全 文 ：南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶的空间结构与活性位点分析
晏嫦妤 1，2 任秋婧 1 陈小芳 1 李 斌 1 陈忠正 1*
（1华南农业大学食品学院 广州 510642
2广东省农业科学院饮用植物研究所 广州 510640）
摘要 咖啡碱合成酶是茶叶中咖啡碱生物合成途径的关键酶， 目前尚无对茶叶咖啡碱合成酶分子结构和催化
机制的报道。 预测和分析其空间结构和活性位点具有重要意义。 本研究以高咖啡碱南昆山毛叶茶为材料构建
cDNA 文库，采用同源探针筛选 cDNA 文库的方法获得咖啡碱合成酶基因，通过体外原核表达对其功能进行验
证，并用 Modeller9.10、Autodock4.0 等软件预测其编码蛋白的空间结构和活性位点，结果是：克隆得到南昆山毛
叶茶咖啡碱合成酶基因 MYCS1，其 ORF 全长 1 100 bp，编码 369 个氨基酸，原核表达蛋白具有咖啡碱合成酶的
功能；MYCS1 编码蛋白的三维模型由 9 个 α-螺旋、7 个 β-折叠组成， 整个蛋白有一个包含 β-折叠链的球形结
构域和一个由独特螺旋帽组成顶盖的活性空腔。 该蛋白经多氢键与甲基供体 SAM 结合， 结合域由 Asp63、
Gly65、Asp103、Ser138、Phe139、Ser155 等氨基酸残基构成，与甲基受体（7-mX、Tb）的结合主要通过氢键作用，并
受氨基酸残基 π-π 堆积作用和强疏水作用的影响。 结合域主要包括 Phe30、Thr31、Tyr156、Trp160、Phe321 等氨
基酸残基。 结论：南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶具有依赖 S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶家族的结构特征，底物结合
位点在保守结构域，与该家族酶存在共性，特异底物识别位点存在差异，该结果为深入研究茶叶咖啡碱合成酶
的催化机制奠定了基础。
关键词 南昆山毛叶茶； 咖啡碱合成酶； 空间结构； 活性位点
文章编号 1009-7848（2016）09-0176-09 doi： 10.16429/j.1009-7848.2016.09.024
茶叶是世界三大无酒精饮料， 具有多种保健
和药理作用，含有一些特殊的功能活性成分，如茶
多酚、茶氨酸、咖啡碱等。 咖啡碱是茶叶中的主要
生物碱，具有提神醒脑，改善记忆和提高认知能力
等生理功能， 也是世界上消费最广泛的饮食成分
及精神类药物之一。 然而对于一些咖啡碱敏感人
群则容易引起失眠、心悸、血压升高等不良反应，
因此人们十分关注低咖啡碱茶叶产品的开发[1-3]。
茶叶咖啡碱的主要生物合成途径已明确，是
黄嘌呤核苷（xanthosine，XR）在 S-腺苷甲硫氨酸
（S-adenosylmethinonine，SAM）作为甲基供体的条
件下，经 3次 N-甲基转移酶（N-methyltransferase，
NMT） 催化的甲基化反应和一次核糖核苷水解酶
催化的脱核糖反应生成， 具体合成过程为：XR→
7-甲基黄嘌呤核苷 （7-methylxanthosine，7-mXR）
→7-甲基黄嘌呤（7-methylxanthine，7-mX）→可可
碱（3，7-dimethylxanthine，theobromine，Tb）→咖啡
碱 （1，3，7-trimethylxanthine，caffeine，Cf） [4]。 NMT
是咖啡碱合成过程中的关键酶， 对咖啡碱的生物
合成具有重要的调控作用。
根据底物特异性及生成产物的不同， 可将参
与咖啡碱合成的 NMT 分成 3 类：7-甲基黄嘌呤核
苷合成酶、 可可碱合成酶、 咖啡碱合成酶。 1999
年，日本学者 Kato等从茶叶中纯化出具有催化 7-
甲基黄嘌呤合成可可碱及可可碱合成咖啡碱双重
功能的 NMT， 将其命名为茶叶咖啡碱合成酶（Tea
Caffeine synthase，TCS）[5]，从茶叶中首次克隆出咖
啡 碱 合 成 酶 基 因 TCS1 （Genbank 序 列 号 ：
AB031280）[6]。 随后根据 TCS1 的基因序列， 在茶
树、 咖啡、 可可等植物中获得系列咖啡碱合成
NMT基因序列[7-13]。 迄今为止，有关咖啡碱合成过
收稿日期： 2015-09-12
基金项目： 国家自然科学基金项目（30700558，31270726）；
