全 文 ：芦竹内生真菌 F0238细胞生长及其代谢调控*
纪丽莲
(淮阴工学院生物工程系　淮安　223001)
摘要:对芦竹内生真菌 F0238的细胞生长和代谢产曲酸量进行了代谢调控。结果表明 , F0238
生长及产曲酸的营养和环境条件为:PDA培养基 , 8%淀粉为碳源 , 0. 2%蛋白胨为 N源 , 发
酵温度 28℃, 初始 pH值为 6. 5, 发酵时间 5d /(120h), 装液量 80mL /500mL三角瓶。在摇瓶
试验的基础上 , 对该菌发酵过程作了初步放大试验 (10L全自动发酵罐), 得到 F0238发酵过
程的动态曲线。动态曲线反映了在一个发酵周期内 , 发酵液的 pH值 、 DO值及残糖的降低趋
势和生物量与抗菌产物量的上升趋势。
关键词:芦竹 , 内生真菌 , 细胞生长 , 曲酸 , 代谢调控
中图分类号:TS201.3　　文献标识码:A　　文章编号:0253-2654 (2005) 04-0051-05
　　*江苏省高校自然科学基金项目 (N o. 02KJD180010)
收稿日期:2004-10-11, 修回日期:2004-11-28
M etabolicR egu lation ofCellGrow th and Antmi icrob ialM etaboliteof the F0238
*
JI L i-Lian
(Departmen t ofB ioeng ineering , Huayin Institute o f Technology , Huaian 223001)
Abstract:M etabolic regu lation of ce llg row th and an tim icrob ialm etabolite of th e F0238 was carried ou t in this stud-
y.The p roper compositions of the cu lture m ed ium and techno logica l cond itions for its ferm en tation were inves tiga-
ted.The resu lts showed that the opt imum cond itions for the grow th of the strain and its p roduction of ko jic acid were
PDA med ium w ith s tarch 2% as C sou rce, peptone 0.2% asN source, and temperatu re 28℃, cu ltu re tim e 5 day
(144 h), cu lture volum e 80mL /500mL E rlenm eyer f lask. Under above cond itions, th e dynam ic cu rve of ferm enta-
tion was ob tained by an au tomatic m ini-b ioreactor of 10L and ind icated a trend of decreas ing pH, DO and residua l
sugar and increasing b iom ass and ko jic acid product ion by F0238.
Key words:Arundo donax L., Endophytic fungi, Cell grow th, Ko jic acid, M etabolic regu lation
植物内生真菌 (endophy ticfungus)是生长在宿主体内不引起植物发病的一类特殊微
生物。它们与宿主植物之间存在着一定的 “互惠共生 ” 关系 , 宿主植物为内生菌提供
营养需求 , 内生菌则通过产生次生代谢产物调节并增强宿生植物的环境适应能力 , 如
固氮 , 抗菌 、抗虫和抗病等;内生真菌还能参与植物活性成分的合成 , 或者对植物次
生代谢产物进行转化 [ 1] 。
植物内生真菌中广泛分布着抗菌活性菌株 , 它们在进化过程中形成了丰富的代谢
系统 , 能产生众多的抗菌产物 , 并在一定条件下成为植物病原菌的拮抗菌却不会引起
宿主植物明显的病症 。我们课题组从黄海岸低盐芦竹中分离到一株木霉属的内生菌
(编号为 F0238), 并已研究证实此菌有很强的拮抗植物病原菌的活性 , 其拮抗机制为
抗生作用 、 营养竞争及重寄生作用 [ 2] 。在进一步的研究中 , 我们从 F0238活性次生代
谢产物中分离到一无色棱柱晶体 , 后经波谱鉴定为曲酸 (ko jic acid) (5-hydroxy-2-
