全 文 ：收稿日期:2008-09-29
基金项目:“九七三 ”计划前期研究专项(项目名称:西藏高寒植物种群
生存机制研究:2006CB708403)
作者简介:兰小中(1973-),男 ,四川大竹人;副教授 ,硕士 ,主要从事植
物生理生化研究;E-mail:lanxiaozhong@ 163.com。
垫状雪灵芝乙醇脱氢酶同工酶变异研究
兰小中 1 , 　权　红 2 , 　郑维列 2
(1.西藏大学农牧学院动科学院 , 　西藏 林芝 860000;
2.西藏大学农牧学院高原生态研究所 , 　西藏 林芝 860000)
摘要:以色季拉山的高寒植物垫状雪灵芝为材料 ,选取分布在海拔 4 500 ～ 4 650m范围内的垫状雪灵芝 3个居群为研究
对象 ,采用聚丙烯酰胺琼脂电泳技术 , 对垫状雪灵芝 3个居群的 48个个体功能叶片的乙醇脱氢酶同工酶谱带进行测定
并编码 ,依据酶谱带测定结果进行聚类分析;同时结合乙醇脱氢酶同工酶的 3个遗传指标进行相关分析。结果表明 , 来
自同一居群的个体 ,不但同工酶谱带相似性高 , 遗传杂合度小(HeA=0.766, HeB=0.872, HeC=0.736);乙醇脱氢酶在不
同居群间的相似性系数的平均值相对较小 , 遗传距离相对较大(IAB=0.539, IAC=0.367, IBC=0.513;DAB=0.618, DAC=
1.002, DBC=0.667)。研究数据显示 ,垫状雪灵芝乙醇脱氢酶同工酶在不同的居群之间存在一定程度的遗传分化 , 缺少
有效的基因交流。
关键词:　垫状雪灵芝;同工酶;乙醇脱氢酶;遗传多样性;高寒植物
中图分类号:　S791.410.1(275);　Q946.5　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2009)01-0007-05
AStudyonVarianceofAlcoholDehydrogenaseIsozymic
ofArenariapulvinataEdgew.inTibet
LANXiao-zhong1 , QUANHong2 , ZHENGWei-lie2
(1.DepartmentoftheAnimalScienceandTechnology, AgricultureandAnimalHusbandryColege,
TibetUniversity, Linzhi, 860000, China;　2.ResearchInstituteofPlateauEcology,
AgricultureandAnimalHusbandryColege, TibetUniversity, Linzhi860000 , China)
Abstract:TheAlcoholdehydrogenase(ADH)isozymicbandsoffunctionalleavesof48individualfrom3isola-
tedpopulationofalpineplantArenariapulvinataEdgew.weredeterminedbypolyacrylamidegelelectrophore-
sisandcoded, whichdevelopedonaltitude4 500-4 650mrangeinSejilaMount.Meanwhiletheclusteranaly-
sisoftheisozymicbandshasbeenmadeand3geneticindexesofperoxidasewereanalysed.Theresultsindi-
catethatindividualsfromthesamepopulationshowhighersimilarityinisozymicbandsandgeneticheterozy-
gosityissmal(HeA=0.766, HeB=0.872, HeC =0.736).Themeansofgeneticidentityindexofalcoholde-
hydrogenaseisbiggerthanthatofotherisozymicofArenariapulvinataEdgew.andgenticdistanceisbigger
thanthatofotherisozymic(IAB =0.539, IAC =0.367, IBC=0.513;DAB =0.618, DAC=1.002, DBC=0.667).
ResultsdatafromthisstudyshowthatthealcoholdehydrogenaseisozymicofArenariapulvinataEdgew.exist
someextentgeneticdiferentiationandlackofefectivegeneflowamong3 populationofArenariapulvinata
Edgew..
