全 文 ：农 药
AGROCHEMICALS
第52卷第9期
2013年9月
Vol. 52, No. 9
Sep. 2013
垂序商陆抗烟草花叶病毒活性物质提取及分离
葛永辉1，张 婕1，刘开兴2，向章敏1，耿召良1
(1.贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081； 2.贵州省中科院 天然产物化学重点实验室，贵阳 550002)
摘要：[目的]探讨垂序商陆提取物的抗TMV活性，为从植物中开发抗病毒类生物农药提供依据。 [方法]采用活性
追踪法从贵州垂序商陆中分离抗烟草花叶病毒活性物质。 [结果]垂序商陆果实和枝叶的部分提取物对TMV具
有明显的抑制增殖作用，4个含有三萜皂苷类化合物的组分具有较强的体外抑制TMV增殖作用。 [结论]该研究
首次从垂序商陆中发现小分子化合物具有抗TMV的活性，为下一步系统研究该种植物提供了科学依据。
关键词：垂序商陆；活性成分；烟草花叶病毒；抑制活性
中图分类号：S482.2 文献标志码：A 文章编号：1006-0413(2013)09-0680-04
Extraction and Separation of Anti-TMV Activity Extracts from Phytolacca
GE Yong-hui1, ZHANG Jie1, LIU Kai-xing2, XIANG Zhang-min1, GENG Zhao-liang1
(1.Guizhou Tobacco Science Research Institute, Guiyang 550081, China; 2.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Product of
Guizhou Province and Chinese Academy of Science, Guiyang 550002, China)
Abstract: [Aims] The study aims to investigate the anti-TMV (tobacco mosaic virus) activity of Phytolacca extract and
provide the basis for anti-viral biological pesticides from plants. [Methods] The constituent of anti-TMV activity was
isolated from Phytolacca americana Linn in Guizhou by bioassay. [Results] Extracts from Phytolaccas fruit and leaves
both significantly inhibited proliferation of TMV. Four triterpenoid saponins-containing components showed strong
in vitro inhibition of TMV proliferation. [Conclusions] The study is the fi rst to fi nd small molecule compounds from
Phytolacca with the anti-TMV activity. The work of this paper provides scientifi c basis for the next systemic research.
Key words: Phytolacca; active ingredient; tobacco mosaic virus; inhibitory activity
烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)属于披盖
