全 文 ：论 著
(基础研究)
蕨麻正丁醇部位对大鼠海马神经元缺氧致钙超载的抑
制作用
卜 婧，张永亮，李灵芝，龚海英，李建宇
［摘要］ 目的 细胞内钙超载被认为是诱发神经元变性和死亡的关键因素。文中研究蕨麻正丁醇部位(n-butanol extract
of Potentilla anserina L，NP)对大鼠海马神经元急性缺氧所致钙超载的抑制作用。 方法 采用体外原代培养的海马神经元
建立缺氧所致钙超载的实验模型，分为正常对照组、缺氧模型组、尼莫地平干预组以及 NP高、中、低剂量干预组。通过免疫荧
光双染观察蕨麻正丁醇部位对海马神经元急性缺氧所致微管相关蛋白 2(microtuble-associated protein2，MAP2)的保护作用。
利用荧光分光光度计检测各组细胞内游离钙离子浓度(［Ca2 +］i)。通过半定量ＲT-PCＲ、免疫细胞化学染色及 Western blot技
术检测各组钙依赖中性蛋白酶 1(Calpain 1)在基因及蛋白质水平的表达差异。 结果 缺氧 3 h模型组与正常组相比较，神
经元特异性细胞骨架蛋白 MAP2 被水解，细胞骨架形态的被破坏，［Ca2 +］i显著升高，Calpain 1 在基因和蛋白水平的表达量明
显增加，细胞骨架发生破坏。NP各剂量干预明显抑制神经元特异性细胞骨架蛋白 MAP2 水解，减轻细胞骨架形态的破坏，且
显著降低缺氧神经元［Ca2 +］i(P ＜ 0． 05);并且下调了 Calpain 1 在基因和蛋白的表达水平(P ＜ 0． 05)。 结论 急性缺氧 3 h
可使神经元细胞内发生钙超载，NP可有效抑制缺氧所致神经元细胞钙超载，而发挥神经元作用。
［关键词］ 蕨麻正丁醇部位;海马神经元;缺氧;钙超载;钙依赖中性蛋白酶 1
［中图分类号］ Ｒ813． 11 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1008-8199(2014)02-0133-05
基金项目:国家自然科学基金 (81073152);天津市重点项目
(10JCZDJC21100，12JCZDJC34700)
作者单位:300162 天津，武警后勤学院附属医院药剂科［卜 婧(医
学硕士)］，训练部(张永亮)，药化教研室(李灵芝、龚海
英、李建宇)
通讯作者:李灵芝，E － mail:llzhx@ yahoo． cn
Inhibitory effects of N-butanol fraction of Potentilla anserine L． against hypoxia-induced calcium overload
on hippocampus neuron
BU Jing1，ZHANG Yong-liang2，LI Ling-zhi3，GONG Hai-ying3，LI Jian-yu3
(1． Department of Pharmacy，2． Training Department，3． Teaching and Ｒesearch Division of Pharmaceutical Chemis-
try，Logistical University of Chinese Peoples Armed Police Forces，Tianjin 300162，China)
［Abstract］ Objective Intracellular calcium overload is considered to be the key factor in neuronal degeneration and death．
The aim of this study is to investigate the inhibitory effects of n-butanol fraction of Potentilla anserine L． (NP)on hypoxia- induced
calcium overload on hippocampus neuron in rats． Methods Hipocampus neurons of Sprague-Dawley neonatal rats were cultured in
vitro to establish the hypoxia-induced calcium overload model． The cultured hippocampus neurons were randomized into control group，
hypoxia injury model group，Nimodipine intervention group，and NP (high，middle and low doses)intervention group． The protective
effects of NP on microtuble-associated protein2 (MAP2)in acute hypoxia injury were observed through immunofluorescent double stai-
