全 文 :1.3 3-(2-甲氧基-5-甲基苯基)-3苯基正丙醇(4)的制
备 将(3)230g(0.809mo l)溶于 530mL干燥的四氢呋喃中 ,滴加
入四氢铝锂30.9g(0.814mol)和 575mL干燥四氢呋喃的混合液
中,室温搅拌 1h , 然后加热回流 4h , 缓慢加入 30.9g 水, 滴加
15%的氢氧化钠溶液至形成白色粒状沉淀 ,过滤 ,除去溶剂, 残
余物用850mL二氯甲烷溶解, 3×270mL水洗涤,无水硫酸钠干
燥,蒸去溶剂,得油状物(4)138.5g ,收率 90.8%。
1.4 对甲苯磺酸 3-(2-甲氧基-5-甲基苯基)-3-苯
基正丙基酯(5)的制备 将(4)138.5g(0.54mol)溶于 400m L
二氯甲烷和 100m L吡啶混合液中 , 冷却至-10℃,加入对甲
苯磺酰氯 103g(0.54mo l), 反应液置于冰箱中(5℃),放置过
夜。将反应物倾入 1500m L 冰水中 , 有机相用 2N 盐酸
400mL 洗涤 , 水洗 , 无水硫酸钠干燥 , 减压除去溶剂 , 用异丙
醚和石油醚的混合溶剂重结晶 ,得白色结晶(5)212.3g , 收率
95.7%, mp:63.2 ~ 64.1℃。
1.5 N , N-二异丙基-3-(2-甲氧基-5-甲基苯基)-3
-苯基丙胺基(6)的制备 将(5)212.3g(0.52mol)溶于
500mL 乙腈中 , 加入 525mL(5.2mo l)二异丙胺混匀。 加热
至 80℃, 3kg 压力下搅拌 12h , 蒸去溶剂 , 残余物加入 400m L
2N 氢氧化钠溶液 , 用 850mL 乙酸乙酯提取 , 20%氯化钠溶
液 300m L洗涤 , 用 800m L 2N 盐酸提取 ,提取液再用 300m L
乙酸乙酯洗涤 , 水层用 10%氢氧化钠碱化至 pH13 , 用
800mL 乙酸乙酯提取 , 20%氯化钠溶液洗涤 , 无水硫酸钠干
燥。活性炭脱色 ,过滤 , 蒸去乙酸乙酯 ,得深红色油状物(6)
120.0g , 产率 80.7%。
1.6 N , N-二异丙基-3-(2-羟基-5-甲基苯基)-3-
苯基丙基胺(7)的制备 取(6)120.0g(0.35mol)溶于 800m L
二氯甲烷中 , 冷却至 0℃。 将 1N BBr3 的二氯甲烷溶液
350mL(350mol)滴加于上述胺液中 , 在冰箱中5℃放置 2 天 ,
蒸去溶剂 , 残余物用 145m L10%氢氧化钠溶解并碱化至
pH13 ,用 550mL 乙酸乙酯提取 , 20%氯化钠溶液洗涤 , 无水
硫酸钠干燥。过滤蒸去溶剂得深红色油状物消旋体游离碱
(Ⅵ)44.2g ,产率为 86.1%。
1.7 酒石酸托特罗定的制备 消旋体游离碱(Ⅵ)120.0g
(0.37mo l)溶于 400m L无水乙醇 , 与 L(+)-酒石酸 55.5g
(0.55mol)的 400mL 无水乙醇液混合 , 回流搅拌1h ,冷却 , 于
4℃下放置 , 析晶过夜。过滤 , 无水乙醇洗涤 , 得成品粗品
84.7g ,收率 48.3%。用乙醇重结晶得精品 62.8g , 精制收率
65.1% ,m p:210 ~ 212℃。
2 结果与讨论
在化合物 N , N-二异丙基-3-(2-甲氧基-5-甲基
苯基)-3-苯基丙胺基(6)合成过程中 ,文献[ 4]不仅收率低
(68%)而且反应时间长 , 4~ 6 天 , 我们选择了在加压条件下
胺化引入氨基 , 不仅提高了收率(80.7%)还大大缩短了反应
时间 , 从而降低了操作工时。
在化合物 N , N-二异丙基-3-(2-羟基-5-甲基苯
基)-3-苯基丙基胺(7)的制备中 , 文献[ 4]是用吡啶盐酸盐
来脱甲基的 , 此反应需在高温下进行 , 且对工业化生产的设
备要求太高。我们改用高活性的 BBr3 , 0℃在二氯甲烷(重
蒸)中反应 ,效果较好。
经过不断的摸索和改进 , 酒石酸托特罗定整个合成工艺
操作稳定性好 , 安全性高 ,收率高 , 且该工艺已顺利完成中试
试生产 , 生产成本有了大幅度下降 , 能完全适应工业化大生
产的要求。
参考文献
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圆锥乌头多糖脱蛋白及抗 HIV-1 RT活性研究
