全 文 ：第 24 卷 第 6期
1 9 9 8年 1 2月
作 物 学 报
A C T A A G R O N O M IC A S IN ICA
V
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2 4
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6
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1 9 9 8
球茎大麦在大麦育种上的应用
1
. 大麦单倍体的诱导与加倍单倍体的产生 ’
李浩兵 ` 仲裕泉` 徐 杰` 姚景侠` 黄志仁 2
( ’ 江苏省农科院遗传生理研究所 ,江苏南京 , 别 。。 14 ; “扬州大学农学院农学系 , 江苏扬州 , 2 2 5。。 9 )
提 要 以三种栽培大麦品种为母本 , 三种球茎大麦为父本进行杂交 。 诱导栽培大麦单倍体 , 结
果杂交成胚率平均为 47 . 9% , 幼胚离体培养成苗率平均为 54 . 。% 。 这些胚培苗的根尖细胞染色体数 目
分别含有 7 , 14 , 2 1 条 , 不同组合杂交后代含有的染色体数目不同 , 所有含有 7 条染色体的后代 , 其染
色体 C 一带带型显示为父本栽培大麦的染色体 , 表明该后代为栽培大麦单倍体 , 用滴加 。 . 04 %秋水仙素
的 K n o p 溶液进行单倍体植株的染色体加倍 , 结果加倍率达 90 % 以 _上 , 另外 , 我们还讨沦厂染色体消
失法诱导单倍体的优越性及其机理 。
关链词 单倍体 , 球茎大麦法 ; 基因型 ; 染色体加倍
7。 年代以来大麦单倍体育种研究取得了很大进展 , 单倍体生产技术得到很大改进 , 育种
方法 已基本形成体系 , 在英 、 美 、 加拿大等科学技术比较发达的国家 , 单倍体技术已从实验
阶段进到了实际应用阶段 。 由于大麦属于自花授粉作物 , 其品种一般含纯合基 因型 。 因此 ,
单倍体育种系统具有最大的潜力 , 它可直接产生新品种 , 即通过杂交的重组产物用单倍体法
固定并产生纯合品系 , 然后根据其农艺性状 鉴定和筛选优 良品系 。 与常规杂交育种方法 比
较 , 采用单倍体育种法至少可以缩短 3 ~ 4 个 自交世代 。 例如加拿大育成的第一个高产 、 抗
倒 、 抗白粉病的大麦加倍单倍体品种“ M in go ” , 从杂交到取得种子生产许可证 , 只用了 5 年时
间 ( H o 等 1 9 8 0 ) 。 另一个高产 、 大粒二棱饲用大麦品种 “ R o d e o , , , 从 19 7 5年开始杂交 , 至 1 9 8 3
年发放许可证 , 前后仅用 一了 8 年时间 ( C a m p b el 等 , 1 9 8 4 ) 。 根据国外经验 , 获得较大的单倍
体群体并不困难 , 例如加拿大的 ic b a 一 G ie g y 种子公司 7 个月时间共获得 D H 系 3 5 9 7 份 。 在配
子随机结合下有了这么大单倍体群体 , 选得优 良的 D H 系可能性就更大 。 从选择的效率来看
加倍单倍体比二倍体优越 , 它可以保证基 因是纯合 的 , 所需的性状 不会因后代的分 离而丢
失 。 而且 , 由于 D H 系的纯合是在无田间压力下产生的 , 因而一地生产的 D H 新品系可供多
地利用 ( K as h a 等 , 1 97 5 ) 。 此外 , D H 系还可用于数量遗传 , 基因与环境互作等研究 。 加倍单