ning． The intracellular calcium ion concentration(［Ca2 +］i)in hippocampus neurons were detected through fluorescence spectropho-
tometer． Changes in expression of calcium-activated neutral protease 1 (Calpain 1)mＲNA were detected by ＲT-PCＲ and Calpain 1
protein were detected by immuno-histochemistry stain and Western blot． Ｒesults Compared with the control group，MAP2 was
hydroiyzed，cytoskeleton morphology was destroyed，［Ca2 +］i was increased，and the Calpain 1 mＲNA and protein were increased in
hypoxia 3 h injury model group． NP at different dosage inhibited the hydrolyses of MAP2，decreased［Ca2 +］i and the expression of Cal-
pain 1 mＲNA and protein on hypoxia injury neuron compared with model group (P ＜ 0． 05)． Conclusion NP can attenuate the cal-
cium overload induced by hypoxia 3 h on hippocampal neurons in rats．
［Key words］ Potentilla anserina L． n-butanol extraction;Hippocampal neurons;Hypoxia;Calcium overload;Calpain 1
0 引 言
近年关于钙超载在脑缺血所致脑损伤中的作用
越来越受到重视，被认为是诱发神经元变性和死亡
的关键因素［1］。研究显示当脑缺血发生时，神经元
细胞缺氧、缺糖导致能量不足，破坏了维持细胞内
·331·医学研究生学报 2014 年 2 月 第 27 卷 第 2 期 J Med Postgra，Vol． 27，No． 2，February，2014
DOI:10.16571/j.cnki.1008-8199.2014.02.007
钙离子浓度的平衡机制，使缺氧细胞细胞内游离钙
离子浓度(［Ca2 +］i)大幅度增加，触发钙依赖的下
游级联反应，引起一系列病理损伤，造成脑功能缺
失［2］。因此，抑制细胞内钙超载成为新药研发的重
要靶点。实验室前期研究证实蕨麻正丁醇部位
(n-butanol extract of Potentilla anserina L，NP)对因
缺氧导致的机体损伤具有保护作用，是其抗缺氧的
活性部位［3 － 4］。研究发现其具有抗大鼠海马神经元
缺氧所致的凋亡、坏死作用［5］。本研究通过建立体
外培养大鼠海马神经元缺氧所致钙超载模型，模拟
急性脑缺血缺氧造成的神经元钙超载，进一步探讨
蕨麻正丁醇部位对大鼠海马神经元缺氧所致钙超载
的抑制作用。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 主要药品及试剂 蕨麻购自青海玉树，由沈
阳药科大学中药学院孙启时教授鉴定为蔷薇科委陵
菜属植物鹅绒委陵菜的块根。以 70%乙醇提取浓
缩后以水分散，依次以石油醚、氯仿、正丁醇萃取，减
压浓缩，得正丁醇提取部位。尼莫地平注射液购自
拜耳医药公司，批号 BXC94E3。DMEM-F12 培养基
(GIBCO，美国);N2 营养因子(GIBCO，美国);Fura-
2，AM Ester 染料(Biotium，美国);Calpain 1 引物
(Invitrogen，美国);总 ＲNA提取试剂盒(TaKaＲa，日
本);兔抗大鼠 calpain1 多克隆抗体(Santa Cruz，
美国)。
1． 1． 2 主要仪器 荧光分光光度计 ＲF-5301(岛津，
日本);FV500激光共聚焦显微镜(Olympus，日本);
5417Ｒ 高速低温离心机(Eppendorf，德国);PT-200
PCＲ热循环仪(MJ Ｒesearch，美国);核酸定量仪(Ep-
pendorf，德国);Bio-Ｒad 680 酶标仪(Bio-Ｒad，美国);
Western Blot电泳仪及电转仪(Bio-Ｒad，美国)。
1． 1． 3 实验动物 健康 SD大鼠，雌鼠 12 只雄鼠 6