袁晶 ,徐晓婷1 ,徐凌川1
(山东中医药大学附属医院 ,山东 济南 2500142;1.山东中医药大学生药系 , 山东 济南 250355)
摘要:目的 从圆锥乌头 Aconitum paniculige rum Nakai 中提取多糖 , 并研究圆锥乌头多糖体外抗 HIV -1 逆转录酶
(H IV-1 RT)的活性。方法 利用水提醇沉法从圆锥乌头中提取多糖 , 加入胰蛋白酶脱除粗多糖中的蛋白质 , 通过苯酚硫酸
法计算粗多糖中的多糖含量 ,通过考马斯亮蓝法计算蛋白脱除率。以奈韦拉平为阳性对照药测试圆锥乌头多糖体外抗 H IV
-1逆转录酶(H IV-1 RT)的活性。结果 圆锥乌头粗多糖质量百分得率为 18.86%;最佳蛋白脱除方法为加入粗多糖量
30%的胰蛋白酶 ,脱除率达到 89.2%;对 H IV-1逆转录酶(H IV-1 RT)的半抑制率 IC50为 95.04μg ·mL-1。结论 圆锥乌
头药材中粗多糖含量比较高且具有抗 HIV-1逆转录酶(H IV-1 RT)的活性。
关键词:圆锥乌头多糖 苯酚硫酸法 脱蛋白 艾滋病毒-1逆转录酶
中图分类号:R961 文献标识码:A 文章编号:1672-7738(2010)05-0303-04
·303·齐鲁药事·Qilu Pharmaceutical Af f airs 2010 Vol.29 , No.5
Study on removing protein and anti-HIV-1 RT activity of Aconitum panicul igerum Nakai polysaccharide
YUAN Jing ,XU Xiao-ting1 ,XU Ling-chuan1
(Affiliated Hospital of Shandong Univer sity of T raditional Chine se Medicine , Ji′nan 250014;
1.Shandong Univer sity o f T raditional Chinese Medicine , Ji′nan 250355)
ABSTRACT:OBJECTIVE Ex traction the polysaccha ride from Aconitum paniculige rum Nakai and stydy ing its activity o f
anti-HIV-1 RT activity.METHODS Using aqueous ex traction-alcohol precitation and adding trypsinase removing pro tion o f
the poly saccha ride from Aconitum paniculig erum Nakai.The content of crude polyccharide is obtained by phono l-sulphuric a-
naly sis.Counting the pro tein eliminated rate by coomassie brilliant blue analy sis.The anti-H IV-1 RT activity is measured com-
paring with NVP.RESULTS The ex traction rate o f crude poly saccharide w as 18.86%;The best way to elimina te protein w as
adding trypsinase at 30%w eight of polysaccharide and the pro tein eleminated ra te wa s 89.2%;The IC50 of anti HIV-1 RT ac-
tivity w as 95.04μg·m L-1.CONCLUSION The content of crude polyccharide was high and ha s the ability o f anti HIV-1 RT
activity.