病毒科(Togaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，是植
物病毒中研究最深入的病毒，也被称为模式病毒。 该病毒
寄生范围广泛，全世界均有分布，可侵染藜科、菊科、茄科
和十字花科等36科400余种植物，包括番茄、土豆、辣椒、黄
瓜以及烟草等经济作物。 据估计，全世界每年仅由烟草花
叶病毒病造成的经济损失在1亿美元以上[1]。 由于病毒的
绝对寄生性，抑制病毒病的药物很难只选择性地攻击病毒
而不伤害寄主细胞，导致目前筛选高效、专一、安全的抗病
毒制剂开发和应用面临极大困难。 随着人们对生态和安
全问题的日益重视，自20世纪90年代以来，研制高效安全
的植物病毒抑制剂逐渐成为抗病毒药物领域重点和热点。
垂序商陆(Phytolacca americana Linn)属于商陆科
(Phytolaccaceae)商陆属(Phytolacca)，是一种入侵植物，在我
国分布较广泛。 垂序商陆的干燥根一直被用作传统的泻下
逐水的中药，其性味苦寒、有毒，用于治疗痛肿风湿、慢
性气管炎、出血性疾病等，为历版中国药典收藏品种。
商陆是最早发现具有抗植物病毒活性的植物之一。 从
1948年有人从商陆中提取得到一种抗病毒的糖蛋白后[2]，近
几十年来，国内外对商陆的化学成分做了不少研究，其中对
垂序商陆的研究较多。 商陆富含皂苷和多糖，其中商陆酸
性杂多糖、商陆苷(美商陆苷)、美商陆皂苷元、商陆酸和美商
陆酸等成分陆续被分离鉴定，其中商陆皂苷类成分具有多
种抑菌、抗炎、抗肿瘤活性和增强免疫作用[3-7]。 除商陆植物
的药用研究以外，对其抗病毒的研究多集中在生物大分子
抗病毒蛋白上，对商陆植物中的小分子化合物是否具有抗
病毒作用鲜见报道。 从天然植物中寻找强活性抗病毒活
性物质对于新型植物源农药开发具有重要意义。 垂序商
陆是一种作为天然农药的常见植物，含有多种生物活性
物质。 在前人的研究工作中发现，垂序商陆中具有一系
列商陆抗病毒蛋白(Pokeweed Antivirus Proteins，PAP)及单
多肽链抗真菌蛋白[8]。 活性测试发现，PAP有广泛的抑制植
物病毒的活性，能抗黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒等病毒
病，同时，将PAP基因通过基因工程的方法转录至其他植
物中后，可产生抑制PVX、PVY、CMV和芜箐花叶病毒的
作用 [9-10]。 但对于垂序商陆中的小分子化学物质抗病毒
的研究较少。 为此，本文以垂序商陆的各植物部位的不
同溶剂萃取物以及系统分离后的化学成分，对抗烟草花
叶病毒活性成分进行了追踪和分离，旨在为植物源抗病
毒类生物农药研制和垂序商陆抗病毒小分子化合物开发
收稿日期：2013-04-11，修返日期：2013-06-24
基金项目：贵州省科学技术基金，贵州垂序商陆中抗烟草花叶病毒成分研究(黔科合J字[2010]2250号)
作者简介：葛永辉(1983—)，男，贵阳人，助理研究员，博士，主要从事天然产物化学成分研究。 E-mail：skyge@163.com。
通讯作者：耿召良(1978—)，男，副研究员，博士，主要从事烟叶安全性和天然产物研究，E-mail：Zhaolianggeng@gmail.com。
葛永辉, 张婕, 刘开兴, 等. 垂序商陆抗烟草花叶病毒活性物质提取及分离[J]. 农药, 2013, 52(9): 680-683.
681第9期
提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试植物材料
垂序商陆(P．decandra L.)采集于贵州省福泉市，供试部
位为植物的块根、枝叶和果实，植物标本由贵阳中医学院付
志明副教授鉴定，保存于贵州省烟草科学研究院标本室。
1.2 寄主植物
心叶烟(Nicotiana glutinosa)，为TMV枯斑寄主，贵州省