只，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许
可证号:SCK-(军)2002-001。动物饲养于清洁级动
物房，室温 26 ℃，湿度 60%，雌雄鼠交配后分离饲
养，实验选取 24 h 内新生 SD 乳鼠进行海马组织
分离。
1． 2 方法
1． 2． 1 体外原代大鼠海马神经元培养 取 24 h 内
新生 SD 乳鼠，分离海马组织，剪碎过 200 目滤网
筛，用 DEME-F12 培养基、10%胎牛血清、1%链霉
素、1%青霉素和 5%葡萄糖稀释细胞悬液，以 4 ×
105个 /mL的密度接种于培养皿，48 h 换全液撤去胎
牛血清，加 1% N2 神经营养因子，以后每 3 ～ 4 天换
半液，细胞共培养 7 d ［6］。
1． 2． 2 缺氧损伤模型建立及实验分组 将培养 7 d
的细胞用无糖 D-hank s 液(预先充入 95% N2-5%
CO2混合气饱和 30 min)替代正常培养基，而后将培
养细胞置于 95%N2-5%CO2混合气 37℃培养箱。实
验随机分为正常对照组、缺氧损伤模型组、尼莫地平
(2 μmol /L)干预组以及蕨麻正丁醇部位高剂量
(0． 25 mg /mL)、中剂量(0． 062 5 mg /mL)、低剂量
(0． 015 6 mg /mL)。
1． 2． 3 ［Ca2 +］i的测定 ①制备样品:将细胞消化，
并以 1000 r /min的转速离心 10 min，离心半径 5 cm。
弃上清，将细胞悬浮于 1 mL Hanks BSA 液中，导入
Fura-2 AM染料，终浓度为 1 μmol /L，37 ℃震荡孵育
30 min。相同条件离心 10 min，弃上清，将细胞悬浮
于 Hanks buffer 缓冲液中。②上机检测:检测样品
340 nm、380 nm 2 处波长值;加入 10% Tritonx-100 终
浓度为 0． 1%(30 min)，检测 340 nm、380 nm 2 处波
长值;加入乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA，
为钙离子螯合剂)终浓度为 5 mmol /L(30 min)，检测
340 nm、380 nm 2 处波长值。计算公式:
［Ca2 +］i = kd ( FD /FS) × ( Ｒ-Ｒmin /Ｒmax-Ｒ)
kd为 Fura-2 与钙反应的解离常数，生理条件下
kd为 224 nmol /L，Ｒmax为 Fura-2 全部与钙结合时饱
和的荧光比值，Ｒmin为 Fura-2 完全未与钙结合时荧
光比值，FD 和 FS 分别代表无钙和钙饱和状态下
380 nm处的荧光强度。
1． 2． 4 ＲT-PCＲ检测 Calpain1 基因表达 按总 ＲNA
抽提试剂盒操作提手册取各组细胞的总 ＲNA，取
A260 /A280值在 1． 8 ～ 2． 0 的 ＲNA 进行逆转录。使用
PCＲ热循环仪合成 cDNA。PCＲ 引物的设计与合
成，根据 GenBank 给出的基因序列，采取 Primer
Premier 5． 0 软件设计引物，见表 1。40 μL反应体系
包括:上游引物 0． 5 μL，下游引物 0． 5 μL，5 × ＲNA
PCＲ Buffer 10 μL，灭菌三蒸水 28． 75 μL，TaKaＲa
Taq 0． 25 μL。扩增条件:94 ℃ 5 min，预变性后，
94 ℃ 30 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，共 30 个循环。扩
增完成后，取 Calpain 1 和 β-actin PCＲ产物，电泳 40
min(55 V)。以同一样品 Calpain 1 扩增带的光密度
分别与 β-actin 扩增带的光密度比值，作为 ＲT-PCＲ
产物的相对含量。
表 1 PCＲ引物序列
Table 1 Priner sequences for PCＲ detection of Calpain 1
and β-actin genes
基因 序列 产物长度(bp)
Calpain 1 F5＇-GATGGAAAGGCTGGTTTCGT-3＇ 461
Ｒ5＇-AGCTGCTCACGTTCATAGGG-3＇ 461
β-actin F5＇-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3＇ 239
Ｒ5＇-TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT-3＇ 239
·431· 医学研究生学报 2014 年 2 月 第 27 卷 第 2 期 J Med Postgra，Vol． 27，No． 2，February，2014
1． 2． 5 免疫细胞化学法检测 Calpain 1 蛋白 将细
胞爬片丙酮固定 4 h，封闭非特异性抗原，加入兔抗
大鼠 Calpain 1 多克隆抗体(1∶1000、4 ℃)，加入生物