现代农业产业技术体系专项资金（CARS-23）
作者简介： 晏嫦妤，女，1981 年出生，博士生，助理研究员
通讯作者： 陈忠正 E-mail：zhongzhengch@scau.edu.cn
Vol． 16 No． 9
Sep． 2 0 1 6Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
中 国 食 品 学 报第 16 卷 第 9 期
2 0 1 6 年 9 月
第 16 卷 第 9 期
程中 NMT 空间结构的研究报道仅有咖啡植物中
的黄嘌呤核苷甲基转移酶（xanthosinemethyltrans-
ferase，XMT）及 3，7-二甲基黄嘌呤甲基转移酶（3，
7 -dimethylxanthine methyltransferase，DXMT） [11]，
尚未见茶叶咖啡碱合成 NMT 空间结构的相关报
道。 Nahoyoneyama 等[14]研究认为茶叶咖啡碱合成
NMT对底物的识别可能与咖啡存在差异。 定点突
变研究也表明，茶叶咖啡碱合成 NMT 家族对底物
的识别及催化效率与活性中心氨基酸残基的关系
非常复杂[15-17]。随着计算机技术及生物信息学的快
速发展， 同源建模和分子对接技术被认为是获得
蛋白质空间结构和解析酶与底物相互关系的快速
而有效的方法 [18]。 本研究利用同源探针原位杂交
筛选 cDNA 文库的方法获得南昆山毛叶茶咖啡碱
合成酶基因， 通过同源建模及分子对接方法对其
编码蛋白的空间结构及底物识别位点进行分析，
为深入分析茶叶咖啡碱合成酶的催化机制， 开发
体外特异酶抑制剂以获得低咖啡碱茶叶提供理论
参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料 南昆山毛叶茶 （采用 GB/T 8312-
2002 中 HPLC 法检测咖啡碱含量为 43.6 mg/g），
采自广东省龙门县南昆山。取一芽二叶新梢，液氮
速冻后置于-80℃冰箱保存备用。
1.1.2 试剂 SMARTTM cDNA 文库构建试剂盒，
Clotech 公司；Straight A’sTM mRNA 磁珠分离试剂
盒 ，Novagan 公司 ；Advantage 2 cDNA 扩增试剂
盒，Clotech 公司；Gigapack III 噬菌体包装系统，
Agilent Technologies 公司；North2SouthR生物素随
机引物标记试剂盒，Thermo 公司；North2SouthR化
学发光杂交和检测试剂盒，Thermo 公司；LA TaqR
DNA 聚合酶、BamH I、Hind III， 宝生物工程 （大
连）有限公司；质粒提取试剂盒、DNA 纯化回收试
剂盒，北京天根生化有限公司；催化反应底物（S-
腺苷甲硫氨酸、7-甲基黄嘌呤、可可碱、咖啡碱），
Sigma 公司；表达载体 pET32a（+）、大肠杆菌菌株
BL21（DE3），本实验室保存；PCR 引物由生工生
物工程（上海）股份有限公司合成；DNA 测序由上
海 Invitrogen 公司完成。
1.2 方法
1.2.1 cDNA 文库的构建 南昆山毛叶茶 RNA
提取采用改进的 CTAB-LiCl 法 [19]， 通过 Straight
A’sTM mRNA 磁珠分离试剂盒进行 mRNA 分离，
按照 SMARTTM cDNA 文库构建试剂盒和 Giga-
pack III噬菌体包装系统操作说明构建文库。
1.2.2 探针制备及咖啡碱合成酶基因的克隆 根
据本实验室前期获得的咖啡碱合成酶基因片段的
序 列 信 息 设 计 引 物 ， 上 游 引 物 TZ -F：5’ -
GACTTGGGTTGTGCAGCGGGTCCAAA-3’； 下游
引 物 TZ -R：5’ -TCTTCATGAAATTGAGATAAG-
TAGGC-3’。PCR反应条件：94℃预变性 3 min，94
℃变性 30 s，58℃复性 1 min，72 ℃延伸 1 min，共
进行 30个循环，最后 72℃延伸 10 min。 PCR产物
经纯化回收后按照 Thermo North2South R生物素
随机引物标记试剂盒的操作说明标记探针。 利用
标记的探针对南昆山毛叶茶 cDNA 文库进行原位
杂交筛选，获得与探针高度同源的阳性克隆，进行
序列测定。
1.2.3 咖啡碱合成酶基因的原核表达 根据获得
的咖啡碱合成酶基因的序列信息设计引物， 上游
