全 文 ：　[收稿日期] 　2011-03-21;2011-05-10修回
　[基金项目] 　贵州省科学技术基金项目“信号物质对金线兰逆境蛋白产生的调控作用研究”[ 黔科合 J字(2008)2097]
　[作者简介] 　李亚军(1963-),女 ,副教授 ,从事生物学研究。 E-mail:liyajungy@163.com
[ 文章编号] 1001-3601(2011)06-0352-0043-03
低温胁迫对金线兰抗氧化酶活性的影响
李亚军1 , 周伟香2 , 龚 宁1 , 李启洪1 , 李 光1
(1.贵州师范大学 生命科学学院 , 贵州 贵阳 550001;2.浙江省宁波市北仑泰河中学 , 浙江 宁波 315800)
　　[摘　要] 为了解逆境对金线兰抗氧化酶活性的影响 ,以金线兰[ Anoectochi lus roxburghii(Wall)Lindl]
无菌种子苗为材料 ,研究了低温胁迫(3℃,8℃,13℃,18℃)对金线兰抗氧化酶活性的影响。结果表明:随着低温胁迫时间的延长 ,SOD活性表现为先升后降 ,并维持在较高水平;CAT 和 A PX表现为先下降后升高再
下降的趋势;POD则为先降后升的趋势 。其中 ,CA T 和 POD变化幅度大 ,且维持较低活性 ,APX变化幅度
小 ,活性维持较高水平。[关键词] 金线兰;低温胁迫;抗氧化酶活性[中图分类号] S759.82 [文献标识码] A
Effect of Low Temperature Stress on Antioxidase
Activity of Anoectochilus roxburghii
LI Ya-jun1 , ZHOU Wei-xiang 2 , GONG Ning1 , LI Qi-hong 1 , LI Guang 1
(1.School of Li f e Sciences , GuizhouNormal University , Guiyang , Guizhou 550001;2.Ningbo Beilun Taihe High
School , Ningbo , Zhe j iang 315800 , China)
　　Abstract:Effect of low temperature st ress (3℃, 8℃, 13℃ and 18℃)on ant ioxidase activity of
Anoectochilus roxburghi i was studied by taking steri le Anoectochi lus roxburghi i seedling as material to
know effect of adversi ty on antio xidase activi ty of Anoectochi lus roxburghii .The results showed that SOD
activi ty fi rst increased and then decreased and remained at a higher level w ith the ex tension of time under
low temperature st ress.CA T and A PX activi ty fi rst decreased , then increased and decreased at last.POD
activi ty fi rst decreased and then increased.The CAT act ivity and POD activi ty w ere low w ith g reat
ampli tude of variation.The APX activity w as high w ith small amplitude of v ariat ion.
Key words:Anoectochi lus roxburghii ;low temperature st ress;antio xidase activi ty
　　金线兰[ Anoectochilus ro xburghii(wall)Lindl]
又名花叶开唇兰 ,为兰科开唇兰属植物[ 1] ,为珍贵的
药用植物 。金线兰生长于山区阔叶林下常被树叶遮
盖的阴湿地上 ,对生态环境要求严格[ 2] 。野生资源
缺乏 ,药材供不应求 ,加上老百姓的盲目滥采 ,使其
逐渐枯竭 。因此 ,可利用植物组培方法培养大量金
线兰无菌种子苗 ,提高药材产量。然而 ,逆境胁迫会
促进植物体内活性氧的产生 ,容易损伤体内膜系统 ,
导致细胞死亡 ,影响无菌种子苗的培养 ,从而直接影
响金线兰幼苗移栽的成活率和人工栽培的成功率 。
自由基伤害学说认为 ,在正常情况下 ,植物细胞
中存在活性氧的产生和消除 2个过程。有些酶如超
氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化
氢酶(CAT)及抗坏血酸过氧化物酶(A PX)等可清
除活性氧自由基的毒害[ 3] 。低温胁迫对抗氧化酶活
性的影响方面 ,张中华等[ 4] 在低温胁迫对韭菜保护
酶活性影响的研究中发现 , 随胁迫时间的延长 ,
