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改良差示酚硫法测定红松松塔多糖的含量
王薇薇，张曜武＊，龙堂荣，魏焕焕 （青岛科技大学化工学院，青岛 ２６６０４２）
摘要：目的　建立红松松塔多糖含量测定方法。方法　采用改良差示酚硫法测定红松松塔多糖含量。结果　多糖溶液沸水浴
３０ｍｉｎ水解完全，显色液预配，用量为５．０ｍＬ；显色后的待测液在２ｈ内稳定；测定波长λｍａｘ＝４９０ｎｍ；线性范围为３．５７～２１．４２
μｇ·ｍＬ
－１，ｒ＝０．９９９；回收率为９８．３％，ＲＳＤ为１．０６％。结论　该方法可用于红松松塔多糖的含量测定，含杂质的样品不必进
行繁琐的预分离纯化，方法简便、准确，重复性好。
关键词：多糖；苯酚硫酸法；改良差示酚硫法；含量测定；红松松塔
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－２４０７．２０１３．０４．００５
中图分类号：Ｒ２８４　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００４－２４０７（２０１３）０４－０３４０－０３
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　ｐｉｎｅ　ｃｏｎｅ　ｏｆ　Ｐｉｎｕｓ　ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ　ｂｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ－
ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｈｅｎｏｌ　ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ
ＷＡＮＧ　Ｗｅｉｗｅｉ，ＺＨＡＮＧ　Ｙａｏｗｕ＊，ＬＯＮＧ　Ｔａｎｇｒｏｎｇ，ＷＥＩ　Ｈｕａｎｈｕａｎ（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｑｉｎｇｄａｏ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６０４２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　ｐｉｎｅ　ｃｏｎｅ　ｏｆ　Ｐｉｎｕｓ　ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ　ｏｒ　ｆｒｏｍ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　ｐｉｎｅ　ｃｏｎｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｈｅｎｏｌ　ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ．
Ｒｅｓｕｌｔ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｗｅｒｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ　ｔｏ　ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｉｎ　ｂｏｉｌｉｎｇ　ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈ　ｆｏｒ　３０ｍｉｎ．５．０ｍＬ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｒ　ｌｉｑｕｉｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ．
Ｔｈｅ　ｃｏｌｏｒ　ｗａｓ　ｓｔａｂｌｅ　ｗｉｔｈｉｎ　２ｈ；ｔｈｅ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ　ｗａｓ　ｌｉｎｅａｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｆｒｏｍ　３．５７ｔｏ　２１．４２μｇ·ｍＬ
－１，ｗｉｔｈ　ｒ　０．９９９．Ｔｈｅ
ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｗａｓ　９８．３％ ｗｉｔｈ　ＲＳＤ　１．０６％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ－ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｈｅｎｏｌ　ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
