全 文 ：芦竹内生真菌 F0238对植物病原菌的拮抗作用＊
　＊江苏省高校自然科学基金项目(No.02KJD180010)
　 收稿日期:2003-02-17 , 修回日期:2003-04-22
纪丽莲1 　张强华1 　崔桂友2
(淮阴工学院生物工程系　淮安　223001)1 　(扬州大学旅游烹饪学院　扬州　225001)2
摘要:从黄海海岸低盐药用植物芦竹 (Arundo donax L.)中分离得到木霉属的内生真菌
F0238 , 对其进行拮抗植物病原菌活性及作用机制的试验研究。 结果表明 F0238 发酵液对 Bot-
rytis cinerea , Sclerotium rolfsii 等 8种植物病原菌有强的抑菌活性及抑制孢子萌发作用 , 且这种
作用在发酵原液被稀释了 160 倍后仍然存在;对峙培养试验表明 F0238 菌对植物病原菌有很
强的拮抗作用 , 拮抗机制主要为重寄生作用 、 营养竞争作用及抗生作用等。
关键词:芦竹 , 内生真菌 , 植物病原菌 , 拮抗作用
中图分类号:Q93　　文献标识码:A　　文章编号:0253-2654 (2004)02-0082-05
THE ANTAGONISM OF AN ENDOPHYTICFUNGUS F0238 ISOLATED FROM
ARUNDO DONAX AGAINST PLANT PATHOGENIC FUNGI
JI Li-Lian1 　ZHANG Qiang-Hua1 　CUI Gui-You2
(Department of Bioengineering , Huayin Institute of Technology , Huaian 223001)1
(School of Touring and Cooking , Yangzhou University , Yangzhou 225001)2
Abstract:An endophytic fungus F0238 of Trichoderma was isolated from coastal Arundo donax L..Its antagonism against
plant pathogenic fungi was investigated.Results indicated that the fermentation liquid from strainF0238 showed strong inhib-
itory effect on mycelium growth and spore germination of eight pathogenic fungi including Fusarium graminearum , Botrytis
cinerea , Rhizoctonia solani , Sclerotium rolfsii , Penicillium digitatum , Sclerotinia sclerotiorum , Fusarium solan , Cytospora
chrysosperma , even diluted 160 times.It suggests that the antagonistic mechanism is hyperparasitism , competitive growth
and antibiosis which were confirmed by further experiments of pairing culture.
Key words:Arundo donax L., Endophytic fungi , Plant pathogenic fungi , Antagonism
植物病害是引起农作物品质下降 , 产量损失的主要原因之一 , 而约 80%的植物病
害是由植物病原真菌引起的 。目前对植物病害的主要防治手段是采用化学农药杀菌 ,
而化学农药对人畜的副作用 、 残留问题及污染环境问题已成为当今世界首要解决的问
题之一 。越来越多抗药性病原菌的出现也加速了某些与环境相容性好 , 药效持久 , 无
公害的生物型农药的开发[ 1] 。
植物内生真菌是生长在植物体的根 、茎及叶等组织中的细胞间隙或细胞内的一类真
菌 , 是植物微生态系统中的重要组成成分 。植物内生真菌中广泛分布着抗菌活性菌株 ,
它们在进化过程中形成了丰富的代谢系统 , 能产生众多的抗菌产物 , 并在一定条件下成
为植物病原菌的拮抗菌却不会引起宿主植物明显的病症。自然界约有 25万种植物 , 这样
的植物体就形成了一个巨大的真菌资源库 。因此 , 植物内生真菌为一类很有潜力的生物
防治材料。我们从生长于黄海海岸浅水滩中的低盐芦竹中分离纯化到一株木霉属的内生
菌F0238 , 并对此菌拮抗植物病原菌的作用和机制作了较为系统的研究[ 2] 。
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DOI :10.13344/j.microbiol.china.2004.02.020