Keywords:　ArenariapulvinataEdgew.;isozymes;alcoholdehydrogenase;geneticdiversity;alpineplant
　　垫状雪灵芝为石竹科 ,无心菜属 ,多年生垫状草
本 ,呈圆球形 。根圆锥形 ,细而长 ,长 15 ～ 20cm,径 3
～ 4mm。茎高 4 ～ 5 cm,紧密丛生 ,由基部叉状分枝 ,
下部宿存褐色枯叶[ 1] 。
乙醇脱氢酶 (ADH)是广泛存在于动植物和微生
物中的一种同工酶 ,它的生理作用是适应厌氧酵解的
需要[ 2] 。此酶广泛存在于人和哺乳动物的肝脏 、植物
组织及微生物细胞。开展垫状雪灵芝乙醇脱氢酶的研
究 ,旨在通过对其不同群落分布的垫状雪灵芝个体水
平上同工酶变异及遗传分化和环境因子的关系的数量
分析研究 ,揭示垫状雪灵芝不同居群个体水平上同工
酶变异差异性及其与环境因子的关系 ,为该物种的种
群生存机制和濒危保护提供一定的理论依据。
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研究报告　　兰小中 等:垫状雪灵芝乙醇脱氢酶同工酶变异研究
图 1　垫状雪灵芝乙醇脱氢酶同工酶谱带
表 2　垫状雪灵芝乙醇脱氢酶谱带分类
居群 Rf值
0.14 0.22 0.23 0.25 0.29 0.32 0.34 0.36 0.38 0.41 0.43 0.47 0.50 0.51 0.52 0.56 0.58 0.59 0.62 0.63 0.65 0.67 0.74
A - + - - + - + - - - + - - + - - + - + - - + +
B - - - + - - - - + - - + - - + - - + - - - + +
C + - + - - + - + - + - - + - - + - - - + + + +
归类 Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅳ
1　材料与方法
1.1　取材及样品提取
2007年 8月 25日 ,从色季拉山垫状雪灵芝分布
区内不同居群分别采取垫状雪灵芝新鲜样品 ,每个居
群内随机采取 16个样品 ,一共采集 48株个体的新鲜
功能叶片 ,各样品采样质量见表 1。置研钵中 ,加入 2
倍于样品的电极缓冲液(1g样品加入 2ml缓冲液 ,电
极缓冲液为 Tris-Gly),粗过滤 ,将滤液在 TGL-16 G高
速离心机中 ,以 15 000r/min的速度离心 20 ～ 25min,
取上清液 ,最后加入等体积的质量浓度为 40%的蔗糖
溶液和 10μl质量浓度为 3%的溴酚蓝指示剂制成样
品液于冰箱中保存备用[ 3 ～ 6] 。
表 1　垫状雪灵芝各植株采样叶片质量(g)
样品编号 　　　　　　　样品质量　　　　　　　居群 A 居群 B 居群 C
1 0.312 0.331 0.319
2 0.322 0.317 0.321
3 0.334 0.335 0.332
4 0.340 0.329 0.325
5 0.314 0.337 0.327
6 0.325 0.333 0.313
7 0.334 0.337 0.327
8 0.341 0.331 0.329
9 0.331 0.328 0.325
10 0.319 0.323 0.334
11 0.328 0.331 0.311
12 0.337 0.334 0.324
13 0.326 0.339 0.329
14 0.337 0.336 0.337
15 0.327 0.337 0.328
16 0.336 0.325 0.335
1.2　电　泳
采用不连续聚丙烯酰氨垂直平板凝胶电泳法。先
制胶 ,分离胶质量浓度为 7%,浓缩胶质量浓度为 3%;
乙醇脱氢酶的分离胶用质量浓度为 0.04%的核黄素
溶液作聚合剂 ,接着用微量进液器在每样品槽中加入
30μl样品提取液 ,接通电源 ,开始以 120 V电压电泳
60min,然后待样品跑进分离胶时把电压升至 240V,
恒压电泳至溴酚蓝带走到距凝胶末端 1 cm处为止。
取下胶板 ,用去离子水冲洗干净 ,然后用 NBT染色(染
色前加 95%乙醇 2ml作为底物 ,染色后 ,同工酶谱带
为蓝色背景上的白色条带),冲洗 ,画图 ,固定 ,记录并