KEY WORDS:Aconitum paniculig erum Nakai poly saccharide;phonnl-suiphuric analy sis;depro teinization;HIV-1 RT
圆锥乌头(Aconitum paniculi gerum Nakai )为毛茛科
植物圆锥乌头的干燥块根 ,资源较丰富 , 该块根在吉林 、辽宁
等地作草乌用[ 1] ,中药乌头性热 , 味辛 、苦 , 大毒 ,用于治疗风
寒湿痹 ,关节疼痛 , 心腹冷痛 ,寒疝作痛等症 , 具有麻醉止痛
之功效。目前关于乌头(A.camichaeli)研究的较多 , 对圆
锥乌头研究却较少[ 2] 。药理研究表明 ,从乌头水提物中得到
的乌头多糖 A 、B 、C 、D 均具有降血糖作用[ 3] , 而圆锥乌头多
糖尚无研究报道。
圆锥乌头粗多糖中含有一定量的蛋白质 ,影响多糖的纯
度 ,常用的 sevag 法除蛋白时效果较好 , 但缺点是需要反复
多次 ,有机溶剂消耗大 , 流程长 , 多糖损失严重 ,脱蛋白后的
多糖得率低[ 4 ~ 5] 。蛋白酶法对多糖的损失率较少 ,由于酶的
降解作用 ,使得大部分的游离蛋白质和部分结合蛋白水解 ,
从而降低了多糖随凝胶物沉淀而损失的可能 ,多糖的得率提
高 ,蛋白脱除率高[ 6] 。
圆锥乌头多糖的抗逆转录酶活性试验是将 HIV-1 逆
转录酶作用的模板包被在酶标板上 ,在最适酶反应条件和反
应体系中 ,H IV-1 RT 可将含有 Bio tin-dUTP 底物加到反
应模板上 ,用链亲和素标记过的辣根过氧化物酶检测酶反应
产物中 Biotin-dUTP 掺入量来反映酶的活性 ,在反应体系
中加入脱蛋白后的圆锥乌头多糖用于筛选该酶的抑制剂。
1 仪器与材料
1.1 主要仪器 电热恒温水浴锅(北京科伟永鑫仪器厂);
KQ-250E型医用超声清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公
司);LD4-2A 低速离心机(北京医用离心机厂);UV-3010
紫外分光光度仪(日本日立);ZK-92A 型电热真空干燥箱
(上海实验仪器厂有限公司)。
1.2 试剂 葡萄糖对照品(北京益利精细化学品有限公司),
牛血清蛋白(生工生物工程有限公司), 考马斯亮蓝 G-250
(生工生物工程有限公司)其它试剂均为分析纯。
1.3 实验材料 实验药材采集于山东济南历城区梯子山 , 经
山东中医药大学生药系徐凌川教授鉴定为毛茛科圆锥乌头
A.paniculi gerum Nakai块根 。
2 方法与结果
2.1 多糖的提取
2.1.1 供试品的制备:精密称取乌头粉末 10g , 加入 150mL
95%的乙醇超声提取 40min 脱脂后 , 用蒸馏水超声提取多
糖 , 加入 150m L蒸馏水超声 40min 后离心 , 取上清液 , 残渣
加入 150mL 蒸馏水超声提取 40min 后离心合并两次提取
液 , 浓缩至一定体积 , 加无水乙醇至含醇量为 80%, 静置
24h ,析晶 , 离心 ,弃上清 , 得沉淀即为粗多糖 , 分别用无水乙
醇 , 乙醚 ,丙酮洗涤 , 真空干燥至恒重 , 得粉末即为圆锥乌头
粗多糖。
2.1.2 对照品溶液的制备:精密称取 105℃干燥至恒重的葡
萄糖 50mg , 置 50m L 容量瓶中 , 加水溶解并稀释至刻度 , 摇
匀 , 即得质量浓度为 1mg ·mL -1的对照品溶液。
2.1.3 苯酚的制备:称取 100g 苯酚 , 铝片 0.1g , 碳酸氢钠
0.05g ,蒸馏 ,收集 182℃馏分 , 取此馏分 5g , 加蒸馏水 95mL ,
置棕色瓶中备用 , 得浓度为 5%的苯酚溶液(注:此溶液需现
用现配)。