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　海岸低盐芦竹 (Arundo donax L.):采自黄海海岸浅水滩。
1.1.2　供试植物病原真菌:小麦赤霉病菌 (Fusarium graminearum Schwabe), 黄瓜灰霉病
菌 (Botrytis cinerea Pers.), 立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani Kǜhn), 细交链格孢菌 (Alterna-
ria alternata(Fries)Keissler), 花生白绢菌 (Sclerotium rolfsii Sacc.), 棉花炭疽病菌 (Colle-
totrichum gossypii Southw.), 柑桔青霉病菌 (Penicillium italicum Wehmer), 油菜菌核病菌
(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.)de Bary), 甘薯干腐病菌 (Fusarium solani (Martius)App.et
Wollenw.), 大麦条纹病菌 (Helminthosporium gramineum Rabenh.ex Schltdl.), 大丽轮枝菌
(Verticillium dahliae Kleb.), 杨树烂皮病菌 (Cytospora chrysosperma (Pers.)Fr.)。
1.1.3　培养基:PDA和 PSA培养基。
1.2　方法
1.2.1　F0238菌的分离与鉴定:芦竹采集后 , 取根茎在无菌条件下去除其表面组织 ,
取内部组织在无菌水中研磨后 , 再取 0.1mL浆液置于含浓 50mg L 庆大霉素的 PDA培养
基中 , 于 28℃下培养至菌丝长出后 , 纯化 , 挑出单菌落接于 PDA斜面上保存 。
1.2.2　F0238菌发酵液的制备:将F0238菌接于 PDA液体培养基中 , 于 28℃, 165r min
摇床培养 1周。发酵液经冻融 , 匀浆后 , 于4 ,000 r min离心 5min , 取上清液备用。
1.2.3　供试植物病原真菌的培养及菌丝块制备:将各供试植物病原真菌在无菌条件下
转接到 PSA 培养基平皿上 , 28℃培养 (立枯丝核菌 , 花生白绢菌于 25℃下培养 , 下
同), 待菌丝长满平皿时 , 用打孔器制成直径为 9mm的菌丝块。另分别以无菌水洗下各
供试斜面菌上的孢子 , 制成 108 cfu mL的孢子悬浮液。
1.2.4　F0238菌发酵液的抗菌谱:采用滤纸片法和双层平板法测定 F0238菌发酵液对
12种供试真菌的抑菌圈直径。即预先配制好含 1.5%琼脂的底层培养基和上层培养基。
先将底层培养基在平皿上浇一层 (约 10mL), 铺平凝固;另取上层培养基置于锥形瓶
中 , 接入供试菌种 , 摇匀 , 立即倒在底层平板上 , 铺平待凝。取经高压灭菌干燥的滤
纸圆片 , 置于 F0238发酵液中浸泡 10min后真空抽干 , 平贴于上层平板表面 , 每种菌做
3皿 , 每皿放 6个滤纸片。各皿置于 28℃ (或 25℃)下培养 72h 后 , 观察有无抑菌圈 ,
并测量抑菌圈直径。
1.2.5　植物病原菌菌丝生长抑制试验:采用生长速率法 , 即将 F0238 发酵液按不同倍
数稀释后与 PSA培养基混合倒入平板 , 于 28℃ (或 25℃)下培养 3d后测量菌落直径 ,
计算抑菌率 (为对照组菌落直径与实验组菌落直径的差占对照组菌落直径的百分比)。
每组实验重复 3次 , 各组数据的差异显著性以 Duncan法检验 (下同)。
1.2.6　植物病原菌孢子萌发抑制试验:将各稀释倍数的 F0238菌发酵液与供试真菌孢
子悬浮液等体积混合 , 滴在玻片孔洞中 , 28℃ (或 25℃)下培养 12h 后 , 镜检孢子萌
发情况。
1.2.7　生长竞争试验:采用两点对峙培养 , 即将 F0238与供试真菌接种在相对的 PSA
平板边缘 , 28℃(或 25℃)下恒温培养 2周 , 连续观察菌落的生长及相互影响情况 。
1.2.8　重寄生作用的测定:挑起上述对峙培养两菌落交界处的菌丝块 , 于光学显微镜
下观察。
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2　结果与讨论
2.1　抗菌谱
F0238发酵液的抗菌谱见表 1。由表 1可知 , F0238除对 Verticillium dahliae , Calleto-
trichum gossypii无抑制效果外 , 对其它 10种供试植物病原菌均有不同程度的拮抗作用。
其中 , 除 Alternaria alternata 和Helminthosporium gramineum 的敏感性稍弱外 , 其它 8支菌