倍体群体还是植物 R IF 护 图谱建立和基因定位的极好材料 。
目前生产大麦单倍体的方法有四种 , 即染色体消失法 (球茎大麦法 ) 、 花药培养法 、 孤雌
生殖法 (胚珠培养法 )和单倍体起始基因法 。 由于花药培养法产生的绿苗率很低 ; 胚珠培养法
产生单倍体频率仅达 1% ; 单倍体发生基因法在大麦育种上的应用价值有待进一步研究 , 因
、 国家自然科学基金 , 江苏省应用基础资助项 日
收稿日期 : 29 97一 0 8一 2 0 , 收到修改稿日期 : 1 9 9 8一 0 3一 2 3
6 期 李浩兵等 : 球茎大麦在大麦育种 卜的应用 1. 大麦单倍体的诱导与加倍单倍体的产生 6 6 1
此比较起来 , 仍以球茎大麦法的效果最好 , 国外的研究也比较多 。 国内很少有人开展这方面
的研究 , 我们在以前工作的基础上 , 进 一步研究 r 双亲基因型对球茎大麦法产生单倍体频率
的影响 , 为大麦的单倍体育种技术提供理论基础 。
1 材料与方法
以 3 个栽培大麦品种 ( M a r io n Zn = 14 , S a b a r li S Z n = 1 4 , 苏啤 l 号 Zn = 1 4 )为母本 , 以 3
个球茎大麦类型 ( P B 1 2n 一 1 4 , P B , 2n ~ 14 G B C 1 41 Z n 一 2 8) 为父本进行种间杂交 。 亲本培育在
温室内进行 , 为了使父母本的花期能够相遇 , 对父母本必须进行光 、 温调节控制 , 当栽培大
麦的穗芒刚抽出少许即可整穗去雄 , 套袋隔离 , 去雄后 3 ~ 5 夭授以球茎大麦花粉 , 并在授粉
后第二夭起反复喷以 7 5p p m G A 3 以促进颖果的发育和幼胚的形成 。 一般在 23 ` C生长条件下 ,
授粉后 13 ~ 15 天的胚为适龄胚 , 杂种种子先在 75 ` C酒精中表面消毒 1一 2 分钟 , 然后用 1%
的升汞消毒 10 分钟 , 无菌水洗净 , 超净台上剥取幼胚 , 置于改 良 M S 固体培养基上 , 2 5 C 暗
培养半个 月左右就可成苗 , 出苗后照光半天或 1 天 , 移进 。一 4 C冷库 中越夏 , 10 月上旬出
库 , 置室内阳光充足的地方生长 。 转绿后 , 移到 K n op 溶液中培养 , 3一 4 天即可生出新根 。 取
根后进行染色体加倍处理 : 在 K on p 液中加入秋水仙素 , 使其浓度达 0 . 04 % , 在室温下处理 2
天 , 洗净再培养几天后移栽 。 经秋水仙素处理过的植株在适宜条件下一至二个月后开花 。 其
早期分孽一般都是单倍体 , 后期分孽可有少量结实 , 这些种子称为 D H I 种子 , 由 D H , 种子长
出的植株叫 D H I代 , 在 D H I 植株上 自交结实的种子为 D H : , D H 3 , D H 4… … 依此类推 。 C 分带
处理 , 将胚培苗的根尖或种子发芽后取下的根尖 , 在冰水混合物中冷冻处理 16 小时左右 , 卡
诺氏液 ( 3 : l) 固定 , 醋酸洋红染色 , 45 %醋酸压片 , 液氮冷冻揭片 , 气干 , 45 %醋酸保存过
夜 , 5 ~ 60 C , 45 %醋酸处理 7一 10 分钟 , 5%的 B a ( ) H ) : 处理 3 分钟 , 2只 S S C 溶液处理 5一
7 分钟 , 水洗 , 6 0 : l 的 w r ig h t ` S 液染色适度 , 镜检 , 照相 。
2 结果
2
.
