全 文 ：第30卷第 12期　　　　　　　 　西 南 大学 学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　2008年1 2月
Vol.30　No.12 Journal of Southw est Unive rsity (N atural Science Edi tion) Dec.　2008
文章编号:1673-9868(2008)12-0139-06
高寒植物垫状雪灵芝细胞色素氧化酶变异研究＊
兰小中1 , 　权　红2 , 　郑维列2 , 　卢　杰2
1.西藏大学 农牧学院 , 西藏 林芝 860000;2.西藏大学 农牧学院高原生态研究所 , 西藏 林芝 860000
摘要:以色季拉山的高寒植物垫状雪灵芝为材料 , 选取分布在海拔 4 500 ～ 4 650 m 范围内的垫状雪灵芝 3 个居群
为研究对象 , 采用聚丙烯酰胺琼脂电泳技术 , 对垫状雪灵芝 3 个居群的 48个个体功能叶片的细胞色素氧化酶同工
酶谱带进行测定并编码 , 依据酶谱带测定结果进行聚类分析;同时 , 结合细胞色素氧化酶同工酶的 3个遗传指标进
行相关分析.结果表明:来自同一居群的个体 , 尽管同工酶谱带具有一定程度的相似性 , 但居群内的遗传杂合度较
大(He A =0.752 , HeB =0.815 , HeC =0.815), 这也说明居群内个体存在一定程度的遗传分化.研究数据显示垫
状雪灵芝细胞色素氧化酶同工酶在不同的居群内与居群间存在不同程度的遗传分化 , 缺少有效的基因交流.
关　键　词:垫状雪灵芝;同工酶;细胞色素氧化酶;遗传多样性;西藏
中图分类号:Q949.745.8 文献标识码:A
垫状雪灵芝隶属于石竹科 , 无心菜属.多年生垫状草本 , 呈圆球形.根圆锥形 , 细而长 , 长15 ～ 20 cm ,
径 3 ～ 4 mm , 茎高 4 ～ 5 cm , 紧密丛生 , 由基部叉状分枝 , 下部宿存褐色枯叶[ 1] .该物种是典型的西藏高寒
植物之一.本研究通过对其不同群落分布的垫状雪灵芝个体水平上同工酶变异及遗传分化和环境因子的关
系的数量分析 , 以便揭示垫状雪灵芝不同居群个体水平上同工酶变异差异性及其与环境因子的关系 , 为该
物种的种群生存机制和濒危保护提供一定的理论依据.
1　材料与方法
1.1　取材及样品提取
2007年 8月 25日 , 从色季拉山垫状雪灵芝分布区内不同居群分别采取垫状雪灵芝新鲜样品 , 每个居
群内随机采取 16个样品 , 一共采集 48株个体的新鲜功能叶片(表 1).置研钵中 , 加入 2倍于样品的电极缓
冲液(1 g 样品加入 2 mL 缓冲液 , 电极缓冲液为 Tris-G ly)作为提取液 , 粗过滤 , 将滤液在 TG L-16G高速
离心机中 , 以 15 000 r/min的速度离心 20 ～ 25 min , 取上清液 , 最后加入等体积的质量浓度为 40%的蔗糖
溶液和 4滴质量浓度为 3%的溴酚蓝指示剂制成样品液于冰箱中保存备用[ 2-6] .
表 1　垫状雪灵芝各植株采样叶片质量/g
样品编号 样品质量居群 A 居群 B 居群 C 样品编号
样品质量
居群 A 居群 B 居群 C
1 0.312 0.331 0.319 9 0.331 0.328 0.325
2 0.322 0.317 0.321 10 0.319 0.323 0.334
3 0.334 0.335 0.332 11 0.328 0.331 0.311
4 0.340 0.329 0.325 12 0.337 0.334 0.324
5 0.314 0.337 0.327 13 0.326 0.339 0.329
6 0.325 0.333 0.313 14 0.337 0.336 0.337
7 0.334 0.337 0.327 15 0.327 0.337 0.328
8 0.341 0.331 0.329 16 0.336 0.325 0.335
＊ 收稿日期:2008-06-24
基金项目:973计划前期研究专项资助项目(2006CB708403).
作者简介:兰小中(1973 ), 男 , 四川大竹人, 副教授 , 硕士 , 主要从事植物生理生化研究.