2.1.4 最大吸收波长的选择:精密吸取对照品溶液 1mL , 加
水定容于 50m L 容量瓶中 , 摇匀。 吸取 2mL 于试管中 , 加
5%苯酚 1mL 摇匀后 , 快速加入浓硫酸 5m L 静置 10min ,
60℃水浴加热 30min , 冷却至室温 , 另以未加葡萄糖的溶液
为参比 , 分别于 400 ~ 600nm 范围内扫描 , 测得最大吸收波
长为 490nm。
2.1.5 标准曲线的绘制:精密移取葡萄糖对照品溶液 0.6、
0.9、1.2、1.5 、1.8 、2.1m L , 分别置于 50mL 容量瓶中 , 加水
·304· 齐鲁药事 Qilu Pharmaceuti cal Af f airs 2010 Vol.29 , No.5
稀释至刻度摇匀 ,分别精密量取 2mL 于具塞试管中 , 以 2m L
蒸馏水做空白 ,每管加入 5%苯酚溶液 1 mL , 再快速加入浓
硫酸 5m L静置 10min , 60℃水浴加热 30min , 冷却至室温后
分别于 490nm 处测定吸光度。以浓度(C)为横坐标 , 吸光度
(A)为纵坐标 , 得回归方程:Y =14.433 X -0.0962 , r =
0.9979。
2.1.6 粗多糖中多糖的含量测定:分别精密称取干燥至恒重
的乌头粗多糖 0.1g ,定容于 100m L容量瓶中 ,加水溶解至刻
度 ,摇匀 , 精密量取 4m L 加水定容于 50m L 容量瓶中 , 作为
供试品溶液。精密量取供试品溶液 2mL 于试管中 , 按标准
曲线项下操作 ,测定吸光度。根据标准曲线求得粗多糖中的
多糖质量浓度由此可得到粗多糖中多糖的质量百分含量。
2.1.7 换算因子测定:精密称取干燥至恒重的圆锥乌头多糖
粉末 50.62mg ,置于 50m L容量瓶中 , 加水溶解至刻度 , 摇匀
备用。精密移取该溶液 4.0m L , 定容于 50m L 容量瓶中 , 即
得待测液。精密吸取待测液 2m L 加入试管 , 按标准曲线项
下操作 , 测得 A=0.232 , 根据标准曲线计算出粗多糖中葡
萄糖的浓度 ,按下式计算出换算因子 , F=W/C×D 式中 W
为粗多糖的重量(mg), C 为多糖中葡萄糖的质量浓度(mg ·
mL-1), D 为多糖的稀释因素 ,测得 F=1.78(n =6)。
2.1.8 方法学考察:
2.1.8.1 精密度试验:精密量取对照品溶液(质量浓度 1mg
·mL-1)2.0m L , 6 份 , 按标准曲线绘制方法操作 , 测定吸光
度 ,计算 RSD =0.50%(n =6), 表明方法的精密度良好。
2.1.8.2 稳定性试验:取供试品适量 , 按照“ 2.1.6”项下的方
法 ,测定吸光度 A 值 , 每隔 15min 测定 1 次 , 共测 6 次。RSD
=1.03%, 表明供试品在 1.5h 内稳定。
2.1.8.3 重现性试验:取同一样品粉末 3g , 6 份 , 按样品测定
方法操作 ,测定计算多糖含量 , 求得 RSD =1.08%, 结果表
明方法的重现性良好。
2.1.8.4 回收率试验:取同一样品粉末 3g , 6 份 , 精密称定 ,
精密加入干燥至恒重的无水葡萄糖对照品 40mg , 按样品测
定方法 ,制备溶液并测定吸光度值并通过换算因子折算 , 计
算多糖回收率(回收率=测得量-样品含量/葡萄糖加入量
×换算因子)。得回收率=99.12%, RSD =2.34%。
2.2 脱蛋白工艺 蛋白质具有与多糖相似的溶解性 , 采用水
提醇沉法所提得的多糖中常含有一定量的蛋白质 ,因此要对
多糖进行脱蛋白研究 , 本实验利用胰蛋白酶进行脱蛋白 , 以
蛋白脱除率为指标优选最佳酶的用量。
2.2.1 蛋白标准曲线的制备[ 7] :称取牛血清蛋白 25mg , 置