1 杂交胚培的结果
栽培大麦与球茎大麦杂交 、 胚培的结果如表 1所示 , 不同杂交组合成胚率和胚培成苗率
有一定的变化 , 成胚率平均为 47 . 9% , 胚培成苗率平均 为 54 . 。% 。
表 l 栽培大夏 火球茎大夏杂交胚培养结果
T a b l e 1 R e s u l t s o f i n v i t r o e u l t u r e o f e m b r y o s f r o m c r o s砚 5 o f H . 人d g a er X H . bu lbo s u m
组 合 杂交穗数 杂交小花数 成胚数 胚培成苗数
C
r哪 5 N o . o f s p ike s N o . o f f lo r e t s N o . o f e m b r y o s N ( ) . o f s e e d li n g s
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s s e d o b t a i n e d u b t a i n e d
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a r io n 火 P B : ( Zx )
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之王
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s X P B
,
( Zx )
苏啤 l 号火 G B C 14 1 ( 4 x )
合 计
2 1 4 2 0
18 3 6 0
2 0 4 0 0
20 4 (〕O
7 9 15 8 0
10 6 ( 2 5 % )
1 0 6 ( 30 % )
2 8 6 ( 7 1% )
2 5 4 ( 63
.
5 % )
7 5 2 ( 4 7
.
9% )
5 9 ( 5 5
.
7% )
53 ( 5 0
.
0 % )
1 5 4 ( 54
.
7 % )
1 40 ( 5 5
.
1 % )
4 0 6 ( 54
.
0 % )
, 括号内的数字为 百分率 。 F ig u r e s : n p a r e rl t h e s e s 盯 e p e r e e n t a , e s
.2 2 细胞学鉴定结果
2
.
2
.
1 染色体数的 统计结果 根据对不同组合杂交后代染色体数的观察统计 , M ar i o n 只
P B
, 和 M ar io n 又 P B。 的后代细胞中均 为 7 条染色体 , 表明其为单倍体 。 aS ba ilr s x P B : 的杂交
作 物 学 报 2 4卷
后代细胞中染色体数为 1 4, 而苏啤 x G B C 1 41 的杂交后代中 ,
农 2 栽培大交 火球茎大班杂交后代根尖染色体观察 2
.
2
.
2
染色体数为 2 1( 表 2 ) 。
C
一带鉴定结果 用 C一带的
T a b l e 2 C h r o m o s o m e n u m b e r s o f r o t t l P e e l l s in
h y b r id s o f H
.
vu lg a er X H
.
bu lb os u琳
组 合
C r o s s
观察株数
N o
.
o f p la n t s
o b
s e r v e d
观察细胞数
N o o f e e ll s
o b
s e r v e d
染色体数
C h r o rn o s o m e
n u rn b e r
M
a r i o n 义 PB。 ( ZX )
M a r i o n 欠 PB s ( ZX )
S
a
b
a r li
s X P B S ( Z X )
苏啤 l 号 又 G B C 1 4 1 ( 4X ) ;:
方法鉴定这些杂交后代 , 发现单倍体
的根尖染色体带型 (图版 卜 3 , 4) 似
其母本栽培大麦 (图版 工一 1 ) , 未见父
本球茎大麦的染色体 (图版 卜 2 , 图
版 卜 2) , 表明杂种中球茎大麦 的染
色体 已经消失 , 形成了栽培大麦的单
倍体 。 而 S a b a r li s 火 P B : 二倍体杂交后
代中 , 七条染色体的带型似母本栽培
大麦 (图版 n 一 1 ) , 另外七条染色体为
,翻0连月吮才任口d凡h1297n
球 茎大麦染色体 (图版 l 一 3 ) 。 苏啤 火 G B C 14 1 的三倍体杂交后代 C 带分析 (图版 卜 4) 表明 ,
其中七条染色体为栽培大麦染色体 (图版 l 一 2 ) , 另外 14 条染色体则来自父本球茎大麦 (图版
卜 3 ) , 这些结果表明 , 不同基因型的栽培大麦和球茎大麦对诱导产生大麦单倍体具有决定性
的影响 。
2
.
3 染色体加倍
我们对经细胞学鉴定为单倍体和二倍体的杂交后代于 3 ~ 4 葵期 , 选茁壮的幼苗进行秋
水仙碱处理 , 处理前洗净根部泥土 , 剪去离根颈 3 C m 下的须根 , 然后将植株置于玻璃瓶中 ,
加入含有 0 . 04 %秋水仙碱 , 2 % D M s O 及几滴 T w e n 一 20 的 K on p 溶液 , 浸没根部和部分叶
片 。 植株在温室内 ( 白天 20 C )处理 2 天 , 然后移入有轻质土的盆钵中 。 结果表明 , 染色体加
倍的成功率达 90 %以上 。 染色体加倍率提高的原因是采用了 D M S O 作秋水仙碱的载液和改
进植株处理前后的条件 , 其中包括剪根 、 试管加盖倒置等措施 , 保持植株的水分平衡 。
2
.