DOI :10.13718/j.cnki.xdzk.2008.12.013
1.2　电　　泳
采用不连续聚丙烯酰氨垂直平板凝胶电泳法.先制胶:分离胶质量浓度为 7%, 浓缩胶质量浓度为
3%;细胞色素氧化酶的浓缩胶用质量浓度为 0.04%的核黄素溶液作聚合剂 , 接着用微量进液器在每个样
品槽中加入 30 μL 样品提取液 , 接通电源 , 开始以 100 V 电压电泳 30 min , 然后待样品跑进分离胶时把电
压升至 200 V , 恒压电泳至溴酚蓝带走到距凝胶末端 1 cm 处为止.取下胶板 , 用去离子水冲洗干净 , 然后
用1%二甲基对苯二胺∶1%α-萘酚(用40%的乙醇配制)∶pH 7.4的 1 mo l/L 的磷酸缓冲液=1∶1∶25的
混合液染色(在 37 ℃条件下染色 10 min , 酶带呈现天蓝色), 冲洗 , 画图 , 固定 , 记录并计算 Rf值[ 2-6 , 11] .
1.3　电泳的结果处理
将垫状雪灵芝细胞色素氧化酶同工酶的照片导入电脑中 , 并对其进行校正处理 , 以酶谱带的值依次确
定谱带名(图 1), 并绘制出酶谱带分类表与类型比例表(表 2 , 3).
根据酶是基因的产物及酶谱与基因相对照原理得出基因频率 、遗传杂合度 、遗传相似性系数和遗传距
离[ 7-8] , 各指标的计算公式分别为:
He =1 -∑ xi 2/n　　　I =∑ xi ×yi/(∑x2i ×∑y2i)1/ 2 　　　D =-ln I
式中:He为遗传杂合度;I为相似性系数;D为遗传距离;x i , y i分别为 x及 y 居群第 i个等位基因频率.根
据各种酶的基因频率(表 4), 计算其遗传系数得出:He A =0.752 , HeB =0.815 , HeC =0.815;I AB =
0.418 , I AC =0.304 , IBC =0.673;D AB =0.873 , D AC =1.192 , DBC =0.396.
注:1-16号为居群 A;17-32号为居群 B;33-48号为居群 C.
图 1　垫状雪灵芝细胞色素氧化酶同工酶谱带图
表 2　垫状雪灵芝细胞色素氧化酶谱带分类
居群 Rf值
0.08 0.11 0.14 0.19 0.20 0.21 0.25 0.26 0.30 0.31 0.32 0.34 0.35 0.37 0.38 0.46 0.48 0.52 0.55 0.56 0.58 0.62 0.63 0.66 0.68
A + + - + - + + - - + + - - + - + + + - - + - + + -
B - - + - + - - + + - - + - - + - + + - - - + - - +
C - - - - + - + - - + - - + - + - + - + + - + - - -
归类 Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅴ Ⅱ Ⅴ Ⅱ Ⅱ Ⅴ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅴ Ⅱ Ⅰ Ⅴ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅴ Ⅱ Ⅱ Ⅱ
表 3　垫状雪灵芝细胞色素氧化酶谱带类型比例
酶谱类型 居群
A B C
酶谱带 Rf值 所占总谱带百分比/ %
Ⅰ + + + 0.48 4
Ⅱ
+ - - 0.08 , 0.11 , 0.19 , 0.21 , 0.32 , 0.37 ,
0.46 , 0.58 , 0.63 , 0.66
- + - 0.14 , 0.26 , 0.30 , 0.34 , 0.68
- - + 0.35 , 0.55 , 0.56
72
Ⅴ
- + + 0.20 , 0.38 , 0.62
+ - + 0.25 , 0.31
+ +- 0.52
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表 4　垫状雪灵芝细胞色素氧化酶的基因频率
居群 Rf值
0.08 0.11 0.14 0.19 0.20 0.21 0.25 0.26 0.30 0.31 0.32 0.34 0.35 0.37 0.38 0.46 0.48 0.52 0.55 0.56 0.58 0.62 0.63 0.66 0.68
A 0.31 0.25 0.00 0.13 0.00 0.19 0.38 0.00 0.00 0.19 0.50 0.00 0.00 0.50 0.00 0.69 0.75 0.44 0.00 0.00 0.94 0.00 0.75 0.44 0.00
B 0.00 0.00 0.19 0.00 0.56 0.00 0.00 0.63 0.56 0.00 0.00 0.56 0.00 0.00 0.31 0.00 0.63 0.44 0.00 0.00 0.00 0.69 0.00 0.00 0.25
C 0.00 0.00 0.00 0.00 0.31 0.00 0.75 0.00 0.00 0.38 0.00 0.00 0.38 0.00 0.44 0.00 0.88 0.00 0.31 0.69 0.00 0.69 0.00 0.00 0.00
　　将细胞色素氧化酶的原始数据矩阵(0/1二态数据矩阵), 通过 DPS 软件利用 Jaccard 结合系数加权平
均法(WPGMA)和组平均法(UPGMA)进行聚类 , Sokal结合系数加权平均法(WPGMA)和组平均法(UP-
GMA)进行聚类[ 9-10] , 得出树状聚类图(图 2 ,3 ,4 ,5).