hydroxyme thy l-4-py rone)。文献报道曲酸广泛用于杀虫抗菌剂 [ 3, 4] 。我们对 F0238菌发酵
51 　2005年 32 (4) 　　　　　　　　　　　　微 生 物 学 通 报DOI牶牨牥牣牨牫牫牬牬牤j牣microbiol牣china牣牪牥牥牭牣牥牬牣牥牨牨
生产的曲酸进行了抗菌谱的测定 , 发现其在 2% (w /v)的浓度下对受试植物病原菌 [ 2]
的抑菌圈均在 15mm以上 (强活性)。为此 , 我们分别以 F0238菌体干重和发酵液中曲
酸产量为指标 , 对内生真菌 F0238进行了细胞生长和产曲酸的代谢调控 , 旨在探索
F0238生长和代谢的营养与环境条件 , 为其在工业规模上生产果蔬生防制剂和 /或防腐
杀菌剂提供理论与实践依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　内生真菌 F0238:分离自黄海海岸浅水滩海岸低盐芦竹 (Arundo donax L. )。
1.1.2　培养基:PDA、 PDM 、 查氏和 MMN培养基 。
1.1.3　曲酸标准品:购于南京生物制品有限公司 , AR级 。
1.2　方法
1.2.1　曲酸含量的测定:用高相液相色谱法测定样品中曲酸的含量[ 5] 。检测仪器为美
国W ate rs公司的高效液相色谱仪;流动相为甲醇-水 (50 +50) ;柱温:室温;流速:
0.8mL /m in;进样量:10μL;检测器:二极管阵列检测器 , 提取波长 200nm;数据处
理:威玛色谱数据工作站 。
1.2.2　曲酸及发酵产物的抗菌活性的测定:采用抑菌圈法 , 即将苹果链格孢霉菌的细
胞或孢子稀释到 5mL无菌水中 , 制成 106 cfu /mL的菌悬液。另制备 PDA固体培养基 ,
微热时与苹果链格孢菌的菌悬液混合均匀并倒平板 (150μL菌悬液 /平板)制成 B t板 。
再将微热的已灭菌的牛津杯轻放于 B t板上 , 滴加过滤除菌后的曲酸或发酵清液 100μL,
28℃培养 , 3d /后观察 , 测抑菌圈的直径 [ 2] 。
1.2.3　F0238菌发酵的生物量测定:取各发酵液 100mL, 离心收集湿菌体 , 蒸馏水冲
洗两次 , 然后在 60 ℃恒温干燥至恒重 , 用电子天平称重 。
1.2.4　F0238菌发酵的营养因子筛选:在其它条件一致的情况下 (即发酵温度 28℃,
初始 pH值 6.5, 装液量 100 mL /500mL三角瓶 , 发酵周期 7d, 接种量 10%), 通过分
别改变培养基种类 、 培养基中的 C源 、 N源来考察 F0238菌发酵过程的生物量 、 活性
代谢产物量 (曲酸)等的变化 , 以确定其生长与代谢的营养条件 [ 6, 7] 。
1.2.5　F0238菌发酵的环境条件:在固定其它条件的情况下 (即 PDA培养基 , 发酵周
期 7d, 接种量 10%), 以发酵过程的生物量 、 曲酸产量为考察指标 , 追踪在不同培养
温度 、 初始 pH值和供氧量下 F0238菌的发酵情况 , 以确定其发酵的环境条件[ 6, 7] 。
1.2.6　F0238发酵过程的动态分析:为揭示在放大模型下 F0238菌发酵全过程中各个
因素之间的动态变化规律和相互关系 , 以及确定发酵周期 , 按前面单因素实验所确定
的优化条件 , 一次配料接种上 10L全自动发酵罐发酵 , 每天定时取样进行分析测定 。
测定指标为 F0238菌的生物量和曲酸产量 , 发酵的最终 pH值和残糖 , 溶氧情况等 。其
中残糖的测定采用 SBA-40多功能生物传感分析仪测定 [ 8, 9] 。
1.2.7　统计分析:所有实验均设置 3次重复 , 以 Duncan的多重分析法进行各数据的方
差检验 [ 10] 。
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2　结果与讨论
2.1　培养基种类对 F0238菌生长与代谢的影响
F0238菌的生长代谢范围很宽 , 在不同的培养基中均可生长 , 并产生抗菌物质 (如
曲酸)。但选用不同的培养基 , 其发酵过程中菌体的生长量和曲酸量各有不同 。从图 1
可以看出 , F0238菌在实验提供的 4种培养基上的发酵情况呈有规律的变化趋势 , 其中
在 PDM培养基上的生物量增加的最为显著 , 在 PDA上次之 , 再次是在查氏培养基上 ,
最小的是在 MMN培养基上 。在 4种实验培养基上 , 最大生物量均出现在发酵的第 3 ～ 4d。
但从培养基对曲酸产量的影响曲线可看出 (图 2), 在 PDA培养基上 F0238菌发酵