烟草科学研究院提供种子；普通烟K236(Nicotiana tabacum
K326)，温室中繁育，贵州省烟草科学研究院提供种子；漂盘
育苗，无虫温室中培育。 挑选6~8片叶龄，大小重量相似的
健康植株作为实验材料。
1.3 供试病毒
烟草花叶病毒(TMV)U1普通株系，由贵州省烟草科
学研究院提供。 通过常规的摩擦接种，繁殖于普通烟K326
上，采用Gooding的方法[11]提纯。 取5 μL提纯的TMV稀释
100倍，用紫外分光光度计法测定其质量浓度为16 g/L。 保
存于-20 ℃，临用时取出用0.01 mol/L磷酸缓冲液(PB)稀释
至32 mg/L。
1.4 供试样品的制备
1.4.1 粗提物样品的制备
将采集到的样品烘干粉碎后，用95%的甲醇进行加热
回流提取，提取液减压浓缩后得到植物各个部位的提取浸
膏，将浸膏分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃
取，得到不同极性的组成部分。 将各组成部分利用DMSO
及吐温溶液配制为200 mg/L的溶液。
1.4.2 三萜皂苷类化合物样品的制备
根据粗筛的结果，对该种植物中的枝叶的甲醇提取
物中乙酸乙酯萃取部分的化学成分进行系统的分离。
利用植物化学分离方法，从乙酸乙酯萃取部分共分离
得到12个组分。 将各组成部分利用DMSO及吐温溶液配
制为200 mg/L的溶液。
1.5 植物提取物对TMV的生物活性测定
1.5.1 活体钝化作用测试
采用Song等 [12 ]的方法，选长势一致的心叶烟，将
200 mg/L的供试化合物溶液和宁南霉素水剂分别与病毒
汁液按1∶1(体积比)混合钝化0.5 h后，磨擦接种于处理右
半叶片，病毒汁液与溶媒1∶1(体积比)混合摩擦接种于左
半叶，每处理3株，重复3次，置光照培养箱培养，3~4 d出斑
完全后调查心叶烟枯斑数，计算枯斑抑制率。
抑制率(%) = 对照枯斑数-处理枯斑数×100
对照枯斑数
1.5.2 离体叶圆片法
试验方法参考文献[13]，挑选健康合适的普通烟，暗
室放置1夜。 每棵烟挑选大小相似的3片叶子，每片叶子
摩擦接种32 mg/L TMV 200 μL，10 min后用无菌水冲洗
干净。 6 h后将叶片切成直径1.5 cm的圆片，取10片浸入
供试化合物溶液中作为处理；另10片浸入25 mL/L DMSO
溶液中作为阳性对照；只摩擦未接种的10片浸入25 mL/L
DMSO溶液中作为空白。 放入28 ℃光照培养箱中培养，48 h
后进行DAS-ELISA，测定OD405值，根据TMV病毒标准曲
线计算TMV质量浓度，按公式计算TMV抑制率(%)=(1-处
理的TMV质量浓度/阴性对照的TMV质量浓度)×100。
每个化合物重复3次。
1.5.3 双抗夹心ELISA(DAS-ELESA)检测
制备样品 [14]：取出离体叶圆片法样品，吸干溶液，研
出汁液作为抗原待用。 病叶、健康叶在液氮保护下研磨
成粉。 按质量体积比(kg/L)为1∶20，用提前预冷的碳酸
盐包被Buffer充分研磨匀浆。 4 ℃，120 000 g离心10 min，取
上清液。 酶标板每孔加100 μL上清液，每个处理重复8次，
37 ℃孵育2 h，或者4 ℃孵育过夜。 室温下，用PBST洗涤
酶标板孔3次，每次3 min。 将抗TMV、CMV和PVY多抗
用PBST-PVP样品缓冲液稀释到1∶200，酶标板每孔加
入100 μL，每处理重复8次，37 ℃孵育1 h。 室温下，用
PBST洗涤缓冲液洗涤酶标板孔3次，每次3 min。 每孔加用
样品缓冲液1∶30 000稀释的羊抗兔IgG-AP 100 μL，37 ℃
孵育40 min，室温下用PBST洗涤酶标板3次，每次3 min。 将
对硝基苯基磷酸二钠(pNPP)，用底物缓冲液稀释成质量浓
度为1 g/L，酶标板每孔内加入100 μL的底物，37 ℃孵育至