ａｎｄ　ｒｅｐｅａｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　ｐｉｎｅ　ｃｏｎｅ　ｏｆ　Ｐｉｎｕｓ　ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ　ａｎｄ　ｆｒｏｍ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ
ｔｈａｔ　ｃｏｎｔａｉｎ　ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｐｈｅｎｏｌ　ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ；ｉｍｐｒｏｖｅｄ－ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｈｅｎｏｌ　ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ；ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ；ｐｉｎｅ　ｃｏｎｅ　ｏｆ
Ｐｉｎｕｓ　ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ
作者简介：王薇薇，女，硕士研究生
＊通信作者：张曜武，男，副教授
　　红松（Ｐｉｎｕｓ　ｋｏｒａｉｅｎｓｉｓ）系松科（ｐｉｎａｃｅａｅ）松属
（Ｐｉｎｕｓ）植物，是我国东北地区重要的松属树种。红
松松塔中含有酸性多糖，民间很早以前就流传用松塔
煮水治疗胃癌的说法，现代研究已证明该多糖具有较
强的抗肿瘤、抗病毒等作用［１］。
　　苯酚硫酸法为多糖含量测定的常用方法［２］。１９５１
年Ｄｕｂｏｉｓ　Ｍ等学者所发表的苯酚硫酸法在多糖定量分
析的研究中具有非常重要的意义［３］，至今仍被广泛应用
于多糖成分含量测定。该法适用于测定高纯度多糖成
分，在测定含有杂质的多糖样品时误差较大；并且不同
时间不同操作人员操作时所测数据常有差异；此后不断
有研究者对苯酚硫酸法进行了诸多改进，其中徐光域
等［４］发表的预配显色液的改良苯酚硫酸法，以及贺福元
等［５］建立的差示苯酚硫酸法皆取得重要进展，有效克服
了传统酚硫法应用中存在的部分问题［４－６］。
王超等［６］在综合吸收以上各方法优点的基础上
进一步做出改进，弥补了传统酚硫法、改良酚硫法和
差示酚硫法的不足，建立了一种新方法———改良差示
酚硫法，该方法可用于含有杂质的多糖样品的定量分
析，既能简化多糖样品预处理，避免繁琐操作和容易
伴随的多糖成分丢失，又能减少非糖杂质的干扰，同
时还能克服原有方法在显色反应中因浓硫酸放热而
导致的诸多难点，从多方面减少了分析误差，提高了
定量分析结果的稳定性、重复性和准确性。
本实验中又尝试将改良－差示酚硫法用于红松松
塔中多糖成分的含量测定，该研究尚未见文献报道。
１　原理
　　改良差示酚硫法，首先将苯酚、水、硫酸预配显色
液［４］，从而避免显色过程中因浓硫酸放热反应而导致
的误差因素，多糖样品与该显色液显色后可测定吸光
度Ａ１。
　　此后再测定吸光度Ａ２［５］：先将多糖样品与浓硫
酸反应生成糠醛衍生物，冷却至室温以下再加苯酚，
在室温条件下多糖不与苯酚反应生成黄棕色缩合物，
此时测到的吸光度Ａ２仅代表多糖以外的杂质成分的
吸收，Ａ１与Ａ２两者之差即为样品中多糖成分吸光度，
该测定值已消除了共存的其他非糖成分的干扰，因而
本方法可用于含有杂质的多糖样品的定量分析。
２　仪器与试药
２．１　仪器　ＦＡ１００４Ｎ型电子天平（上海精密科学仪
器有限公司）；ＴＧＴ－１６Ｃ型台式高速离心机（上海安
亭科学仪器厂）；Ｔ６新世纪紫外－可见分光光度计（北
京普析通用仪器有限公司）；ＤＺＦ－６０５１型真空干燥箱
（上海一恒科学仪器有限公司）。
２．２　试药　红松松塔多糖样品（自制）；乙醇、石油
０４３ 西北药学杂志　２０１３年７月　第２８卷　第４期
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醚、无水乙醚、浓硫酸、苯酚及其他试剂均为分析纯。
３　方法与结果
３．１　松塔粗多糖的初步纯化　在本方法初始阶段先
后用石油醚、乙醚、乙醇将多糖样品粉末进行简便的
洗涤、离心处理，得初步精制的多糖样品，由此可减少
大部分脂溶性杂质、单糖及低聚糖等成分的干扰［６］。
３．２　溶液的制备
３．２．１　样品溶液的制备　将３．１项所得初步精制的
多糖样品置于锥形瓶中，加５０ｍＬ蒸馏水，于沸水浴
中加热使多糖溶解，趁热过滤，并用热水冲洗锥形瓶
和滤渣，将洗液、滤液混合，转移至１００ｍＬ量瓶中，
稀释，摇匀，定容即得。
３．２．２　对照品溶液的制备　精密称取１０５℃干燥
至质量恒定的葡萄糖５０ｍｇ，置于１００ｍＬ量瓶中，加