产生曲酸量最大 , 其次是 PDM 、 MMN和查氏培养基 。因此 , 有利于菌体生长的培养基
并不一定有利于其活性代谢产物的产生。
鉴于我们的目标是追踪 F0238菌的抗菌活性 , 考虑到 PDA培养基对 F0238菌代谢
产物及菌体生长均有利 , 由此确定其最适培养基为 PDA培养基。
图 2还表明了 F0238菌最大次生代谢产物量出现在发酵的第 5d, 说明其菌体生长
的对数期与产次生代谢产物不同步 。在发酵的对数期生长菌体 , 而在对数后期分泌次
生代谢产物 。为得到最大次生代谢产物量 , 我们确定发酵时间为 5d。
图 1　培养基种类对 F0238菌生物量的影响
　—◆—— PDA, 　　—■—— MMN ,
　—▲—— PDM , 　　——×— 查氏
图 2　培养基种类对 F0238菌产曲酸的影响
　—◆—— PDA , 　　—■—— MMN,
　—▲—— PDM , 　　——×—查氏
2.2　C源对 F0238菌生长与代谢的影响
分别用 8%、 10%、 12%及 14%的淀粉代替 PDA液体培养基中的葡萄糖作为碳源 ,
进行 F0238菌的发酵 。实验结果表明 F0238菌能够利用淀粉作为能源生长繁殖和合成
抗菌活性物质 , 但不同浓度的淀粉对其细胞生长和产曲酸的影响差异显著。在淀粉浓
度为 10%时 , 可得到最大的菌体生长量 , 淀粉浓度为 8%时次之;但在淀粉浓度为 8%
时 , 可得到最大的曲酸量 。综合考虑 , 选取 8%的淀粉作为培养基的碳源浓度 。
2.3　N源对 F0238菌生长与代谢的影响
在优选出碳源的基础上 , 分别选用蛋白胨 、 牛肉膏 、 KNO 3、 (NH4)2HPO4 、
(NH4)2SO 4作为发酵培养基的氮源 , 各种氮源的加入量分别折算成 PDA液体培养基中
的 N含量 (0.2%)。由图 3可以看出 , 以有机氮为氮源时 , 有利于 F0238菌体的生长 ,
生物量的最大值出现在发酵的第 4d, 其中以牛肉膏为 N源时的生物量最大;无机氮源
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的生物量偏低。由图 4可知 , 曲酸的最大值仍然出现在发酵的第 5d, 且以蛋白胨为氮
源时最大 , 其次是以牛肉膏为 N源;无机氮源对产次生代谢物不利 。可见与蛋白胨相
比 , 牛肉膏对细胞生长的促进作用要强 , 但对活性产物代谢的促进作用却弱。综合考
虑 , 选择蛋白胨为 F0238菌发酵的氮源 。
图 3　不同 N源对 F0238菌生物量
牛肉膏 , 蛋白胨 , KNO3 ,
　 NH4 2HP4 , NH4 2SO 4
图 4　不同 N源对 F0238菌产曲酸的影响
牛肉膏, 蛋白胨, KNO 3 ,
　 NH4 2HP4 , NH 42SO4
2.4　发酵温度对 F0238菌生长与代谢的影响
由图 5可看出 , 在实验温度范围内 , 菌体均可生长 , 但温度的变化对菌体生长及
曲酸的产生影响很大 。在低于 28℃时 , 温度的升高对菌体的生长有利 , 生物量逐渐增
加 , 在 28℃达到最大生物量;当培养温度从 20℃升至 28℃, 曲酸产量随着温度升高而
增加到量大值 , 其抗菌活性也增加到最大值。当温度升至 32℃时生物量与曲酸产量均
降低 , 因此适于 F0238菌生长与合成抗菌产物的温度为 24℃ ～ 28℃。
2.5　供氧量对 F0238菌生长与代谢的影响
F0238菌代谢产抗菌物质属好气性发酵 , 溶解氧对发酵有着重要的影响 。本实验通
过在 500mL三角瓶中装入不同体积的发酵培养基的方法来探讨供氧量对菌体生长及曲
酸产量的影响。由图 6可看出 , 不同的装液量对菌体的生长影响较大 , 随着装液量的
减少 , 菌体的生物量呈增大趋势。其中装液量为 80mL时 , 菌体的生物量达最大。装液
量过大不利于菌体的生长 , 装液量越多 , 有效氧的供应越少 , 越不利于菌体的生长 。
同样 , 在较少的装液量下 , 有较多氧的供给 , F0238菌代谢产曲酸量增多。
图 5　发酵温度对 F0238菌生长与代谢的影响 图 6　装液量对 F0238菌生长与代谢的影响
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2.6　初始 pH值对 F0238菌生长与代谢的影响
用 1mo l /L的 N aOH和 HC l溶液将 PDA液体培养基的起始 pH分别调为 4.5、 5.5、
6.5、 7.5和 8.5, 研究培养基起始 pH对菌体生长及代谢产物量的影响 , 结果发现 , 在
实验的 pH范围内 , 细胞均可生长 , 但 pH值的变化对生物量及代谢产物量的影响显著 。