出现颜色反应。 在酶标仪中测定405 nm处的OD值。 配制不
同质量浓度病毒溶液(3.75、1.87、0.93、0.46、0.23 mg/L)，测定
其OD405值，作出病毒质量浓度与OD405值的相关曲线，得
到回归方程，以便按照OD405值求出病毒浓度。 计算TMV
抑制率(%)=(1-处理的TMV质量浓度/阳性对照的TMV
质量浓度)×100。
试验设阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照为
25 mL/L DMSO溶液中放置接种病毒的叶圆片，阴性对照
为未接种TMV的健康烟草叶片，空白对照为碳酸盐包被
Buffer。
1.6 数据处理
采用邓肯氏新复极差法对数据进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 垂序商陆粗提物对TMV的活体钝化作用
以TMV为供试病毒，采用半叶枯斑法测定了垂序商陆
粗提物对TMV的活体钝化作用(见表1)，并选取了具有良好
葛永辉，等：垂序商陆抗烟草花叶病毒活性物质提取及分离
682 第52卷农 药 AGROCHEMICALS
活性的粗提物成分，测定其半数抑制率(IC50值)，见图1。
表1 垂序商陆粗提物对TMV的活体钝化作用 (200 mg/L)
供试成分 抑制率/% 供试成分 抑制率/%
果(正丁醇) 64.3 根(乙酸乙酯) 51.1
果(乙酸乙酯) 0(无效) 根(石油醚) 31.9
果(石油醚) 32.1 茎(正丁醇) 43.8
叶(正丁醇) 60.3 茎(乙酸乙酯) 32.4
叶(乙酸乙酯) 70.6 茎(石油醚) 29.5
叶(石油醚) 18.5 宁南霉素(对照) 67.9
根(正丁醇) 39.4
析检测，以三萜皂苷类化合物专属显色剂醋酐-浓硫酸
(Liberman-Burchard反应)鉴别出含有该类成分的组分共
12个。 以TMV为供试病毒，采用半叶枯斑法测定了垂序商
陆三萜皂苷类成分对TMV的活体钝化作用(见表2)，并选取
了具有良好活性的成分，测定其半数抑制率(IC50值)，见图3。
表2 垂序商陆三萜皂苷成分对TMV的
活体钝化作用 　(200 mg/L)
供试成分 抑制率/% 供试成分 抑制率/%
三萜皂苷组分1 17.9 三萜皂苷组分7 83.6
三萜皂苷组分2 72.7 三萜皂苷组分8 11.7
三萜皂苷组分3 25.9 三萜皂苷组分9 33.4
三萜皂苷组分4 67.9 三萜皂苷组分10 20.6
三萜皂苷组分5 40.3 三萜皂苷组分11 16.2
三萜皂苷组分6 77.6 三萜皂苷组分12 22.6
宁南霉素(对照) 66.3
图1 垂序商陆粗提物对TMV的活体钝化作用的IC50值
由表1可知：在供试样品质量浓度为200 mg/L时，垂序
商陆粗提物中果实和枝叶的正丁醇萃取部分，枝叶的乙酸
乙酯萃取部分对TMV表现出了一定的钝化作用，其中枝叶
的乙酸乙酯萃取部分的活体钝化活性略强于对照药物宁南
霉素。 由将具有抗TMV活性的部分的供试样品分别配制质
量浓度为200、100、50、25、10 mg/L的药液，利用活体半叶枯
斑法，进行IC50的测试(见图1)，将数据绘制图表后通过趋势
线得到回归方程，计算出活性成分的IC50值。 其中，种子(正
丁醇部分)的IC50值为49.9 mg/L，叶(正丁醇部分)的IC50值为
52.3 mg/L，叶(乙酸乙酯部分)的IC50值为46.3 mg/L。
2.2 垂序商陆粗提物对TMV的增殖抑制作用
采用离体叶圆片法测定，双抗夹心ELISA(DAS-
ELESA)法检测了垂序商陆粗提物对TMV增殖的抑制作
用(见图2)。 粗提物具有一定的TMV增殖抑制作用，实验
结果与活体钝化作用一致。
注：试样质量浓度为20 mg/L；OD405值为4次重复试验后的平均值，利用
OD405值通过病毒浓度与OD405值的相关方程计算出对应的病毒浓度，再与阳性
对照的病毒浓度进行比较，得出试样对TMV增殖的抑制率。