引 物 F：5’ -ATATATGGATCCATGG CGCTAGC-
TACTACGGG -3’ （BamH I）， 下游引物 R：5’ -
GGTGGTAAGCTTTCCATCAATCTTGGAAAGCA -
3’（Hind III）。 为使 PCR 产物定向插入表达载体
pET32a（+）中，在引物 F 的 5’端引入 BamH I 的
酶切位点，在引物 R 的 5’端引入 Hind III 酶切位
点。 原核表达载体构建及目的蛋白诱导表达参照
余有本等[20]的方法。
1.2.4 融合蛋白的体外酶活性分析 融合蛋白的
体外酶催化反应体系：500 μL 酶液，100 μL SAM
（40 μmol/L）， 分别加入 100 μL 2 mmol/L 反应底
物（7-mX、Tb ），充分混匀，同时以不加底物做空
白对照。 反应液在 30℃反应 120 min，收集产物进
行 HPLC分析，检测方法参照许煜华[17]的方法。
1.2.5 同源建模 以本研究中获得的咖啡碱合成
酶基因编码的氨基酸序列， 在美国国立生物技术
信息中心 （NCBI） 的数据库（http：//www.rcsb.org/
pdb）中用 protein blast方法搜寻同源性较高，已知
晶体结构的蛋白为同源建模模板。使用 Modeller9.
10 进行同源建模，通过 Gromacs4.6 动力学软件进
南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶的空间结构与活性位点分析 177
中 国 食 品 学 报 2016 年第 9 期
图 1 MYCS1 和 TCS1 的氨基酸序列比对
Fig.1 Alignment of amino-acid sequences for MYCS1 with TCS1
注：下划线为 4 个咖啡碱合成 NMT 基因家族保守结构域。
注：M. DNA marker DL2000； 1. MYCS1 ORF 区段。
图 2 咖啡碱合成酶基因编码区 PCR 扩增
产物电泳图
Fig.2 The electrophoretogram of ORF of caffeine
synthase gene
行结构优化，采用在线软件 PROCHECK 对模型的
生理化学等参数进行评估分析。 利用 Profile-3D
对模建结构中氨基酸序列的相容性进行初步评
价。
1.2.6 分子对接 使用 Chemdraw 化学绘图软件
绘制出底物分子 S-腺苷甲硫氨酸、7-甲基黄嘌
呤、可可碱的化学结构式，转换三维结构并进行结
构优化。运用 Autodock4.0软件将咖啡碱合成酶与
底物分子进行分子对接。
2 结果与分析
2.1 咖啡碱合成酶基因的克隆筛选及序列分析
以标记的咖啡碱合成酶基因探针对南昆山毛
叶茶 cDNA 文库进行菌落原位杂交筛选， 获得 1
个包含完整开放阅读框的咖啡碱合成酶新基因，
将其命名为 MYCS1。该基因序列全长 1 501 bp，完
整开放阅读框位于 128～1 237 bp， 编码 369 个氨
基酸，经分析其编码区氨基酸序列与 TCS1相似性
为 96.2%，含有咖啡碱合成 NMT 基因的 4 个保守
结 构 域 ：SAM 结 合 域 A （AA/VDLGCAAGP）、B
（VYLNDLF/PGNDFN）、C（PGSUHGRLFP）和 YFFF
域（AYLSQFHEDFTMFL）（图 1）。
2.2 咖啡碱合成酶基因原核表达及功能鉴定
根据 MYCS1 序列信息设计特异引物， 对其
开放阅读框进行 PCR 扩增， 将扩增产物经 0.8%
的琼脂糖凝胶电泳分析， 可见 1 条与预期大小
1 100 bp一致的特异片段（图 2）。 回收的 PCR 产
物经 BamH I 和 Hind III 双酶切后， 插入经同样
双酶切的表达载体 pET32a（+）中，得到重组表达
质粒。 经测序鉴定插入片段的 DNA 与原序列一
致。
重组表达质粒经 IPTG 诱导表达， 收集酶液
进行体外酶促反应。反应产物经 HPLC分析，结果
表明 MYCS1-pET32a（+）的融合蛋白具有催化 7-
mX 合成可可碱以及催化可可碱合成咖啡碱的功
能（图 3），说明 MYCS1 具有与 TCS 类似的功能，
为咖啡碱合成酶基因。
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350
300
250
200
150
100
50
0
m