供试菌对 F0238的发酵液均很强的敏感性 , 说明 F0238对植物病原菌具有抗菌活性强 ,
抗菌谱宽的特点 。
表 1　F0238 菌发酵液的抗菌谱
菌株 抗菌活性＊
小麦赤霉病原菌(Fusarium graminearum) ++++
黄瓜灰霉病原菌(Botrytis cinerea) ++++
立枯丝核菌(Rhizoctonia solani) +++
细交链格孢菌(Alternaria alternata) ++
花生白绢菌(Sclerotium rolfsii) ++++
棉花炭疽病原菌(Colletotrichum gossypii) ----
柑桔青霉病原菌(Penicillium digitatum) +++
油菜菌核病原菌(Sclerotinia sclerotiorum) +++
甘薯干腐病原菌(Fusarium solani) ++++
大麦条纹病原菌(Helminthosporium gramineum) ++
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae) ----
杨树烂皮病原菌(Cytospora chrysosperma) +++
＊+　抑菌圈直径<5mm , ++　5～ 10mm , +++　11～ 15mm , ++++　>15mm , ----　无抑菌圈
2.2　菌丝生长抑制实验
表2显示了对F0238敏感的 8株供试真菌在不同稀释倍数的F0238发酵液作用下的
生长情况。F0238发酵液从原液到 160稀释倍对植物病原菌丝的生长均有抑制作用 (与
蒸馏水对照差异显著), 且浓度愈高 , 抑制作用愈强。F0238发酵原液对各供试菌的抑
制率均达到了 70%以上 , 其中对 Botrytis cinerea , Sclerotium rolfsii , Fusarium graminearum
及Fusarium solani的抑制效果最好 , 抑制率达到了 80%以上 。
表 2　F0238发酵液对各供试真菌的菌丝生长的影响
植物病原菌
FLF稀释倍数
CK＊ 原液 SL＊＊ 　　20　　 　　40　　 　　80　　 　　160　　
MD MD IRM MD IRM MD IRM MD IRM MD IRM
F.graminearum 92 16 82.6 25 72.8 36 60.9 52 43.5 72 21.3
B.cinerea 95 15 84.2 23 75.8 37 61.1 52 45.3 68 28.4
R.solani 82 19 76.8 25 69.5 34 58.5 50 39.0 66 19.5
S.rolfsii 80 13 83.8 20 75.0 31 61.3 43 46.3 62 22.5
P.digitatum 93 20 78.5 27 71.0 38 59.2 52 44.1 72 22.5
S.sclerotiorum 83 23 72.3 29 65.1 41 50.6 51 38.6 67 19.2
F.solani 92 17 81.5 24 73.9 36 60.9 53 42.3 67 27.2
C.chrysosperma 89 26 70.8 32 64.0 43 52.7 49 44.9 72 19.1
注:表中数据为 3次重复试验的平均值且各稀释倍数间差异显著 (根据 Duncan多重检验法), ＊ CK control with dis-
tilled water 对照 , ＊＊ SL stock liquid 原液 , MD mycelium diameter (mm)菌落直径 , IRM inhibitory rate to mycelium growth
(%)抑菌率
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2.3　对孢子萌发的抑制效果
F0238发酵液能有效抑制上述 8株敏感真菌的分生孢子的萌发 (表 3)。各供试真菌
的分生孢子在 F0238发酵液的原液完全不能萌发 , 在 20倍的稀释液中 Cytospora chryso-
sperma萌发率最高 (仅为 40.7%), 比对照组降低了 45.1%。F0238发酵液可抑制供试
真菌孢子萌发的最大稀释倍数为 160 , 此时孢子萌发率比对照至少低 6.1%(Rhizoctonia
solani), 方差分析表明两者之间的差异显著;Botrytis cinerea 孢子对 F0238最为敏感 , 在
各稀释倍数下 , 其孢子的萌发率都最低;其次为 Sclerotium rolfsii 。
表 3　F0238 发酵液对植物病原菌孢子萌发的抑制作用＊
稀释倍数
植物病原菌
F.gra. B.cin. R.sol. S.rol. P.dig. S.scl. F.sol. C.chr.
