苗份成 e of
the h yb耐 t u悦 一段兄山 i” 罗 俪飞 s“次』 tur de ot .以 k e t h e m 们 g o r毗 a耐 the n 眼 x au U, rP -o
sP g a t
e d i n w ide
· e r o s i n g i n rT i it
亡 e a e .
Ke y w o r d s : 工 a e s it洲 m L ; A . de 仰 r ot r u价 (凡脱 h . ) S e h ul t . ; A . m i e h n o i R o s h e v . ; In ·
t e r g e n e r i c h y b r i d ; E m b r y o e u l t u r ` ,; S e e d il n g a se x u al l y p r o皿g a t e d ; C h r o m o s o m e 皿 i r i n g :
S e if
·
fe
r t i l i t y
李立会:
L L h i iU i:
普通小麦与沙生冰草 、 根茎冰草属间杂种的产生及其细胞遗传学研究 图版 l
P r o du et in on ad ey o t朗 n et i es tu dy of in tr egn er ei eh ybr ids of
T . as et i旅 mL . 介 ith A. d esr e加r u m (F is ch. )S eh u l t. an dA m i eh n o i
P l at el
R oshv e
.
1
. 中} 习养 了 沙生冰 孕F . 根尖细胞 知 二 价2 . 中闪 存 x垠 鉴冰 冰F 尹椒尖细胞. 如 如: ` 一 6中 {司春 不 沙生冰 学F 花粉叶
细胞减数分 裂期: 弓 MI 月} I n,d I] 一 1: ; 曰 119 1卜 4 M I 6 { 丰 l 阳 d l 一 川 r1I 丫 1 十 l 川 } 1 IV 陈 川 分 刀的 ` 茶
染色 体: 6 A I 两 极芥含 子门 7 和 1邪条染色 {乍
l l{( 川 t1 甲 仁闪 l 】1 t h。 了 爪刀月 川刀 c 丫 曰 1 1吟 c 为 ) rl n父万 八尸? j) 曰刀月 爪 悦 J ,初月胡 居卜 h y卜)门 d , 断 飞 弓5 2 1众川卜 lt ) c日 l 川
.1,( 7
一 ,介 入 l/ 万 ” 产 叮 C川以 ` 己 匀〕 r川只 六 飞 胡 “ 加川 了 F . h 川、 1T (1s 21 二偏 考一 6 M 因 硬` 卜 。 f l)( 川川 l m ()t h“ C门1 , 川 C S 吠 飞
从 义 }j( 川 了” 1 1: 比 附 记 卜 弓 M I 月 十 l r )( 1 1 以 rl l 欣 lJ , t M I 6 I 斗 】 r `川 月 十川 r l7 只 I J I 川 泞 I N 污 A l l川力 a阳
I 引们 认 l姗乏 拓 L h卜 m ,曰 lJ l `一 , 17 :1) 咬旧、 犯 汀丁 〔 } 月 ltL ld 山 1飞. 卜 八们拟山a 城 「 }了 故 t心 l 践 d lr 川川州 1l l e 5 川 仁、 们 ) p lL 卜 r e 川 r (t 卜
、 ℃ 1、
李立会 :普通小麦与沙生冰草 、 根茎冰草属间杂种的产生及其细胞遗传学研究 图版 1
L1i Lhu i :P r o du c t i o n n a de
to y
ge n e t ie st u dyo f i n te r ge n e r ie h yb r i do sf Pl at e l
T . a刃 st i砂u m L
.
w i th A
.
de e r sto
r u m ( Fi
sc h
.
) S e h u i t
.
an dA
.
mi c h n o i Ro she v
.
} 娇巾l以存 又 根茎冰 个 F、花粉 仁比叫饱减数 分裂期 了 M I
’ 嘴
染色体以 5 15 1分 离 川 A l 落后的染色体以 染色单体的形 式趋向两极 : 1 1
从 .M (
, 下 [ 士 1 1
A l
,卜 染色体析
r 、 n认 1 1石异岸
叭 .
汀
左飞
( h c
小核
M川 ` ,别 s 。 「
rl n只 竹 干 Z “ 卜
以 曰欲 盯 la l lj :lt 七
曰川川 1 川以 h 盯 C日{5 川 C S 厂 飞
协 八 1、 a p hu s 贮 、 . 引从 )w l n只 肠
b 丫 c h 六” ” 扭 tl ds , 1 1 A n 摊 p h a s c
” 故 l) 胡 2 F L h 讨 r] i(] ,
、` d lsJ 功` 山 m ; 飞”
了 M l 丁
A l l川如 a货
阳 d l J 峪 rl l“ 1 , 吕
s h o w l n 只 私、 e 、a只只a 丁 ds
M 1
. 了 I
钟n dl 只 肠
由 〔盯 1 9 比阳m 叮 ` ” ” c 阮闭即s , 12 Ql;t l r 阳卜 夭 LL L、 上` 川既回