图 2　垫状雪灵芝细胞色素氧化酶 Jaccard
加权平均法(JAC-WPGMA)聚类图
图 3　垫状雪灵芝细胞色素氧化酶 Jaccard
组平均法(JAC-UPGMA)聚类图
图 4　垫状雪灵芝细胞色素氧化酶 Soka
加权平均法(Sokal-WPGMA)聚类图
图 5　垫状雪灵芝细胞色素氧化酶 Soka
组平均法(Sokal-UPGMA)聚类图
注:图 2 , 3 , 4 , 5 中 A、 B表示聚类后的表征群 , a、 b 、 c、 d 表示聚类后的亚表征群.
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2　结果与分析
2.1　遗传指标分析
由细胞色素氧化酶(Cytochrome Oxidase , Cy t)电泳结果及各遗传指标可知 , 细胞色素氧化酶在居群
A 、B 、C内的遗传杂合度分别为 0.752 ,0.815和 0.815.这说明垫状雪灵芝在居群内存在较大程度的遗传
分化(这种分化及遗传多样性大小顺序为B=C>A), 并且从细胞色素氧化酶的角度来看 , 在居群 B和 C之
间存在相同的遗传杂合度 , 其值均等于 0.815.
居群 A 与 B的遗传相似性系数为0.418 , 遗传距离为 0.873 , 居群 A与 C 的遗传相似性系数为 0.304 ,
遗传距离为 1.192 , 居群 B与 C 的遗传相似性系数为 0.673 , 遗传距离为 0.396.这些数据表明 , 该物种居
群间存在着相当大的遗传分化和一定的遗传距离(3个居群遗传距离的远近关系为 DAC >DAB >DBC), 其中
DAB的值接近 1.000 , 而 DAC的值则接近 1.200.细胞色素氧化酶同工酶的遗传变异在 A 与 B , A 与 C 居群
间表现得尤为突出 , 造成这种现象的原因可能是由于垫状雪灵芝是一种高寒草本植物 , 植株个体矮小 , 在
群落中处于最底层 , 因为环境中其它灌木的遮挡 、隔离 , 导致居群间无法进行正常的基因交流所致;而居
群 B和 C之间的相似性系数较高(0.673), 遗传距离较小 , 是因为这两个居群在环境中分布在同一坡面上 ,
只是居群 B位于山坡下部 , 而居群 C位于山坡中上部 , 在外界机械作用(风力)下 , 在开花授粉季节 , 居群
之间是可以发生基因交流的.从遗传距离的角度来看 , 细胞色素氧化酶在居群间的分化程度与过氧化物酶
在 3个居群间的分化程度和分化趋势是基本一致的 , 都是 DAC >DAB >DBC .
2.2　同工酶谱带分析
由垫状雪灵芝细胞色素氧化酶同工酶谱示意图(图 1), 同时参见表 4可知 , 在居群内的个体植株间同
工酶谱有很大的相似性 , 而在居群间又表现出同工酶的较大变异性.如居群 A 中 , Rf 值为 0.48 , 0.58和
0.63时 , 基因频率接近 1.00 , Rf值为 0.46时基因频率均大于 0.60;在 B 居群中 , Rf值为 0.26 ,0.48和
0.62时 , 基因频率均大于 0.60;在 C 居群中 , Rf 值为 0.25 ,0.48时 , 基因频率接近 1.00 , Rf值为 0.56 ,
0.62时基因频率均大于 0.60.这些数据充分表明在垫状雪灵芝居群内部的细胞色素氧化酶同工酶存在较
大程度的遗传相似性 , 遗传分化小.然而 , 从居群间来看 , 如在 Rf 值为 0.58 时 , A 居群中基因频率为
0.94 , 而居群 B与 C中此时的基因频率均为 0;在 Rf值为 0.46 , 0.63时 , A 居群中的基因频率均在 0.70
左右 , 而 B 、C 居群中的基因频率都为 0;在 Rf值为 0.25 , 0.56 , 0.62 时 , A 居群中的最大基因频率为
0.38 , B居群只有在 Rf值为 0.62时基因频率为 0.69 , 其它位点的基因频率均为 0 , 而 C 居群中的基因频
率分别为 0.75 ,0.69 , 0.69.这些数据充分表明 B居群与 C居群的相似性大于 A与 B和 A 与 C , 这与前面
计算的结果完全一致.由此可见 , 尽管垫状雪灵芝的细胞色素氧化酶同工酶在居群内存在一定的相似性 ,
但在居群间发生的遗传分化较大.