4 单倍体 、 加倍单倍体的形态特征
单倍体形态似其母本栽培大麦 , 但植株矮小 , 叶片较窄 , 色泽较浅 , 花期提早 , 延续时间
较长 , 基本不育 。 加倍单倍体也似其母本 , 但生长发育正常 。 根据这两种苗的形态特征 , 很容
易对二者加以区分 (图版 l 一 1 , 图版 卜 5 ) 。 我们对二倍体杂交后代进行染色体加倍获得的四
倍体后代表现出较强的生长优势 , 茎粗 、 叶大而厚 、 色深 。 细胞学研究表明其中各有两组栽
培大麦染色体和两组球茎大麦染色体 (图版 卜 4 ) 。
3 讨论
根据徐杰和 J . W . S n aP e ( 1 98 7) 在英国剑桥的研究 , 不同的 ZX 球茎大麦基因型对大麦与
球茎大麦杂种的染色体消失频率有不同的影响 。 有的球茎大麦基因型可以产生 5%左右球茎
大麦染色体不消失的杂种 ; 另一些球茎大麦的基 因型可以产生 1 0 %的大麦单倍体后代 。 前
者可用于导入球茎大麦有利基因的研究 , 后者适用于大麦单倍体育种的研究 。 我们的试验采
用不同的 ZX 栽培大麦基因型与同一个 Zx 球茎大麦材料 P B , 杂交 , 不同杂交组合的单倍体
的诱导频率表现出明显的差异 。 这说明球茎大麦法产生单倍体的频率受双亲基因型的影响 。
据英国剑桥植物育种研究所的研究 , 球茎大麦染色体在胚乳组织中消失速度比在胚细胞
中快 。 在受粉后 24 一 48 小时 , 胚乳和胚细胞的染色体分别出现少量消失 。 受粉后 48 一 72 小
时 , 染色体消失最快 , 到 1 2。 小时 , 有 93 %的中期胚细胞 , 1 0 %的胚乳细胞分别消失了 7 条
6期 李浩兵等 : 球茎大麦在大麦育种 匕的应用 1 . 大麦单倍体的诱导与加倍单倍体的产生 636
染色体 。 可以认为 , 在大麦杂种的胚乳和胚细胞中 , 球茎大麦染色体消失始于结合子后期 。 5
天后在所有分裂细胞中全部或接近全部消失 ( oB n et t 1 97 6 ) 。
从每核染色体平均消失数 目看 , 在胚染色体消失高峰期 (第 3 天 ) , 染色体消失的数目大
于胚乳高峰期 (第 2 天 )消失的数 目。 胚乳和胚在染色体消失速度上的这一差异是与它们本身
发育上的快慢相一致的 。 当这些组织开始合成了相当数量新的细胞质时 , 消失即达到最快速
度 。
随着细胞遗传学研究的深入 , 对染色体消失的可能原因提出了多种假说 。
一是 : 亲本染色体组比率不同 。 当杂种染色体组为 I v ( vu 烤“ er ) : I B (b ul bos u m )时 , bul -
b os u m 染色体消失 。 当染色体组为 I V : ZB 时 , 则产生比较稳定的三倍体杂种 , 最稳定的是具
有 I V : 4B 染色体组的胚乳组织 。 因而认为每一杂种的亲本染色体组的 比率是决定产生单倍
体还是产生杂种后代的决定因素 ( s u b r a hm e n y a m 1 9 7 3 , 2 9 5 2 ) 。
二是 : 亲本遗传因子不平衡 。 由于种间优势差异 , 任何一种杂种染色体的消失 , 不管正
反交 , 都是以一个亲本 (即球茎大麦 )为主 。 据研究 , 控制球茎大麦染色体消失的因子 , 至少
有 3 个 , 存在于大麦 ( H . vu 心“ er )染色体 3 的短臂上和染色体 2 的长臂和短臂上 。 尤其是染色
体 2 长臂上携带的遗传因子 , 对染色体消失起关键作用 。 如果球茎大麦染色体上的因子剂量
足够的话 , 就可以抵 消和平衡大麦因子的效应 , 或以某种方式保护球茎大麦染色体不消失
( H o a n d K a
s
h a 1 9 7 4
,
19 7 5
,
H o 1 9 7 7 )
。