AU
0 1 2 3 4 5 6 7 8
（a）
300
250
200
150
100
50
0
m
AU
0 1 2 3 4 5 6 7 8
（c）
200
150
100
50
0
m
AU
0 1 2 3 4 5 6 7 8
（b）
250
200
150
100
50
0
m
AU
0 1 2 3 4 5 6 7 8
（d）
注： （a）标准品； （b）空白（不加底物）； （c）MYCS1-pET32a（+）融合蛋白与 7-mX 催化反应产物； （d）MYCS1-pET32a（+）融
合蛋白与 Tb 催化反应产物。
图 3 MYCS1-pET32a（+）融合蛋白体外酶促反应 HPLC 分析
Fig.3 In vitro functional analysis of MYCS1 fusion protein by HPLC
球形
结构域
图 4 咖啡碱合成酶 MYCS1 的同源建模模型
Fig.4 Homology modeling of caffeine synthase MYCS1
2.3 咖啡碱合成酶同源建模
根据 MYCS1 编码区氨基酸序列搜索 NCBI
和 PDB 数据库，blast 结果显示，MYCS1 蛋白与水
杨 酸 羧 甲 基 转 移 酶 （Salicylic Acid Carboxyl
Methyltransferase，SAMT，PBD code：1M6E） [21]具有
较高的一致性。 以 1M6E 为模板，利用 Modeller9.
10 软件同源建模，并使用 Gromacs4.6 动力学软件
对初始模型进行优化，获得 MYCS1 编码蛋白的三
维模型（图 4）。 利用 PROCHECK 分析优化后的模
型立体化学结构的合理性，生成拉氏图（图 5a）显
示， 本研究中构建的三维模型中 90.7%的氨基酸
位于核心区域，8.1%的氨基酸残基位于允许区域，
0.6%的氨基酸残基位于最大允许区域，只有 0.6%
的氨基酸残基位于扭转角的禁止区域， 因此模型
中 99.4%的蛋白质残基的二面角都在合理的范围
内，符合立体化学能量规则。 用 Profile 3D对三维
模型中氨基酸与其自身氨基酸的匹配度进行评
价，从图 5b 可看出模型 96.5%的氨基酸残基得分
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180
135
90
45
0
-45
-90
-135
-180 -135 -90 -45 0 45 90 135 180
Phi（degrees）
Ps
i（
de
gr
ee
s）
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
0 125 250 375 500 625 750
Row Index
Ve
rif
y
sc
or
e
咖啡碱合成酶
注：（a） 图中 A、B、L 区域代表核心区域；a、b、l、p 区域代表允许区域；~a、~b、~l、~p 区域代表最大允许区域；
白色区域代表禁止区域。
（a） （b）
图 5 咖啡碱合成酶 MYCS1 模型的 Ramachandran plot 图（a）和 Profile 3D 评分（b）
Fig.5 Scores of the Ramachandran plot （a） and Profile 3D （b） of caffeine synthase MYCS1
大于 0.2，说明该模型的侧链环境合理。 建模得到
的南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶的三维结构合理，
可用于后续对接研究。
三维结构模型显示，该酶由 9个 α-螺旋，7 个
β-折叠组成，整个蛋白有一个包含 β-折叠链的球
形结构域和一个由独特螺旋帽组成顶盖的活性空
腔，具有甲基转移酶家族的结构特征[21]。
2.4 咖啡碱合成酶结合位点分析
根据甲基转移酶的普遍结合口袋所在位置，
预测南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶的可能结合口
袋，并对其周围的氨基酸进行分析（图 6），结果显
示 ， 该酶结合口袋周围的氨基酸残基主要有
Tyr24、Ser29、Thr31、Asp63、Gly65、Asp103、Phe139、
Ser155、Tyr156、His159、Trp160、Phe239、Thr240、