图2 垂序商陆粗提物双抗夹心ELISA测试结果
2.3 垂序商陆三萜皂苷成分对TMV的活体钝化作用
将粗提物利用植物化学分离手段进行分离，薄层层
图3 垂序商陆三萜皂苷类成分对TMV的
活体钝化作用的IC50值
由表2可以看出：垂序商陆粗提物中三萜皂苷组分对
TMV表现出了一定的钝化作用，其中1个单体化合物及3个
组分活性强于对照药物宁南霉素。 图3中，利用回归方程
计算出活性成分的IC50值，其中三萜皂苷组分2的IC50值
为36.5 mg/L，三萜皂苷组分4的IC50值为53.2 mg/L，三萜
皂苷组分6的IC50值为38.2 mg/L，三萜皂苷组分7的IC50值
为20.9 mg/L。
2.4 垂序商陆三萜皂苷类成分对TMV的增殖抑制作用
采用离体叶圆片法测定，双抗夹心ELISA(DAS-
ELESA)法检测了垂序商陆粗提三萜皂苷类成分对TMV
增殖的抑制作用，结果见图4。 试验结果表明：在质量浓度
为20 mg/L时，三萜皂苷类成分具有一定的TMV增殖抑制
作用，试验结果与活体钝化作用基本一致。
图4 垂序商陆三萜皂苷成分双抗夹心ELISA测试结果
抑
菌
率
/%
抑
菌
率
/%
第9期 683
3 讨论
从植物中寻找抗植物病毒活性物质已成为开发植物
病毒抑制剂的重要途径之一。 本文在抗病毒药用植物筛
选过程中，采用半叶枯斑法测试了贵州垂序商陆中化学
成分的活体钝化作用，采用离体叶圆片法测定，双抗夹心
ELISA(DAS-ELESA)法检测了垂序商陆三萜皂苷类不同
组分对TMV增殖的抑制作用，通过逐级抗病毒活性跟踪，
首次发现了垂序商陆提取物中三萜皂苷类物质对TMV具
有较好的钝化作用和抑制病毒侵染作用，其中通过分离纯
化获得的三萜皂苷组分2对TMV的活体钝化作用为72.7%，
组分4、6、7对TMV的活体钝化作用为67.9%~83.6%，均强
于对照宁南霉素，显示了垂序商陆中的小分子化合物良好
的抗TMV活性。
抗植物病毒物质的活性作用机理主要体现在抑制病
毒侵染、复制和增殖及治疗方面，某些物质还可诱导寄主
产生抗病性[15]。 本次研究采用活性追踪手段，通过粗提物
进行分析，锁定垂序商陆的活性部位，再通过天然产物的
分离方法，逐级系统分离，首次发现了垂序商陆提取物中
三萜皂苷类物质对TMV具有较好的钝化作用和抑制病毒
侵染作用。 在此基础上，不同组分的成分解析、药剂对寄
主植物生理生化性状的影响及药剂诱导枯斑寄主产生抗
TMV侵染活性的机理尚需进一步研究。 本研究为垂序商
陆中抗TMV化学成分的进一步研究及其在植物源抗病毒
抑制剂的开发利用提供了理论基础和科学依据。
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责任编辑：赵平
3 讨论
通过开展温室盆栽试验，对影响小麦锈病试验准确
性的关键因素，如接种方法、接种浓度以及温度、湿度、光
照等环境因子进行了系统地筛选和比较，确定了适宜
开展小麦锈病活体筛选试验的接菌方法和环境条件：
1×108~5×108孢子/L是最佳接菌浓度；喷雾法是最佳接菌
方法，(20±1) ℃是最适培养温度；黑暗高湿培养是顺利侵
入的必要条件，这与春季多雨多雾、田间湿度大、夜间易结
露有利于小麦锈病发病流行的情况一致；侵入寄主后，湿
度对锈病的潜育期影响不大；小麦锈病侵入期，黑暗条件
有利于小麦的侵入；小麦锈病侵入后，光照充足有利于缩
短小麦锈病的潜育期，黑暗条件不利于病害的发展。 三唑
酮、戊唑醇、烯唑醇的3次重复试验说明，规范后的小麦锈
病室内活体筛选方法准确可行，重现性好，可用于新化合
物的筛选。 以上药剂作为对照药剂，可更好的衡量新化合
物的活性情况；还可以通过对照药剂的活性情况判断试验
的准确性。
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责任编辑：赵平
(上接第679页)
葛永辉，等：垂序商陆抗烟草花叶病毒活性物质提取及分离