三是 : 两个种的细胞有丝分裂周期不同步 。 分裂周期慢的种染色体率先消失 。 据测定 ,
球茎大麦早期胚每一细胞周期所需的时间为 20 小时 , 比大麦品种几乎慢一倍 。 因而导致球茎
大麦染色体消失频率比大麦染色体大得 多 ( B en ne t 1 9 7 6 ) 。 L an ge 认为 , 有丝分裂的不同步或
影响 D N A 代谢的基因活性及其相互关 系是染色体消失的主要原因 。
四是 : 纺锤体或中心粒异常 。 率先消失的染色体 , 其核仁活性被抑制 , 蛋 白质代谢失调 ,
因而在形成纺锤体蛋白质连接物上不如大麦染色体有效 。 当大麦染色体靠近赤道板中央时 ,
球茎大麦染色体常处于有丝分裂细胞的边缘地 区 。 这种行将消失的染色体的着丝粒一般较
小 , 并常蜕变为核的纺锤体微管 ( S e hw a r z a e h e : 1 9 8 4 ) 。
五是 : 核酸内切酶的作用 。 认为大麦染色体的这一化合物是控制二倍体 、 四倍体杂种中
H
.
bu lb os
u m 染色体消失的因子 。 核酸内切酶能识别外来 D N A , 并使之钝化 , 因而影响其蛋
白质代谢 。 少数真杂种可能是由于球茎大麦染色体位点的表现型改变而使其染色体被保护下
来 ( aD v ie s 2 9 7 4 ) 。
在育种上有意义的是 , 用 1 . va 心a er 作父本 , H . b ul bos “ m 作母本 , 可产生球茎大麦细胞
质的大麦单倍体 。 具有球茎大麦细胞质的植株 , 在早期生长习性中表现出较多的甸甸性 , 上
部节间较短 , 抽穗成熟较晚 , 穗粒数较少 , 粒重较低 。 此外 , 旗叶面积较大 , 叶片光合率提
高 , 但干物质积累速率和出叶速度较低 。 球茎大麦细胞质对麦芽品质以及对大麦染色体有丝
分裂没有多大影响 ( J o h n 、 a n d H a r v e y 1 9 7 4 ; S a d a s i v a i a h a n d K a s h a 29 7 3 ) 。
带有球茎大麦细胞质的大麦植株 , 幼苗期的呼吸速率 , 生长速率及耐性均较低 , 对于早 、
低温和病害 (特别是病毒病 )的反应比较敏感 。 因此育种上都用栽培大麦为母本 , 诱导同质的
栽培大麦单倍体 。 但利用球茎大麦细胞质可以作为选择一些表现型易变或外显率低的性状的
手段 。
6 6 4 作 物 学 报 2 4 卷
参 考 文 献
H o
,
K
.
M
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a ; 、d G
.
E
.
J o n e s
,
19 8 0
,
M i
n即 ba r le y . C a n . J . P la n t S c i , 60 , 2 7 9一 28 0
K a s h a
,
K
.
J
.
a n d E
.
R e i n b e r g
、 , 1 9 7 5 , U t i l iz a t io n o f l , a p l o i d y i n b a r l e y
,
3 0 7一 3 1 5 . I n G e u l ( e d ) B a r le y G e n e t ie s 班
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J
.
a n d J
.
W
.
S n a p e
. ,
1 98 8
,
T h e e y t o lo g y o f h y b r id s b e t w e o n 11
. 二 u lg a r e a n d H
,
bu lb
t) s u从 , G e n o m e , 3 0 ( 4 ) , 4 8 6一
4 9 4
B e n n e t t
,
M
.