CK 86.1 a 88.5 a 80.5 a 79.6 a 87.4 a 85.2 a 86.9 a 85.8 a
SL 0　 b 0　 b 0　 b 0　 b 0　 b 0　 b 0　 b 0　 b
20 35.0 c 31.3 c 38.5 c 33.5 c 37.9 c 39.2 c 35.9 c 40.7 c
40 53.8 d 50.9 d 57.3 d 52.9 d 55.1 d 58.6 d 54.4 d 60.9 d
80 70.0 e 63.8 e 71.0 e 68.7 e 73.1 e 72.5 e 69.9 e 73.6 e
160 77.5 e 70.7 e 74.4 e 72.7 e 80.9 e 78.1 e 76.3 e 78.6 e
＊以萌发率 (germination rate)表示其为萌发孢子数占总孢子数的百分比 , 表中不同字母标注的数据差异显著 (p<
0.05)
2.4　生长竞争试验
选取对 F0238最为敏感的两株菌 Botrytis cinerea 及Sclerotium rolfsii 分别与 F0238作对
峙拮抗培养试验 , 其生长曲线见图 1和图 2。从图中可以看出 , 约 4d后 , F0238开始包
围 、覆盖病原真菌菌落 , 从而使植物病原菌生长受到抑制 , 面积不再扩展 , 菌落的生
长半径 Rp明显低于对照 R0 , 菌落开始逐渐萎缩 , 在F0238的进一步扩张下最终全部萎
缩 , 整个平板为 F0238所占据 , 并形成大量的绿色孢子 。在两菌的相交界面处还可观察
到一条清晰的拮抗带 , 说明产生了某种抗生物质 。
图 1　F0238-B. cinerea 对峙培养曲线 图 2　F0238-S.rolfsii对峙培养曲线
2.5　重寄生作用
F0238对 Botrytis cinerea 及Sclerotium rolfsii有很明显的拮抗作用 。挑取对峙培养交界
面上的菌丝块镜检 , 镜下可见 F0238的菌丝以各种方式寄生于病菌菌丝上 , 如缠绕在病
菌菌丝上 , 紧贴病菌菌丝生长 , 穿透病菌菌丝和穿入病菌菌丝并在其上生长;同时 ,
F0238菌丝寄生于病菌丝上 , 使病菌的细胞质变稀薄而不能正常生长;当 F0238菌丝与
病菌菌丝平行生长时 , 产生分枝吸附于病菌菌丝上 , 进行侵入 、 穿透 , 并通过酶的作
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用分解菌丝细胞壁 , 使之消解 。由此可见 , F0238对植物病原真菌的重寄生作用是其拮
抗病菌的主要作用机制。
2.6　结论
F0238经鉴定属于木霉属菌 (Trichoderma)。据文献报道木霉菌对某些植物病原菌有
拮抗作用[ 3 ～ 7] 。综合本研究结果可知:(1)F0238对植物病原真菌有良好的拮抗性能 ,
是一种广谱性的拮抗真菌;(2)F0238生长速度快 , 具较强的营养竞争能力 , 生长竞争
力强 , 即使在先接种病原菌的情况下 , 仍能占据绝大部分营养空间 , 从而使病原真菌
菌落最终萎缩。这说明了 F0238菌的营养竞争作用是其拮抗植物病原真菌的重要拮抗机
制。此外 , F0238在生长过程中产生了某些抗生物质 , 从而抑制病菌孢子萌发及菌丝生
长 , 达到抑菌效果;(3)F0238的重寄生作用是其拮抗病菌的主要机制。它通过缠绕 、
穿透 、侵入 、吸附等多种寄生方法侵入病原菌菌丝 , 并通过酶的作用消解病菌细胞壁;
(4)许多文献报道木霉菌在对病原真菌的拮抗及重寄生过程中 , 几丁质酶及抗生素起着
重要作用 , 如几丁质酶的消解和杀死病菌 , 抑制孢子萌发 、芽管伸长和菌丝生长作用 ,
诱导产生防卫素等[ 8 ～ 10] 。F0238是否产生几丁质酶及抗生素目前尚在试验中 。
参 考 文 献
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·论文写作要点·
高等院校教学论文的撰写要点
“高等院校教学” 是微生物学会主办的科技期刊中唯一的教学栏目 , 是专门为高等院校教师开辟
的教学交流 、 切磋 、 提高的园地 , 栏目特色非常突出。因此 , 要求作者撰写的内容必须有新意 , 绝不
是泛泛地谈体会和叙述教学安排与过程。在内容选材上应该有鲜明的特点和针对性 , 做到主题明确 、
重点突出 、 层次分明 、 语言流畅。教师的教学思路应与时俱进 , 及时将国内外新的科技成果贯穿到教
学始终 , 只有这样才能真正起到教与学的互动 , 提高高科技人才培养的水平。同时 , 稿件的录用率也
能得到提高。
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