POD和 SOD 活性均先上升后下降 , CAT 活性则下
降。关于对红松幼苗和李子的抗冷试验证明 ,SOD
和POD经抗冷锻炼后活性明显提高 ,而且在低温锻
炼过程中 ,一直维持在高于对照的水平上[ 5-6] 。说明
SOD酶 、POD酶能清除超氧化物自由基 ,从而减轻
低温对膜系统的伤害。笔者对低温胁迫下金线兰中
超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血
酸过氧化物酶(APX)及过氧化物酶(POD)做了系统
的测定 ,并分析了低温胁迫对金线兰抗氧化酶活性的
影响 ,以期探索低温对金线兰植物体内抗氧化物酶活
性的影响 ,为金线兰的组培或人工栽培提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
金线兰无菌种子苗由贵州师范大学金线兰课题
组提供 。
1.2 方法
选取幼苗长势基本一致的材料 ,置于 LYH 型
光照培养箱(光照强度为 2 000lx ,光照时间为 12 h/
d)内 ,进行低温处理 ,温度设置为 3℃、8℃、13℃和
18℃,以金线兰组培室温度(23℃)下的无菌种子苗
为对照 。取处理后的 0d 、2d 、4d 、6d 和 8d 相同部
位的成熟叶片进行超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化
氢酶(CA T)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)及过氧化
物酶(POD)的测定 ,重复 3次 。
1.2.1 粗酶液的制备及超氧化物歧化酶(SOD)活
性的测定 按照王爱国等(1983)[ 7] 的方法进行。
　贵州农业科学　2011 , 39(6):43 ～ 45　Guizhou Ag ricultural Science s
1.2.2 过氧化氢酶(CA T)活性的测定 参照程鲁
京等(1994)[ 8] 钼酸铵显色法略作改进。室温恒温
下 ,在空白管(B2)、(B3)、(B1)中分别加 1mL 基质
液 、1mL 缓冲液 、1mL 基质液 。样品管(U)中加
0.2mL粗酶液和 1mL 基质液 , 37℃水浴保温 1m in
后加入 1mL 钼酸铵 ,均匀混合后在 B2 管和 B3 管
中分别加入 0.2mL 缓冲液 , 在 B1 管加入 0.2mL
粗酶液 ,5min后在 405 nm 处以蒸馏水调零比色 ,记
录吸光度值(A)。
CA T 活性/[ U/(min · g FW)] =AB1 —Au
AB2 —AB3 ×
65×1×稀释倍数×34
0.2×1 000
1.2.3 抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定
参照 Dalton等(1987)[ 9]的方法略加改进 。加入100
μL 粗酶液启动反应。连续记录 290 nm OD值的变
化。酶活性大小用每分钟吸光度的变化值来表示 。
1.2.4 过氧化物酶(POD)活性的测定 同张志良
的方法[ 10] 。
2 结果与分析
2.1 低温胁迫对 SOD活性的影响
超氧化物歧化酶(SOD)是植物抗氧化系统的第
一道防线 ,对于清除氧自由基 , 保护植物细胞的组
成 、结构和功能免受破坏具有很重要的作用。低温
胁迫下 SOD活性的测定结果(图示)显示 ,金线兰植
物在对照温度下的 SOD值相对来说较小 ,随着时间
的推移 ,SOD活性也没有很明显的变化 。而在低温
胁迫下 ,不同温度对 SOD活性的影响明显不同 ,但
变化都存在一个共性 ,即先逐渐增加 ,到达最高值后
又逐渐下降。由图 1可知 , 8℃、13℃、18℃胁迫下 ,
SOD活性随着时间的推移逐渐升高 ,第 4天到达高
峰 ,然后逐渐下降 ,第 6 天后 ,8℃、13℃胁迫下 SOD
又有较小范围的升高。其中 , 8℃胁迫下 ,SOD活性
第 2天时迅速升高 ,第 4天达到高峰后再逐渐下降 ,
但 SOD活性一直维持在较高的水平 。3℃胁迫下 ,
SOD活性值的变化比较明显 ,先逐渐升高 ,第 2天
后逐渐下降 ,第 6 天时到达最低点 ,并在此之后的
SOD活性值均低于对照值 。而其他低温处理下的
SOD活性一直维持在对照值附近或在高于对照值
的范围内变化。
2.2 低温胁迫对 CAT活性的影响
CAT 具有清除植物体内多余的过氧化氢
(H2O 2)的作用。由图示可知 ,在对照温度下 ,CA T
活性值一直在 85 ～ 102 U/(min · g FW)范围内变
化 ,但变化并不明显 。而在低温胁迫下 , CA T 值发
生了比较明显的变化 ,并且变化范围的幅度较大。
低温胁迫下 ,CAT 活性随着时间的延长 ,均会先降
低 ,到达最低点后又会有较小范围的回升 ,但回升的
活性值远低于对照温度的值 。从图示看出 ,在 3℃
胁迫下 ,CAT 活性值会迅速下降 ,第 4天可降到 17
U/(min ·g FW),之后又急剧回升到 68 U/(min ·
g FW)左右 ,最后又会有小范围的下降。8℃胁迫下
的 CA T 变化与 3℃的变化情况相似 ,区别在于 8℃
胁迫下的变化幅度没有 3℃的大 。13℃胁迫下 ,