计算 Rf值 。
1.3　电泳的结果处理
将垫状雪灵芝乙醇脱氢酶同工酶的照片导入电脑
中 ,并对其进行校正处理 ,以酶谱带的值依次确定谱带
名(见图 1),并根据 0/1二态编码原则绘制出乙醇脱
氢酶的二态矩阵表(略),以及酶谱带分类表与类型比
例表(见表 2、3)。
根据酶是基因的产物及酶谱与基因相对照原理得
出基因频率 、遗传杂合度 、遗传相似性系数和遗传距
离 [ 7, 8] ,各指标的计算公式分别为:
He=1-∑xi2 /n
I=∑xi×yi/(∑xi2 ×∑yi2)1/2
D=-lnI
式中:He为遗传杂合度;I为相似性系数;D为遗
传距离;xi, yi为分别为 x及 y居群第 i个等位基因频
率 。根据各种酶的基因频率(见表 4),其遗传系数计
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第 28卷　第 1期　2009年 1月　　　　　　　 　　　　种　子　(Seed)　　　　　　　　　　　　Vol.28　No.1　Jan.　2009
表 3　垫状雪灵芝乙醇脱氢酶谱带类型比例
酶谱
类型
居　　群
A B C 酶谱带 Rf值
所占总谱带
百分比(%)
Ⅰ + + + 0.67 4
- - + 0.14, 0.23, 0.32, 0.36, 0.41, 0.50, 0.56, 0.63, 0.65
Ⅱ + - - 0.22, 0.29, 0.34, 0.43, 0.51, 0.58, 0.62 92
- + - 0.25, 0.38, 0.47, 0.52, 0.59
Ⅳ + + + 0.74 4
表 4　垫状雪灵芝乙醇脱氢酶的基因频率
居群 Rf　值
0.14 0.22 0.23 0.25 0.29 0.32 0.34 0.36 0.38 0.41 0.43 0.47 0.50 0.51 0.52 0.56 0.58 0.59 0.62 0.63 0.65 0.67 0.74
A 0.00 0.38 0.00 0.00 0.25 0.00 0.50 0.00 0.00 0.00 0.81 0.00 0.00 0.69 0.00 0.00 0.56 0.00 0.50 0.00 0.00 0.69 1.00
B 0.00 0.00 0.00 0.06 0.00 0.00 0.00 0.00 0.25 0.00 0.00 0.31 0.00 0.00 0.19 0.00 0.00 0.50 0.00 0.00 0.13 0.50 1.00
C 0.31 0.00 0.63 0.00 0.00 0.38 0.00 0.25 0.00 0.69 0.00 0.00 0.38 0.00 0.00 0.69 0.00 0.00 0.00 0.56 0.63 0.69 0.88
算得出:HeA =0.766, HeB =0.872,
HeC =0.736;IAB =0.539, IAC =
0.367, IBC =0.513;DAB =0.618,
DAC=1.002, DBC=0.667。
将乙醇脱氢酶的原始数据矩阵
(0/1二态数据矩阵),通过 DPS软
件利用 Jaccard结合系数加权平均
法(WPGMA)和组平均法(UPGMA)进行聚类 , Sokal结
合系数加权平均法(WPGMA)和组平均法 (UPGMA)
进行聚类[ 9, 10] ,得出树状聚类图(见图 2 ～ 5)。
2　结果与分析
2.1　遗传指标分析
由乙醇脱氢酶(AlcoholDehydrogenase, ADH)电泳
结果及各遗传指标可知 ,乙醇脱氢酶在居群 A、B、C内
的遗传杂合度分别为 0.766、0.872和 0.736。这说明
垫状雪灵芝在居群内存在较大程度的遗传分化(这种
分化及遗传多样性大小顺序为 B>A>C),并且 ,从乙
醇脱氢酶的角度来看 ,在居群 B内的遗传分化程度最
显著。
居群 A与 B的遗传相似性系数为 0.539,遗传距
离为 0.618 ,居群 A与 C的遗传相似性系数为 0.367,
遗传距离为 1.002,居群 B与 C的遗传相似性系数为
0.513,遗传距离为 0.667。表明该物种居群间存在着
相当大的遗传分化和一定的遗传距离(3居群遗传距
离的远近关系为 DAC>DBC>DAB),其中 DAC的值
大于 1.000。乙醇脱氢酶同工酶的遗传变异在 A与