蒸馏水稀释至刻度。
３．２．３　其他溶液的制备　显色液：将２０ｍＬ浓硫酸
缓缓加入４ｍＬ蒸馏水中并冷却至约２５～３０℃，加
入０．２４ｇ苯酚晶体，搅拌溶解即得。（该显色液应临
时现配，苯酚晶体在棕色称量瓶中称量）。
　　５０ｇ·Ｌ－１苯酚溶液：称量０．２５ｇ苯酚晶体溶于
５ｍＬ蒸馏水中即得（棕色瓶保存）。
　　８３３ｍＬ·Ｌ－１硫酸溶液：取１０ｍＬ浓硫酸加入
２ｍＬ蒸馏水中混匀即得。
３．３　实验条件的考察
３．３．１　最大吸收波长的确定　精密量取３．２．１项多
糖样品溶液１．００ｍＬ，置于棕色瓶中，加显色液５．００
ｍＬ，置于沸水浴中保温３０ｍｉｎ，取出，流水冷却，加
入蒸馏水１．００ｍＬ，摇匀，以相应的试剂做空白，照分
光光度法在４００～６００ｎｍ范围内扫描；另取样品溶
液１．００ｍＬ置于棕色瓶中，加入８３３ｍＬ·Ｌ－１硫酸
溶液５．００ｍＬ，置于沸水浴中保温３０ｍｉｎ，取出，流水
冷却，加入５０ｇ·Ｌ－１苯酚溶液１．００ｍＬ，摇匀，以相
应试剂做空白，照分光光度法在４００～６００ｎｍ范围
内扫描。２次扫描均在４９０ｎｍ处有最大吸收，因此，
选择４９０ｎｍ进行测定。
３．３．２　水解条件的考察　精密量取多糖样品溶液７
份各１．００ｍＬ，置于棕色瓶中，加入显色液５．００ｍＬ，
分别在沸水浴中加热１０，１５，２０，２５，３０，４０和５０ｍｉｎ，
流水冷却，加入１．００ｍＬ蒸馏水，摇匀。用相应的试
剂作空白，照分光光度法测定吸光度。结果表明，水
解时间在３０ｍｉｎ时，吸光度值最大，即多糖已完全水
解，因此，选择３０ｍｉｎ为适宜水解时间。
３．３．３　显色条件的考察
　　（１）显色液用量的确定　精密量取多糖样品溶液
７份各１．００ｍＬ，置于棕色瓶中，分别加入１．００，
２．００，３．００，４．００，５．００，６．００和７．００ｍＬ显色液，沸
水浴加热３０ｍｉｎ，流水冷却，加入１．００ｍＬ蒸馏水，
摇匀。用相应的试剂作空白，照分光光度法测定吸光
度。结果表明，当显色液用量为５．００ｍＬ时，吸光度
最大，因此，显色液最佳用量为５ｍＬ。
　　（２）显色剂放置时间的确定　精密量取多糖样品
溶液６份各１．００ｍＬ，置于棕色瓶中，分别加入已放
置时间为０，１０，２０，３０，４０和５０ｍｉｎ的显色液，沸水浴
加热３０ｍｉｎ，流水冷却，加入１．００ｍＬ蒸馏水，摇匀。
用相应的试剂作空白，照分光光度法测定吸光度。结
果表明，显色液随放置时间的延长，显色后的吸光度值
显著降低，所以显色液应该在使用前临时配制。
３．４　红松松塔多糖含量测定方法　取３．２．１项下所
得多糖样品溶液１．００ｍＬ，加入显色液５．００ｍＬ，于沸
水浴中保温３０ｍｉｎ，取出，流水冷却，加入蒸馏水１．００
ｍＬ，混匀后于４９０ｎｍ处测定吸光度值Ａ１；另取多糖
样品溶液１．００ｍＬ，加入８３３ｍＬ·Ｌ－１硫酸溶液５．００
ｍＬ，于沸水浴中保温３０ｍｉｎ，取出，流水冷却，加入
５０ｇ·Ｌ－１苯酚溶液１．００ｍＬ，混匀后于４９０ｎｍ处测
定其吸光度Ａ２，由Ａ１与Ａ２两者之差求得ΔＡ。
３．５　结果计算　按照３．４项所述方法测定吸光度
值，求得ΔＡ，由３．６．１项下回归方程计算样品液中的
单糖质量浓度（Ｃ），按下式计算红松松塔多糖含量。
多糖含量＝Ｃ·Ｄ／Ｗ×１００％
式中：Ｃ 为样品最终测定液中单糖质量浓度
（ｍｇ·ｍＬ－１），Ｄ 为多糖样品溶液的稀释倍数，Ｗ 为
红松松塔多糖样品质量（ｍｇ）。
３．６　方法学验证　　
３．６．１　线性关系考察　取对照品溶液，精密吸取
０．５０，１．００，１．５０，２．００，２．５０和３．００ｍＬ，按照３．４
项下方法测得对应ΔＡ，由质量浓度Ｃ对ΔＡ回归得
方程ΔＡ＝０．０５５　６Ｃ＋０．０１１　９（ｒ＝０．９９９　０），在３．５７
～２１．４２μｇ·ｍＬ
－１范围内线性关系良好。
３．６．２　稳定性实验　精密吸取同一多糖样品溶液，
按照３．４项下方法依次测定样品０，３０，４０，５０，６０，９０，
１２０和１５０ｍｉｎ的ΔＡ值，考察受试样品显色后的稳定
性。依次测得 ΔＡ 为０．４５７，０．４６０，０．４５９，０．４５９，
０．４５７，０．４５７，０．４５１和０．４３７，ＲＳＤ为１．６８％，表明受
试样品显色后２ｈ内稳定性良好。
３．６．３　重复性实验　取同一批多糖样品，平行制备
５份样品溶液，按照３．４项下方法操作，依次测得ΔＡ
为０．４７５，０．４７２，０．４５７，０．４４５和０．４７５，ＲＳＤ 为
２．８７％，表明本法重复性良好。
３．６．４　精密度实验　精密吸取多糖样品溶液，按照
３．４项下方法平行操作６次，依次测得ΔＡ为０．４６７，
０．４６７，０．４７６，０．４７９，０．４７４ 和 ０．４６８，ＲＳＤ 为
１．１０％，表明本法精密度良好。
３．６．５　加样回收率实验　精密吸取多糖样品溶液
２份各１．００ｍＬ，分别加入对照品溶液１．００ｍＬ，按
１４３西北药学杂志　２０１３年７月　第２８卷　第４期