从表 2 , 3可以看出 , 垫状雪灵芝细胞色素氧化酶的酶谱类型中 , 以 II 型酶谱比例较大 , 占总谱带的
72%, I 型酶谱只有 4%, 而 I 型酶谱才是维持种群稳定的主要因素.如果 I 型酶谱所占比重较大 , 则说明
居群间的相似性系数较大 , 居群间存在广泛的基因交流 , 该物种的基因多样性也较为复杂 , 有利于种群增
长与扩大.然而 , 我们的实验结果却恰恰相反 , 这对垫状雪灵芝的种群稳定(或增长)是不利的.
2.3　居群聚类分析
从垫状雪灵芝细胞色素氧化酶的聚类图(图 2 , 3 , 4 , 5)可知 , 以 Jaccard 结合系数加权平均法(JAC-
WPGMA)聚类的树状图 , 在 JAC-0.88处可划分为 A′、B′2个表征群 , A′表征群主要由居群 A 的 16 个个
体构成 , B′表征群主要由居群 B和居群 C 的 32个个体构成.在 JAC-0.84 处可划分为 a 、 b 、 c 3个亚表征
群 , A′表征群包括 a-JAC-0.84一个亚表征群 , B′表征群包括 b 、 c-JAC-0.84二个亚表征群.a亚表征群主
要由居群 A 的所有个体构成 , b亚表征群主要由除居群 C 的 35 , 41 , 47号个体外的 29个个体构成 , c亚表
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征群主要由居群 C 的 35 ,41 , 47号个体构成.在同一个居群中的大部分个体表现出汇聚性的同时 , 也表现
出一定的趋异性.居群 B和居群 C 表现出了较高的汇聚性 , 这与遗传系数计算结果一致.在垫状雪灵芝细
胞色素氧化酶的 Jaccard结合系数的组平均法(JAC-U PGMA)聚类图中 , 可在 JAC-0.89处划分为 A′、B′2
个表征群.A′表征群主要由居群 A 的 16个个体构成 , B′表征群主要由居群 B和居群 C 的 32个个体构成.
在 JAC-0.82处可划分为 a 、 b 、 c 3个亚表征群.a亚表征群主要由居群 A 的所有个体构成 , b亚表征群主
要由来自 B居群的全部个体构成 , c亚表征群主要来自 C 居群内的所有个体构成.在垫状雪灵芝细胞色素
氧化酶的 Sokal加权平均法(SOK-WPGMA)聚类图中 , 可在 SOK-0.39处划分为 A′、B′2个表征群.A′表
征群主要由 B居群和 C居群的所有个体构成 , B′表征群主要由 A 居群的所有个体构成.在 SOK-0.30处可
划分为 a、 b 、c 、d 4个亚表征群 , a亚表征群主要由 B居群的全部个体构成 , b 亚表征群主要由C 居群的全
部个体构成 , c亚表征群主要由 A居群中除 12号个体外的15个个体构成 , d亚表征群只由 A居群的 12号
个体构成.在垫状雪灵芝细胞色素氧化酶的 Sokal组平均法(SOK-UPGMA)聚类图中 , 可在 SOK-0.37处
划分为 A′、B′2个表征群.A′表征群主要由 A 居群的所有个体构成 , B′表征群主要由 B居群和 C 居群的
全部个体构成.在 SOK-0.32处可划分为 a 、 b 、 c 3个亚表征群.