CA T 活性值的变化范围与对照比较相近 ,但最低可
降到 51U/(min · g FW),最高却只能达到 85 U/
(min· g FW)左右 。此外 , 18℃胁迫下 CA T 活性
再次下降后又出现了再次上升的情况 。
2.3 低温胁迫对 APX活性的影响
抗坏血酸过氧化物酶(APX)具有清除植物叶
绿体中 H 2O 2和 O -2 的作用 ,若使其活性升高 ,则可
使超氧阴离子自由基极显著下降 ,从而减弱脂质过
图示 不同低温胁迫下金线兰 SOD、CAT、APX和 POD的活性
Fig.　SOD , CAT , APX and POD activities of Anoectochi lus roxburghii under low tem pera ture stress
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氧化作用 。从图示看出 ,低温胁迫下 ,金线兰叶片中
APX活性变化趋势与 CA T 活性变化比较一致 ,均
会先降低后升高 ,然后再降低。所不同的是 , APX
降低到第 2天后 ,又迅速上升 ,并且其活性值可超过
对照温度中 APX活性值的 1倍之多。8℃时 ,APX
活性下降的幅度小 ,而第 2天后会出现急剧升高的
现象 ,第 4天后又有较小的回落 ,但基本保持在对照
值附近变动。18℃时 , APX活性值第 4天升高到最
高点(高于对照值 ,低于其他低温处理值)后 ,会保持
在对照值之上 ,且变化幅度较小。
2.4 低温胁迫对 POD活性的影响
过氧化物酶(POD)广泛存在于植物体中 ,也是
清除过氧化氢的一种酶 ,与呼吸作用 、光合作用及生
长素等的氧化作用都有关系。由图示可知 ,金线兰
POD活性在对照温度下随着时间延长的变化不明
显 ,维持在 10 ～ 12 U/(min · g FW)。但在低温胁
迫下 ,POD活性受到显著影响 ,其变化趋势总体表
现为先急剧下降 ,然后持续一段时间保持相对稳定 ,
之后再上升 ,但总体的上升值均低于对照温度下的
POD活性值。其中 ,只有 3℃胁迫下POD活性可高
出对照温度下 POD活性的 0.17倍 。在所设置的低
温条件下处理 2 d时 , POD活性达到最低点 ,在第
4 ～ 6天时持续相对稳定 ,第 6天后又逐渐上升 ,并出
现温度越低其 POD活性越高的规律 。
3 结论与讨论
McCord和 Fridovich 首先揭示了 SOD的生物
学功能[ 11] 。SOD是活性氧清除反应过程中第一个
发挥作用的抗氧化酶 ,能将超氧化物阴离子自由基
(O-2 )快速歧化为过氧化氢(H 2O 2)和分子氧(O 2)。
在随后的反应中 ,H 2O 2在过氧化氢酶(CA T)、抗坏
血酸过氧化物酶(APX)及过氧化物酶(POD)的作
用下转变为水和分子氧(O 2)[ 12] 。以此保护植物体
免受活性氧的侵害。
结果表明 ,随着低温处理时间的延长 , SOD 活
性总体表现为先升高 ,第 4天达到最高值 ,随后再降
低 ,但活性一直维持较高水平 。值得注意的是 ,8℃
胁迫下 ,SOD活性第 2 天时迅速升高 ,第 4 天达到
高峰后再逐渐下降 ,并保持较高的水平。由此可看
出 ,低温胁迫初期 , SOD活性增强有助于清除由于
低温积累的超氧化物阴离子自由基(O -2 ),是对低温
逆境的适应性反应。在一定时间范围内 ,低温胁迫
有助于 SOD活性的增强 。这与陶大立与靳月华[ 13]
发现我国东北地区针叶树越冬期间针叶 SOD 活性
显著提高的结果一致 。由试验结果可知 ,极端低温
如 3℃处理 6 d后的 SOD活性值低于对照值 ,说明
随着胁迫时间的延长 ,低温造成的伤害打破了体内
的平衡 ,SOD活性降低 。
SOD将超氧化物阴离子自由基(O -2 )快速歧化
为过氧化氢(H 2O 2)和分子氧(O 2)之后 ,金线兰体
内过多的 H 2O 2则由 CAT 、APX和 POD清除 。这 3
种酶活性在胁迫初期均降低 ,随后逐渐回升 ,但 3种
酶活性的变化时间和幅度不同 。从下降幅度来看 ,
CA T 活性总体表现为先降低后升高 ,达到峰值后 ,
活性又有所降低 ,并一直低于对照活性值。POD对
低温处理表现最为敏感 ,其活性随胁迫时间的延长
急剧下降后又急剧上升 ,并维持较低水平 。胁迫初
期 ,APX 活性降低时间较短且幅度很小 ,第 2天后
活性迅速升高至高于对照的 APX 活性 ,并一直维
持较高水平 。
低温处理时 ,金线兰 4种保护酶活性均发生了
不同程度的变化以抵抗低温逆境 ,SOD保持相对较
高的活性 ,产生较多的 H 2O 2 。胁迫中 APX 活性的
变化大体与 SOD的相似(从 8℃胁迫下两者的变化
可看出),对低温逆境的反应比较迅速 ,活性也有所
增强 ,起着主要清除 H 2O 2的作用 。然而 ,金线兰在
抵抗低温逆境下的全面反应及抗氧化酶活性的调控
机理有待进一步研究。
[ 参 考 文 献]
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(责任编辑:彭　艳)
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