C, B与 C居群间表现得尤为突出 ,而居群 A与 B之间
的分化程度则相对较小。
2.2　同工酶谱带分析
由垫状雪灵芝乙醇脱氢酶同工酶谱示意图(图 1)
及表 4可知 ,在居群内的个体植株间同工酶谱有很大
的相似性 ,而在居群间又表现出同工酶的较大变异性。
如居群 A中 , Rf值为 0.43、0.74时 , 基因频率等于
1.00或接近 1.00, Rf值为 0.51、0.67时基因频率均大
于 0.60;在 B居群中 , Rf值为 0.74时 ,基因频率等于
1.00;在 C居群中 , Rf值为 0.74时 , 基因频率接近
1.00, Rf值为 0.23、0.41、0.56、0.65、0.67时基因频率
均大于 0.60。充分表明在垫状雪灵芝居群内部的细
胞色素氧化酶同工酶存在较大程度的遗传相似性 ,遗
传分化小。然而从居群间来看 ,只有在 Rf值为 0.74
时 , A、B、C三个居群的基因频率相对较高 , 分别为
1.00、1.00、0.88,但在其他位点的变异程度较大 ,如在
Rf值为 0.23、0.41、0.56、0.65时 , A居群中基因频率
均为 0, B居群中只有在 Rf值为 0.65时基因频率 ,其
他位点的基因频率均为 0,而 C居群中此时的基因频
率均大于 0.60;在 Rf值为 0.14、0.32、0.36、0.50时 ,
A、B居群中的基因频率均为 0,而 C居群中的基因频
率分别为 0.31、0.38、0.25、0.38。表明 A居群与 B居
群的相似性大于 B与 C和 A与 C,这与前面计算的结
果完全一致 。由此可见 ,垫状雪灵芝的乙醇脱氢酶同
工酶在居群内有较大的相似性 ,在居群间却发生了很
大程度的遗传分化 , A与 C居群间的遗传距离高达
1.002。乙醇脱氢酶在居群间的变异趋势与细胞色素
氧化酶和过氧化物酶的变化趋势出现了一定程度的差
异 ,说明垫状雪灵芝在进化过程中发生的变异现象并
不是针对所有的同工酶 ,并且变异的程度也存在很大
差异。
从表 2、3可以看出 ,垫状雪灵芝乙醇脱氢酶的酶
谱类型中 ,以 I型酶谱比例较大 ,占总谱带的 92%,
I型酶谱只有 4%,而 I型酶谱才是维持种群稳定的主
要因素 。如果 I型酶谱所占比重较大 ,则说明居群间
的相似性系数较大 ,居群间存在广泛的基因交流 ,该物
种的基因多样性也较为复杂 ,有利于种群增长与扩大 ,
然而 ,我们的实验结果却恰恰相反 ,这对垫状雪灵芝的
种群稳定(或增长)而言是不利因素。
2.3　居群聚类分析
从垫状雪灵芝乙醇脱氢酶的聚类图(图 2 ～ 5)可
知:以 Jaccard结合系数加权平均法(JAC-WPGMA)聚
类的树状图 ,在JAC-0.84处可划分为A 、B两个表
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研究报告　　兰小中 等:垫状雪灵芝乙醇脱氢酶同工酶变异研究
　　图 2　垫状雪灵芝乙醇脱氢酶 Jaccard加权平均法　　　　　　　　图 3　垫状雪灵芝乙醇脱氢酶 Jaccard组平均法
(JAC-WPGMA)聚类图　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(JAC-UPGMA)聚类图
　　图 4　垫状雪灵芝乙醇脱氢酶 Sokal加权平均法　　　　　　　　　图 5　垫状雪灵芝乙醇脱氢酶 Sokal组平均法
(Sokal-WPGMA)聚类图　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(Sokal-JPGMA)聚类图
　　注:图 2～ 5中 A 、B表示聚类后的表征群 , a、b、c、d表示聚类后的亚表征群。
征群 , A表征群的构成比较复杂 ,主要由来自居群 A
的 16个个体 、居群 B的 16个个体和居群 C的 14个个
体构成 , B表征群由来自居群 A的 36、45号个体构
成 。在 JAC-0.73处可划分为 a、b、c、d4个亚表征群 ,
A表征群包括 a、b、c-JAC-0.73三个亚表征群 , B表
征群包括 d-JAC-0.73三个亚表征群 。a亚表征群主要
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第 28卷　第 1期　2009年 1月　　　　　　　 　　　　种　子　(Seed)　　　　　　　　　　　　Vol.28　No.1　Jan.　2009