素化山羊抗兔二抗工作液(37℃、1 h)，滴加 SP复合
物(37 ℃、1 h)，DAB显色液中显色。苏木精复染胞
核，脱水、透明、封固。正常对照以 PBS 代替一抗作
为阴性对照，其余步骤相同。显微镜下观察，每张切
片随机选择 200 倍视野，以细胞核或细胞质染成棕
黄色为阳性细胞。
1． 2． 6 Western blot 法检测 Calpain 1 蛋白 按总蛋
白提取试剂盒说明书提取蛋白，考马斯亮兰蛋白测
定法进行蛋白质的定量。采用 SDS-PAGE恒压电泳
分离蛋白，浓缩胶为 80 V，分离胶为 120 V。垂直电
转移槽将分离蛋白转移至 PVDF 膜，恒流 90 V 电转
移 2 h。冲洗 PVDF 膜后将其置于 5% BSA 封阻液
(1 h)，加入兔抗大鼠 Calpain 1 多克隆抗体(1∶ 1000
稀释、4 ℃)，加入生物素化山羊抗兔二抗工作液
(37 ℃、1 h)，滴加 SP复合物(37 ℃、1 h)，DAB 显色
液中显色。以同一样品 Calpain 1 条带的光密度与
β-actin的光密度的比值，作为蛋白的相对含量。
1． 3 统计学分析 采用 SPSS 11． 5 软件进行统计学
分析。定量实验数据以均值 ±标准差(x ± s)表示，多
实验组结果采用单因素方差分析，组间两两比较采
用 LSD-t检验，以 P≤0． 05为差异有统计学意义。
2 结 果
2． 1 神经细胞［Ca2 +］i检测 荧光分光光度计检
测各组细胞［Ca2 +］i，实验结果显示缺氧损伤模型组
较正常对照组细胞内［Ca2 +］i显著增加(P ＜ 0． 01);
尼莫地平组及 NP高、中、低剂量干预组与缺氧损伤
模型组相比较神经元［Ca2 +］i显著降低(P ＜ 0． 05)。
见图 1。
2． 2 免疫荧光双重染色观察神经元细胞骨架 400
倍激光共聚焦显微镜观察 PI 标记的细胞核呈红色
荧光，MAP2 标记的细胞骨架蛋白呈绿色荧光，两者
共定位显示黄色荧光。正常对照组可见绿色荧光均
匀分布于细胞质、轴突和树突内，荧光表达量强，神
经元形态呈现清晰，细胞核红染形态完好;模型组绿
色荧光散在分布于细胞质、轴突及树突中，神经元突
起形态不能良好呈现，与正常组相比轴突、树突内荧
光强度明显减弱;尼莫地平组及高剂量 NP 干预组
神经元突起形态良好呈现，与模型组相比绿色荧光
强度明显增强;中剂量 NP 干预组大部分神经元轴
突及树突中可见绿色荧光，呈现部分神经元突起结
构，与模型组相比绿色荧光强度增强;低剂量 NP
干预组仅在少量神经元突起中可见绿色荧光，但与
模型组相比其绿色荧光强度有所增强。见图 2。
与正常对照组比较，* P ＜ 0． 01;与缺氧损伤模型组比较，
#P ＜ 0． 05
图 1 各组神经细胞中细胞内游离钙离子浓度比较
Figure 1 Intracellular concentrations of［Ca2 +］i in differ-
ent groups
a:正常对照组;b:缺氧损伤模型组;c:蕨麻正丁醇部位高浓
度组(0． 250 0 mg /mL)
图 2 各组细胞中MAP2 、PI免疫荧光双重染色( ×400)
Figure 2 Stained with MAP2 and PI in different groups by
LSCM ( ×400)
2． 3 ＲT-PCＲ检测 Calpain 1 基因表达 PCＲ结果
显示引物特异性良好，基因扩增单一。缺氧损伤模
型组较正常对照组神经元 Calpain 1 mＲNA 的表达
量升高(P ＜ 0． 05);尼莫地平组及 NP高、中、低剂量
干预组与模型组相比较神经元 Calpain 1 mＲNA 的
表达量均降低(P ＜ 0． 05)。见图 3。
2． 4 免疫细胞化学法检测 Calpain 1 蛋白表达
200 倍视野可见 Calpain 1 蛋白主要在细胞质表达，
阳性反应产物均呈棕黄色颗粒。正常对照组细胞免
疫组化染色玻片中，Calpain 1 蛋白免疫反应阳性表
达较弱，而缺氧模型组细胞 Calpain 1 蛋白表达增
强。与正常对照组比较，模型组 Calpain 1 免疫反应
阳性细胞率升高(P ＜ 0． 05);尼莫地平组及 NP 高、
中、低剂量干预组与模型组比较，免疫反应阳性细胞
率积均有显著性差异(P ＜ 0． 05)。见图 4、图 5。
·531·医学研究生学报 2014 年 2 月 第 27 卷 第 2 期 J Med Postgra，Vol． 27，No． 2，February，2014
2． 5 Western blot法检测 Calpain 1 蛋白表达 缺
氧模型组神经元 Calpain 1 蛋白的表达量较正常对
照组升高(P ＜ 0． 05);尼莫地平组及 NP高、中、低剂
量干预组与模型组相比较神经元 Calpain 1 蛋白的
表达量均降低(P ＜ 0． 05)。见图 6。
a:ＲT-PCＲ检测各组细胞 Calpain 1 基因表达;b:各组细胞
Calpain 1 与 β-actin扩增产物的比值