ｈｔｔｐ：／／ＸＢＹＺ．ｃｂｐｔ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ
照３．４项下方法测得 ΔＡ，重复操作５次，结果见
表１，平均回收率为９８．３％，ＲＳＤ为１．０６％，表明本
法准确度较高。
表１　加样回收率测定结果（ｎ＝５）
Ｔａｂ．１Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｔｅｓｔｓ（ｎ＝５）
实验号
样品取样
量／μｇ
样品中
多糖量／μｇ
加入对
照品量／μｇ
测定量
／μｇ
回收率
／％
平均回收率
／％
ＲＳＤ
／％
１　 ２５．４　 ５．４９　 ５０．１　 ５４．９１　 ９８．６
２　 ２５．４　 ５．４９　 ５０．１　 ５５．４５　 ９９．７
３　 ２５．４　 ５．４９　 ５０．１　 ５３．９９　 ９６．８　 ９８．３　 １．０６
４　 ２５．４　 ５．４９　 ５０．１　 ５４．６９　 ９８．２
５　 ２５．４　 ５．４９　 ５０．１　 ５４．６５　 ９８．１
３．７　红松松塔多糖样品含量测定　取３个批次的样
品（批号：２０１１０９２０，２０１１１２１３，２０１２０５１１），按３．２．１
项下方法制备成样品溶液，按３．４项下方法测定，结
果３批样品中多糖含量分别为２０．６０％，２１．８１％和
２２．４６％。
４　讨论　　
　　本实验用改良差示酚硫法测定红松松塔多糖成
分的含量，从检测波长、水解时间、显色液放置时间及
其用量、线性范围、稳定性、重复性、回收率等多方面
进行了考察，结果表明，该方法可用于红松松塔多糖
含量测定，具有良好的实用价值。
改良差示酚硫法尤其适用于含有杂质的多糖样
品的含量测定，避免了繁琐的纯化步骤，而且能够有
效克服在加入浓硫酸放热的条件下进行显色反应导
致的多种误差，我们研究组已用该方法先后对淫羊藿
多糖［６］、红松松塔多糖等不同多糖成分含量测定进行
了研究，均取得较满意的结果。
参考文献：
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用的研究［Ｊ］．中草药，１９９５，２６（４）：１９３－１９６．
［２］　钟方晓，任海华，李岩，等．多糖含量测定比较［Ｊ］．时珍
国医国药，２００７，１８（８）：１９１６－１９１７．
［３］　Ｄｕｂｏｉｓ　Ｍ，Ｇｉｌｅｓ　ＫＡ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ　ＪＫ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ
ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｇａｒｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，
１９５１，１６８（４２６５）：１６７－１６８．
［４］　徐光域，颜军，郭晓强，等．硫酸苯酚定糖法的改进与初
步应用［Ｊ］．食品科学，２００５，２６（８）：３４２－３４６．
［５］　贺福元，罗杰英，刘平安，等．差示酚硫法的建立及对五
子衍宗颗粒剂中多糖测定比较研究［Ｊ］．中医药导报，
２００６，１２（１）：２－５．
［６］　王超，张曜武．改良－差示酚硫法的建立及对淫羊藿多糖
的含量测定［Ｊ］．西北药学杂志，２０１１，２６（４）：２５７－２５９．
（收稿日期：２０１３－０１－２３）
正交实验法优化妇舒保凝胶中大黄和虎杖的提取工艺
杨　锐１，王建春２＊，张咏梅２，钱　伟２（１．南京中医药大学，南京 ２１００４６；２．张家港中医医院，张家港 ２１５６００）
摘要：目的　通过正交实验建立妇舒保凝胶中大黄和虎杖的最佳提取工艺。方法　以干膏率、总蒽醌含量、虎杖苷含量为指标，
以乙醇体积分数、回流时间、回流次数、液料比、浸泡时间以及它们之间的交互作用作为因素，用Ｌ２７（３１３）正交设计表，采用直观
分析和方差分析的方法对大黄和虎杖的提取工艺进行研究。结果　最佳提取工艺为８倍量体积分数５０％乙醇浸泡３０ｍｉｎ，提
取３次，每次１２０ｍｉｎ。结论　该工艺可行，重复性较好，为妇舒保凝胶中有效成分的提取提供了依据。
关键词：妇舒保凝胶；大黄；虎杖；正交实验；提取工艺
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－２４０７．２０１３．０４．００６
中图分类号：Ｒ２８４　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００４－２４０７（２０１３）０４－０３４２－０４
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作者简介：杨锐，女，硕士研究生
＊通信作者：王建春，男，主任中药师
２４３ 西北药学杂志　２０１３年７月　第２８卷　第４期