其中初始 pH为 5.5 ～ 6.5时 , 菌体的生物量最大 , 曲酸产量最多 , 活性最强。碱性环
境对菌体生长不利。因此取培养基初始 pH为 6.5。
2.7　F0238菌发酵过程的动态曲线
由 F0238菌在 10L全自动发酵罐的发酵过程动态曲线 (图 7)可看出 , 在发酵的对
数期 , 随着发酵的进行 , 菌体的生物量 、 曲酸的产量均呈增加趋势 , 并分别在 96h和
120h达到最高值 , 同时 F0238对糖的利用在 96h基本结束。
图 7　F0238菌发酵过程动态曲线
　—◆——生物量 / (g /200m L), —■—— 曲酸量 / (g /500mL), —▲—— pH ,
　——×—残糖 / (g /500mL), —○——溶氧量 / (DO /千)
发酵过程中发酵液的 pH 也呈有规律的趋势 , 即先下降后上升。在发酵前期 ,
F0238发酵产大量酸 , 使培养基酸化 , pH值降低;此外 , 培养基在灭菌过程中高温会
导致基质中部分物质的分解 , 而使培养基酸化。发酵后期 , 当菌体进入菌丝自溶阶段 ,
随着营养基质的耗尽 , 菌体蛋白酶的活跃 , 培养液中氨基氮增加 , 使基质的 pH值又上
升 。在实验过程中我们也发现 , 只要是培养基初始 pH值维持不变 (6.5), 在发酵一个
周期后 (约 6d), 发酵终了的基质的 pH值几乎都恒定在 6左右。
从扩大培养的溶氧曲线可看出 , 通气量恒定的情况下 , 随着培养时间的延长 , 基
质中的溶氧量 (DO)趋于变小 , 培养至 144h时 , 维持在 10%左右不再变化。这表明
在菌体生长时 , 随着菌丝体生长量的不断增加 , 对氧的需求量也不断增加 , 当培养至
后期 , 菌体开始自溶时 , 对氧的需求量渐少 , 溶氧量下降的趋势变缓慢 , 最终恒定 。
3　讨论
以 F0238菌为出发菌株 , 通过单因素实验在摇瓶条件下对出发菌株的发酵培养基
种类和组成 (碳源 、氮源等 )及工艺条件 (发酵温度 、 供氧量等 )进行了摸索。结果
表明 , 菌体生长和发酵产曲酸的培养基为 PDA培养基 , 碳源为淀粉 8%, 氮源为蛋白胨
0.2%;发酵温度 28℃, 发酵时间 5d, 初始 pH值为 6.5, 装液量 80mL /500mL三角瓶 。
在摇瓶试验的基础上 , 对该菌发酵过程作了初步放大试验 (10L全自动发酵罐 ), 得到
F0238发酵过程的动态曲线 。动态曲线反映了在一个发酵周期内 , 发酵液的 pH值 、 DO
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值 、残糖的降低趋势及生物量和抗菌产物量的上升趋势 。
在微生物农药的工业化生产中 , 提高发酵液效价是降低成本 , 提高经济效益的重
要途径 , 其根本措施是探索各发酵因子的组合 , 优化微生物代谢产活性成分的发酵条
件 。李淑彬等对一株海洋青霉产抗生素的发酵进行了调控研究 [ 8] ;卫　军等人对一株
产抗真菌抗生素的海洋微生物进行了发酵条件研究[ 4] 。本研究首次以药用植物芦竹内
生真菌 F0238为出发菌株 , 对其产抗植物病原真菌物质 (曲酸 )进行了代谢调控 , 并
在 10L全自动发酵罐进行了放大 , 得到了该菌发酵过程的动态曲线 , 从而为开发新型
防霉剂 、微生物农药等奠定了应用基础。
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·科技信息·
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(2) 值得注意的是改造壳聚糖材料 , 使其具有更高的实用价值。我国中南大学研究人员研制一
种磁性壳聚糖纳米材料 (m agne tic chito san nanoma teria l), 即壳聚糖中含有磁性物质 (Fe3O4), 组成球
形 , 直径 8nm ～ 12nm, 分布均匀地包覆壳聚糖 , 其粒径 10nm ～ 15nm , 磁性稳定 , 靶向性强 , 且有超
顺磁性;加之壳聚糖具有生物相容性 , 可降解性和极大的表面积 , 将其用于药物运载体 , 将用于临床
治病很有价值。这样 , 大大提高了壳聚糖的高使用价值。关键在于制备这种靶向载药系统 , 用于治病
(如癌症等)对准目标的准确性 、 有效性以及药物进入靶细胞内融合性和实效性。 这些都得做更深入
的重复实验研究。另外 , 壳聚糖 、 磁性物质都能通过微生物途径获取 , 这样为研制纳米级磁性壳聚糖
材料提供新的原料源 。
柯　为
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