I )
. ,
F in
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.
R
.
B
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.
1 9 7 6
,
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Ch r o m o s o n l a
. 5 4 , 17 5 ~ 2 0 0
S u b r a hm a n y a m
,
N
.
C
.
a n d K
.
J
.
K a s h a
,
1 9 7 3
,
S o Ie e t i v e e h r o m o s o m a l e lim i n a t i o n d u r i n g h
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S u b r a h m a n y a m
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N
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C
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1 9 8 2
,
S P e e i e s d o m i n a n e e in e h o m o
s o m c e li m i n a t i o n i n b a r le y h y b
r
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C u r r e n t S e i e n e e
, 5 1 ( 1 )
,
2 8
~ 3 1
H o
,
K
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M
.
a n d K
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J
.
K a 、 h a , l , 7 4 , T e lo t r i s o m i e 、 t u d i e s f o r lo e a t in g g e n e t i e e o n t r o l o f e h r o m o s o m e e lim in a t io n
.
B a r le y
G e n e t ie s N e w
s , 4 , 3 3一 3 6
H
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K
.
M
.
a n d K
.
J
.
K
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a , 一9 7 5 , G e n e t i e e o n t r o l ( ) f e h r o n l o 、 o m e e lim i n a t i o n d u r in g l、 a p l o id fo r m a t i o n i n ba r le y . G e n e t -
ie s
, 8 1 ( 2 )
, 2 6 3一 2 7 5
H o
,
K
.
M
, 1 9 9 7 , G
e n e t i e e o n t r o l o f
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h r o m o s o m c
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lim i n
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( I了o dr o u 。 : v u心 a , I二 ) P . l弓. A , 4 7 , 3 2 6一 3 3 1
L
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1 9 71
,
C r o s
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.
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h a p l o id s a n d d il飞a p lo id s
.
E u ph y t i e a
,
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,
1 4一 2 9
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飞 , 19 8 4 , ( 奋e n o m e e l i n 一i n a t i o n i n lI o r d e u加 h劝 r id s , In C ll r o m o 、 o m e s t o d a y , V o l , 8
( 1 98 4 ) 3 3 9 ~ 3 4 5
T) a v i
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I)
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R
.
1 9 7 4 , (乙h r o m o s t) n l e e lim i n a t i o n in in t e r s p e e i f ie h y br id s . H e r e d i t y , 3 2 , 26 7 ~ 2 7 0
J o h n s
,
W
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A
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.
1 h
a r v e y , 1 9 7连, T h e e f f e e t s o f 月吏j dr e u很 )I “ lb`一、 u饥 l一 ( 飞y t o p la s m o n l . 勺 “ l g a理 I , pp . 2 7 G一 2 7 7 .
I n H a p lo id s in h ig h e r p la n t ,
.
U n i v o f ( ; u e lp h
.
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。 、 t律u z e of 彻r’, b汉明 l’ a l C , n e t元 s a , : d P h y s iol 叹夕 , . 1故n g s u A e a d e m夕 oJ A g r 纪 u l t u r a l S o le n c亡 s , N a , j 动考 , 2 1 0 0 14 )
H u a n g Z h i r e n
(肠如 ; 一m e n t o f A君r o n om y , . J ia n g s u A g r I’ u lt u ar l C ol l ` g ` , Y a o g z h o u [了n沁 e r s lt y , Y a n g z h o “ , 2 2 5 0 0 9 )
A b s t r a c t T h r e e v a r i e t i e s o f H
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u u l g a re a s m a t e r n a l p a r e n t s w e r e e r o s s e d w it h t h r e e v a
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f lo r e t s f o r m e d e tn b r y o s
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p l y i n g t h e e h r o m o s o m e e l im in a t io n t e e h n iq u e w e r e d i s e u s s e d
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K e y w o r d s H a p lo id ; G e n e r a ; T h e e h r o m o s o m e e l im i n a t i o n t e e h n i q u e ; C h r o m o s o m e
d o u b l in g