10mL容量瓶中 ,加水溶解后稀释至刻度 , 取 0.5mL ,加水定
容至 10mL 容量瓶中 , 作为贮备液。 分别吸取贮备液 0.2 ,
0.3 , 0.4 , 0.5 , 0.6 , 0.8m L , 加水稀释至 1mL , 向各管中加入
5mL 考马斯亮蓝 G-250 溶液 , 混合均匀后 , 30℃水浴加热
5min ,以水为空白 ,在 595nm 波长处测定吸光度 , 得吸光度
蛋白含量方程为 Y =28.77 X +0.1458 , r =0.9967。
2.2.2 粗多糖中蛋白的测定:取粗多糖粉末 1g , 定容于
250m L容量瓶中 ,分装于 5 个 50mL 容量瓶中 , 放入 37℃水
浴锅中预热 10min , 分别按照粗多糖量的 20%, 30%, 60%,
90%, 120%加入胰蛋白酶 ,置于 37℃水浴锅中 30min , 时时
振摇 , 后放入 100℃水浴锅中灭酶 20min ,冷却至室温 , 抽滤 ,
得脱蛋白多糖溶液进行测定 , 结果见下图。
由图可得胰蛋白酶加入量为粗多糖的 30%时蛋白脱除
率最大 , 根据标准曲线计算的脱除率为 89.2%。
2.3 体外抗 HIV-1 逆转录酶(HIV-1RT)活性筛选。
2.3.1 样品前处理:用前溶于 DMSO 配成适当浓度 , 并用双
蒸水作 5 倍稀释 , 各 5 个稀释度。
2.3.2 测试方法:以奈韦拉平(NVP)为阳性对照药 , 样品稀
释后加入含有 Bio tin-dUTP和基因工程靶酶的反应 Buffer
中 , 在最佳反应条件下孵育 ,以亲和素标记的辣根过氧化物
酶系统显色 , 测定 OD450值。
2.3.3 圆锥乌头多糖体外抗 H IV-1 逆转录酶(HIV-1RT)
活性测试结果。
样品 初始浓度(μg ·mL-1) IC50(μg·mL-1)
APPS 200 95.04
NV P 1.6 0.26
注:本实验在上海国家新药筛选中心完成
3 讨论与结论
乌头属药用植物资源非常丰富 , 我国约有 162 种[ 8] , 我
省有 3 种 , 1 变种[ 9] 。其中圆锥乌头在山东省仅分布于济南
历城梯子山一带 , 是一种重要的药用植物资源。过去乌头属
植物仅用于祛风湿 、止痛 、回阳 、逐冷等 , 近年来研究证明乌
头有抗肿瘤作用[ 10]和降血糖作用[ 11] , 而圆锥乌头药理作用
尚无任何研究报道。本文首次对圆锥乌头多糖进行了提取
和脱蛋白工艺的研究 , 首次报道了圆锥乌头多糖具有一定的
抗艾滋病逆转录酶活性。这一实验结果增添了传统中药抗
艾滋病研究的新内容 , 是乌头多糖药理作用的新发现。另据
报道 , 来源于 Aconitum carmichaeli 的附子多糖经过小鼠淋
巴细胞增值试验显示具有免疫增强作用[ 12] , 这说明乌头类
药材的多糖类成分具有治疗艾滋病所需要的两方面的药理
活性 , 很有可能成为一种新的抗艾滋病药物 , 有必要对其进
行深入研究。
参考文献
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丹参注射液安全性检查方法的建立
梁玉景 ,华伟 ,孙青虎
(山东华信制药集团股份有限公司 , 山东 菏泽 274000)
摘要:目的 建立丹参注射液过敏反应 、异常毒性检查限值及检查方法。方法 通过丹参注射液最大无毒性反应剂量研
究 ,确定过敏反应检查限值;通过丹参注射液半数致死量的研究确定异常毒性检查限值;检查方法均沿用《中国药典》 2005 年
版(一部)。结论 限值设置合理 ,方法准确 , 能如实反应药品的安全性。
关键词:丹参注射液 安全性检查 过敏反应 异常毒性
中图分类号:R927.11 文献标识码:A 文章编号:1672-7738(2010)05-0306-02