图 2 ,3 , 4 ,5所表现出的不同聚类结果主要是由不同的聚类方法所致.无论是 3个亚表征群 , 还是 4个
亚表征群 , 它们都表现出相似的结果 , 即居群间的遗传分化较大.而居群 B与 C 的遗传分化相对较小 , 居
群 A与 B 和 C的遗传分化相对较大 , 这与遗传系数分析和酶谱分析的结果一致.
从图 2 , 3 ,4 , 5我们还可以看出 , B居群中的 29与 31号个体 , C 居群中的 41和 47号个体均具有高度
的汇聚性 , 在遗传距离为 0的位置便可发生聚类 , 出现这种现象与过氧化物同工酶的变异基本保持一致.
3　讨　　论
1)无论是对垫状雪灵芝细胞色素氧化酶同工酶谱的分析 , 还是对其进行 Jaccard 、 Sokal结合系数的加
权平均法和组平均法的分析 , 都可得到同样的结论.来自不同居群的个体植株的酶谱均存在一定的相似
性 , 表现出了个体间存在一定的遗传同质性 , 而且在图 2 , 3 ,4 , 5中表征群内的 3个小居群都或多或少地发
生了一定的趋异性 , 这说明 3个居群具有一定的亲缘关系.这些研究结果为高寒植物垫状雪灵芝的种群生
存机制分析和濒危保护提供了科学的理论依据.
2)从理论上讲 , 野外生境中的居群(A 、B 、C)设置与聚类后的表征群应当是一致的 , 但研究结果表明
垫状雪灵芝的实际分布和聚类后的表征群并不完全一致 , 其一致性主要体现在亚表征群水平上.这说明垫
状雪灵芝在长期进化过程中演化出了自身的生存和适应机制 , 尽管开花授粉季节的基因交流会受到很大阻
碍 , 但垫状雪灵芝特殊的生境(坡地)为其种子传播提供了有利条件 , 从而导致居群间出现了较大程度的混
聚现象 , 这与其它学者在进行灌木和乔木的种群生态学研究方面的结论是不一致的.
3)垫状雪灵芝的种群分布格局不单纯与同工酶变异及遗传分化有直接关系 , 还与青藏高原这种特殊
的生态环境以及垫状雪灵芝生长条件有极大关系.我们所采用的聚丙烯酰胺电泳技术 , 只是对其蛋白质进
行了研究 , 对于解决垫状雪灵芝的居群之间的遗传变异是不够的.为了科学地阐述垫状雪灵芝居群间的遗
传变异 , 必须借助 DNA分子水平的分子标记手段 , 才能更为科学 、有效地评判 , 这也是我们下一步开展研
究的方向.
垫状雪灵芝居群内个体存在较大的遗传同质性 , 居群间个体存在不同程度的遗传分化 , 这些都是高寒
植物垫状雪灵芝在特殊和特定的生态环境中长期演化的结果.
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A Study on Variation in CytochromeOxidase of the Alpine Plant
Arenaria pulvinata Edgew in Tibet
LAN Xiao-zhong1 , 　QUAN 　Hong2 , 　ZHENG Wei-lie1 , 　LU 　Jie2
1.Department of Animal Science and Technology , Agriculture and Animal Husbandry College ,
　 Tibet University , Linzhi Tibet 860000 ,China;
2.Research Institute of Plateau Ecology , Agriculture and Animal Husbandry College , Tibet University , Linzhi Tibet 860000 , China
Abstract:The cy tochrome ox idase (Cy t)i sozymic bands o f the functional leaves of 48 individuals f rom 3
isolated popula tions of the alpine plant Arenaria pulv inata Edgew , g rowing at alt.4 500 ～ 4 650 m on
Mountain Seji la , were determined by po ly acry lamide gel elect rophoresis and coded.Cluster analy sis o f the
isozymic bands w as made and 3 genet ic indexes of cy tochrome oxidase w ere analy sed.The resul ts indicated
that individuals f rom the same population show ed some similarity in thei r isozymic bands , although thei r
genet ic heterozygosi ty w as great(HeA =0.752 , HeB =0.815 and HeC =0.815), suggesting tha t some ge-
netic dif ferentiation existed among the individuals of the same population.Resea rch data demonst rated that
the cytochrome oxidase isozymes of A.pulvinata Edgew had undergone some int ra- and inter-population
genet ic different iation and the 3 populations lacked effective gene f low among themselves.
Key words:Arenaria pulvinata Edgew.;isozyme;cy to chrome oxidase;genetic diversity ;Tibet
责任编辑　夏　娟　　　　
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