与正常对照组比较，* P ＜ 0． 05;与缺氧损伤模型组比较，
#P ＜ 0． 05
图 3 NP对缺氧神经细胞 Calpain 1 基因表达的抑制作用
( ×400)
Figure 3 Inhibitory effects of NP on Calpain 1 mＲNA of
hypoxia neurons ( ×400)
a:正常对照组;b:缺氧损伤模型组;c:尼莫地平干预组(2
μmol /L)
图 4 各组细胞中免疫细胞化学法检测 Calpain 1 蛋白表达
( ×400)
Figure 4 Expression of Calpain 1 protein from each groups
detected by immunocytochemisty ( ×400)
a:免疫细胞化学法检测 Calpain 1 蛋白表达;b:各组细胞
Calpain 1 蛋白阳性率
与正常对照组比较，* P ＜ 0． 05;与缺氧损伤模型组比较，
#P ＜ 0． 05
图 5 各组神经细胞中 Calpain 1 蛋白阳性率比较
Figure 5 Comparison of positive rates of Calpain 1 protein
in neurocytes from each group
a:Western blot法检测 Calpain 1 蛋白表达;b:各组细胞 Cal-
pain 1 与 β-actin蛋白表达的比值
与正常对照组比较，* P ＜ 0． 05;与缺氧损伤模型组比较，
#P ＜ 0． 05
图 6 NP 对缺氧神经细胞 Calpain 1 蛋白表达的抑制
作用
Figure 6 Inhibitory effects of NP on Calpain 1 protein of
hypoxia neurons
·631· 医学研究生学报 2014 年 2 月 第 27 卷 第 2 期 J Med Postgra，Vol． 27，No． 2，February，2014
3 讨 论
钙超载是指各种原因引起的钙平衡系统功能失
调，钙分布紊乱，导致细胞［Ca2 +］i异常升高
［7］。当
细胞发生钙超载时，可引起线粒体内氧化磷酸化过
程障碍、线粒体膜电位降低、三磷酸腺苷生成障
碍［8］，以及细胞质内磷脂酶、蛋白酶等激活［9］，导致
并促进细胞的不可逆性损伤。有研究发现，当神经
元细胞膜上电压依赖性钙离子通道持续开放，将诱
发细胞［Ca2 +］i的急剧增加导致神经细胞死亡
［10］。
Sibarov等［11］研究显示，神经细胞膜上钠钙泵持续
开放，将使细胞内大量钙离子转移到细胞外，使细胞
［Ca2 +］i明显减少，抑制钙超载和神经细胞的凋亡。
本研究结果显示，当神经元缺氧 3 h 时，细胞
［Ca2 +］i显著高于正常细胞［Ca
2 +］i，而各剂量 NP
均显著降低了缺氧神经元［Ca2 +］i，且［Ca
2 +］i随 NP
剂量的增加神经元而减少，说明缺氧诱发了［Ca2 +］i
的升高。NP 可抑制缺氧所致神经元［Ca2 +］i的增
加，且具有剂量依赖性。
Calpain 1 是钙依赖性的蛋白酶，属于半胱氨酸
蛋白水解酶家族成员［12］。钙超载时，Ca2 +与其结合
构象发生变化，Calpain 1 被激活［13］，其通过特异性
蛋白水解酶作用水解细胞骨架，微丝分解、微管解
聚，严重影响轴浆正常运输，导致神经细胞死亡［14］。
微管相关蛋白 2 (microtuble-associated protein2，
MAP2)结合于微管的表面，使微管蛋白亚基聚合，
并中和微管表面相互排斥的负电荷［15］，增加微管的
稳定性及聚合能力，为 Calpain 1 特异性底物，且只
存在于神经元［16］。MAP2 被作为特异性神经元损
伤程度的评价指标之一。结果显示，缺氧 3 h 时细
胞内 Calpain 1 mＲNA 及其蛋白水平显著高于正常
组细胞内的含量，且激光共聚焦显微镜观察发现
MAP2 标记的蛋白荧光强度减弱，神经元突起形态
不能良好呈现;给予 NP高、中剂量干预组 Calpain 1
mＲNA及其蛋白均显著降低缺氧细胞内的含量，且
与缺氧组相比荧光强度增强，大部分神经元突起可
良好呈现。说明缺氧 3 h 时激活了钙离子依赖的下
游蛋白激酶 Calpain 1 基因和蛋白水平的表达，并且
破坏了细胞骨架。而 NP 高、中剂量组显著抑制了
钙离子依赖的下游蛋白激酶 Calpain 1 基因和蛋白
水平的表达，有效保护了细胞骨架。因此，蕨麻正丁
醇部位可通过抑制缺氧所致细胞钙超载而发挥神经
元保护作用［17］。
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(收稿日期:2013-04-10; 修回日期:2013-05-16)
(责任编辑:闻 浩; 英文编辑:杨建军)
·731·医学研究生学报 2014 年 2 月 第 27 卷 第 2 期 J Med Postgra，Vol． 27，No． 2，February，2014