由居群 C的 14个个体构成 ,而 b亚表征群主要由居群
B的 15个个体组成 , c亚表征群由 A居群的 16个个
体和 B居群的 21号个体构成 , d亚表征群由 C居群的
36和 45号个体构成 。在同一个居群中的大部分个体
表现出汇聚性的同时 ,也表现出一定的趋异性。在垫
状雪灵芝乙醇脱氢酶的 Jaccard结合系数的组平均法
(UPGMA)聚类图中 ,可在 JAC-0.86处划分为 A 、B
两个表征群 。A表征群主要由 A、B居群的全部个体
和 C居群的 14个个体构成 , B表征群由 C居群的 36
和 45号个体构成。在 JAC-0.78处可划分为 a、b、c、d
4个亚表征群 。a亚表征群主要由来自 C居群的 14个
个体构成 , b亚表征群主要由来自 A居群的全部个体
构成 , c亚表征群主要由 B居群的全部个体构成 , d亚
表征群由 C居群的 36和 45号个体构成。在垫状雪灵
芝乙醇脱氢酶的 Sokal加权平均法(WPGMA)聚类图
中 ,可在 SOK-0.34处划分为 A 、B 两个表征群。 A
表征群主要由 A、B居群的全部个体和 C居群的 14个
个体构成 , B表征群由 C居群的 36和 45号个体构
成 。在 SOK-0.30处可划分为 a、b、c3个亚表征群。
在垫状雪灵芝乙醇脱氢酶的 Sokal组平均法(UPG-
MA)聚类图中 ,可在 SOK-0.32处划分为 A 、B 两个
表征群 。A表征群主要由 A、B居群的全部个体和 C
居群的 14个个体构成 , B表征群由 C居群的 36和
45号个体构成 。在 SOK-0.25处可划分为 a、b、c4个
亚表征群。
图 2 ～ 5所表现出的不同聚类结果主要是由不同
的聚类方法所致 。无论是 3个还是 4个亚表征群 ,都
说明一个共同的问题 ,尽管居群间存在一定的遗传分
化 ,但居群内部的个体间仍然存在一定的相似性 ,以至
于在进行聚类时 ,出现混聚的现象 。出现这种现象是
和垫状雪灵芝的生长环境有直接关系的 ,尽管垫状雪
灵芝在居群间的基因交流并不频繁 ,但垫状雪灵芝生
长在高山地区 ,成熟的种子会在降雨的时候与地表的
水流一起发生迁移 ,最终导致在不同的居群个体间出
现混聚的现象。从乙醇脱氢酶同工酶的不同聚类图可
以看出 ,尽管在遗传距离较高水平时的表征群分类和
环境中的自然居群分类并不一致 ,但在遗传距离较小
时的亚表征群分类和自然居群分类基本一致。
然而 ,从图 2 ～ 5还可以看出 , A居群中的 3、10与
12号个体 , B居群中的 19与 29号个体 , 19、 25与 27
号个体均具有高度的汇聚性 ,遗传相似性极高 ,它们在
遗传距离为 0的位置便聚在一起 。同时 ,出现高度汇
聚性的个体并不发生在居群间 ,而是在居群内部 ,这与
垫状雪灵芝在开花授粉时的相互交流是分不开的。
3　结　论
对垫状雪灵芝进行 Jaccard、Sokal结合系数的加
权平均法和组平均法的分析 ,都可得到同样的结论:来
自不同居群的个体植株的酶谱均存在一定的相似性 ,
表现出了个体间存在一定的遗传同质性 。在图 2 ～ 5
中 ,表征群内的 3个小居群都或多或少的发生了一定
的趋异性 ,说明 3个居群具有一定的亲缘关系 ,但这种
亲缘关系的进化趋势却很难判断。从这些数据的分析
来看 ,在早期 (可能是几千年 ,也可能是几万年 ,甚至
更长的时间),垫状雪灵芝在色季拉山一带的分布应
当是连续的 ,并且生长状况良好 ,只是在后来的漫长进
化过程中 ,由于其它灌木(如杜鹃花科植物等)的快速
发展 ,构建了垫状雪灵芝在环境中的生物因子隔离和
非生物因子(空间)隔离 ,才导致了如今的分布格局 。
垫状雪灵芝的种群分布格局不是单纯与同工酶变
异及遗传分化有直接关系 ,还与青藏高原这种特殊的
生态环境以及垫状雪灵芝生长条件有极大关系 。
综上所述 ,垫状雪灵芝居群内个体存在较大的遗
传同质性 ,居群间个体存在不同程度的遗传分化 ,这些
都是高寒植物垫状雪灵芝在特殊和特定的生态环境中
长期演化的结果 。
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研究报告　　兰小中 等:垫状雪灵芝乙醇脱氢酶同工酶变异研究