Trp241、Phe314、Val317、Phe321、Thr357，其中包括
可以和底物小分子形成 π-π相互作用的 Phe139、
Tyr156， 可以产生氢键相互作用的 Thr31、Asp63、
Asp103、Ser138 及 Trp160 等氨基酸， 这些氨基酸
残基可能对咖啡碱合成酶与底物的结合具有重要
作用。
2.5 咖啡碱合成酶与底物的分子对接分析
将咖啡碱合成酶 MYCS1 先与甲基供体 SAM
进行分子对接，结果如图 7 所示。 SAM 与咖啡碱
合成酶经多个氢键作用结合在酶的活性口袋中，
SAM 结 合 域 主 要 由 Asp63、Gly65、Asp103、
Ser138、Phe139、Ser155 等氨基酸残基构成， 全部
分布在 NMT 基因家族的 SAM 保守结合域范围
内，说明模建结构合理。
咖啡碱合成酶 MYCS1 与 SAM 结合后形成的
复合物分别与 7-mX 和 Tb 进行分子对接，对接结
果如图 8所示。 复合物与 7-甲基黄嘌呤的结合特
征是：咪唑环与 Tyr156 形成 π-π 堆积作用，羰基
的氧原子与 Trp160 形成氢键，咪唑环上的氮原子
与 Thr31 形成氢键，以及与 Phe30、Phe321、Tyr156
等发生强疏水相互作用，促使 7-甲基黄嘌呤在该
酶活性位点中稳定结合， 从而催化 7-mX 合成可
可碱。复合物与可可碱结合特征为：可可碱六元环
上的两个羰基氧原子分别与复合物的 Thr31 和
Trp160 形成氢键，而且可可碱的咪唑环与 Tyr156
发生 π-π 堆积作用， 导致其与该酶稳定结合，顺
利被催化转化，生成咖啡碱。 从对接结果看，咖啡
碱合成酶 MYCS1 与甲基受体间的结合作用力主
要为氢键，并受芳香族氨基酸之间的 π-π 堆积作
用和氨基酸残基之间强疏水相互作用的影响。
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第 16 卷 第 9 期
注：黄色为 7-甲基黄嘌呤，绿色为氨基酸残基，黄色虚线为形成的氢键。
（a） （b）
图 8 咖啡碱合成酶 MYCS1 与 SAM 复合物分别与 7-甲基黄嘌呤（a）和可可碱（b）对接图
Fig.8 The figure of compounds of caffeine synthase MYCS1 and SAM docking with 7-methyl xanthine （a）
and theobromine （b）
图 6 咖啡碱合成酶 MYCS1 活性口袋周围重要
的氨基酸残基
Fig.6 Important amino acid residues around active pockets
of caffeine synthase MYCS1
注：红色骨架为 SAM，绿色为氨基酸残基，黄色虚线为形成的氢键
图 7 咖啡碱合成酶 MYCS1 与 SAM 对接图
Fig.7 The figure of caffeine snythase MYCS1
docking with SAM
3 讨论
NMT 是催化咖啡碱合成过程中三步转甲基
化反应的关键酶， 目前从植物中克隆并通过功能
验证的咖啡碱合成 NMT 已达 11 个[6-10，14]。 前期研
究表明这些酶对底物的识别与酶细微的结构差异
及活性位点的氨基酸残基有关[14-17]，因此从结构与
功能的关系角度有利于阐释基因的差异。 同源建
模和分子对接技术， 作为一种快速有效获得蛋白
质结构及分析蛋白质结构与功能关系的方法，近
年发展迅速并成功应用于酶的结构分析与催化机
制研究。Zhu等[22]通过同源建模构建了黄连植物中
斯氏紫堇碱合成过程中 9-O-甲基转移酶的结构
模型，并通过分子对接推导出其催化机制；李云双
等 [23]通过同源建模和分子对接模拟了决明查尔酮
合成酶的酶促反应过程， 并筛选到与底物结合的
关键氨基酸残基。 通过同源建模和分子对接的方
法， 分析南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶的结构与功
能，有利于深入研究茶叶咖啡碱合成中 NMT 酶的
催化调控机制。
茶叶咖啡碱合成酶属于依赖 SAM 的甲基转
移酶家族。 通过结晶和 X-射线衍射的方法，目前
该家族中已有仙女扇植物中的 SAMT 和咖啡植物
中的 XMT 及 DXMT 等甲基转移酶获得了空间结
构 [11，21]， 这为同类基因的同源建模研究奠定了基