Study on the safety of Radix et rhizoma salviae miltiorrhizae Injection
LIANG Yu-jing ,HUA Wei , SUN Qing-hu
(Shandong Huaxin Pharmaceutical G roup Co., L td.,H eze 274000)
ABSTRACT:OBJECTIVE To establish detection limits and detection methods of allerg ic r eac tions and abnormal toxicity
of Radix et rhizome salviae miltio rrhizae Injection.METHODS By studying on the Maximum NOAEL o f Radix et rhizome
salviae miltior rhizae Injection determined the detection limit;By studying on the LD50 of this injec tion identified abno rmal tox ic-
ity de tec tion limit;Detection methods have been using in the Chinese Pharmacopoeia 2005 Edition 1.CONCLUSION The limits
se tted is rea sonable;The method is accurate and can responses to the drug′s safety really.
KEY WORDS:Radix e t rhizome salviae miltio rrhizae Injection;detection o f safety;alle rgic reaction;abno rmal to xicity.
丹参注射液收载于卫生部中药成方制剂第二十册 , 活血
化瘀 ,通脉养心。用于冠心病胸闷 , 心绞痛。临床给药途径
及剂量为“肌内注射 , 一次 2~ 4mL , 一日 1~ 2 次;静脉注射 ,
一次 4m L(用 5%葡萄糖注射液 20mL 稀释后使用), 一日 1
~ 2 次;静脉滴注 ,一次 10~ 20m L(用 5%葡萄糖注射液 100
~ 500mL 稀释后使用), 一日 1 次。”临床最大剂量为静脉给
药 0.5g · kg-1 。依据中药注射剂安全性检查法应用指导原
则(《中国药典》 2005 年版一部附录Ⅹ Ⅷ B)、《中国药典》2010
年附录Ⅹ Ⅷ B 以及《化学药物急性毒性试验技术指导原
则》 , 现于标准中增订过敏反应和异常毒性项。
1 最大无毒性反应剂量确定
1.1 试验材料 供试药物:丹参注射液 , 规格 2m L/支 , 1.5g
生药/ mL。批号:09080401 、09080402、09080403 , 山东华信制
药。动物:小鼠 ,体重 17~ 20g ,山东鲁抗医药股份有限公司
SCXK(鲁)20080002。动物饲养环境 温度:20 ~ 25℃, 湿度
40%~ 70%。饲料:山东省实验动物中心。 设备与用具:消
毒锅 、鼠盒 、试管架 、秒表 、天平 、75%酒精棉球 、镊子 、鼠固定
器 、烧杯 、注射针头 、注射器。
1.2 试验方法 固定剂量法。
1.2.1 供试品溶液的制备:取丹参注射液(09080401 批)加氯
·306· 齐鲁药事 Qilu Pharmaceuti cal Af f airs 2010 Vol.29 , No.5