南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶的空间结构与活性位点分析 181
中 国 食 品 学 报 2016 年第 9 期
础。通过同源序列比对发现，本研究中南昆山毛叶
茶咖啡碱合成酶 MYCS1 与 SAMT 的相似性为
40%，达到同源建模的要求（相似度高于 30%）[24]。
本研究以 SAMT 为模板进行同源建模， 并将预测
结果和 SAMT、XMT、DXMT的研究结果相结合，分
析发现该家族的酶均具有一个非常保守的结构特
征，即含有一个包含 β-折叠链的球形结构域和一
个由独特螺旋帽组成顶盖的活性空腔， 然而各酶
在环区或活性位点附近氨基酸残基等结构间也存
在一些细微差异 ， 如在 β5 和 α6 之间的环区 ，
SAMT 和本研究的 MYCS1 均比 DXMT 和 XMT 多
4 个氨基酸残基， 其中 SAMT 多出的氨基酸残基
为 Asp-Arg-Ala-Ser [11]， 而本研究的 MYCS1 为
Asp-Pro-Ser-Asp。 另外在 β6 和 α9 区间，DXMT、
XMT 与 SAMT、MYCS1 相比各插入一段不同的氨
基酸残基， 这些差异可能是引起各酶功能差异的
关键。
酶的催化作用必须通过其与底物的结合才能
实现， 酶的活性位点在酶与底物特异结合过程中
起关键作用。 SAM是咖啡碱合成酶催化 7-mX 合
成咖啡碱过程中的唯一甲基供体。 Chloe Z等[21]和
McCarthy 等 [11]研究发现 ，SAM 与 XMT、DXMT 和
SAMT等依赖 SAM的甲基转移酶的结合位置和结
合构象极为相似；Cheng 等 [25]认为依赖 SAM 的甲
基转移酶家族的酶在与 SAM 结合时具有构成保
守氢键的特征 。 SAMT 中 Asp57、Asn65、Asp98、
Ser129 等氨基酸残基通过与 SAM 间形成氢键，使
SAM在 SAMT中稳定结合，而 DXMT 中 Ser139 和
Phe140则与 SAM的腺嘌呤环形成两个氢键。对南
昆山毛叶茶咖啡碱合成酶建模发现， 其 Asp63、
Asp103、Ser138、Phe139、Ser155 能与 SAM 通过多
氢键结合，再次表明依赖 SAM 的甲基转移酶在与
SAM 这一甲基供体结合时具有共性特征，然而该
家族酶在与甲基受体结合时却只有少数保守区域
存在共性，一些底物识别关键位点存在较大差异。
SAMT的 Trp151被认为在其对底物水杨酸识别中
发挥重要的作用[21]。 XMT的 Ser316可能是其特异
识别底物黄嘌呤核苷的关键位点[11]。 DXMT 与 7-
甲基黄嘌呤这一甲基受体结合时 ， 其 His160、
Trp161 与 7-甲基黄嘌呤上的 2 位羰基氧原子以
及其 Ser237 与 6 位羰基氧原子形成氢键 ；而
DXMT 与可可碱这一甲基受体结合时，其 His160、
Trp161与可可碱的 2 位羰基氧原子形成氢键以及
其 Ser237与咪唑环上的 9号氮原子形成氢键[11，26]，
因此 DXMT的 His160、Trp161、Ser237对其选择和
结合底物具有重要作用。 本研究中克隆的 MYCS1
在催化 7-甲基黄嘌呤合成可可碱时， 其 Thr31、
Trp160 分别与 7-甲基黄嘌呤上的羰基氧原子和
咪唑环上的氮原子形成氢键， 与可可碱结合时，
MYCS1 的 Thr31 和 Trp160 则与可可碱六元环上
的两个羰基氧原子形成氢键。 Thr31、Trp160 可能
是 MYCS1识别底物并与其结合的关键位点。上述
分析说明依赖 SAM 的甲基转移酶家族的酶，虽然
在整体结构上具有共性， 但由于酶在细微结构方
面存在的差异而使它们具有不同底物识别与结合
能力，表现出不同的催化功能。咖啡碱合成酶作为
咖啡植物和茶叶中的咖啡碱合成关键调控酶，两
者均具有相同的功能， 而在空间结构及活性位点
上存在明显差异， 这可能导致不同物种中咖啡碱
合成酶具有不同催化机制，这是今后研究的重点。
4 结论
成功克隆了南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶基因
MYCS1， 利用同源建模的方法构建该基因编码蛋
白的空间结构模型， 并对其关键活性位点及其与
底物间的结合作用情况进行分析， 获得茶叶中
MYCS1 与咖啡碱合成酶家族酶蛋白共性的空间
结构， 与甲基供体 SAM 结合的相似结构特征，而
与甲基受体即底物在识别关键位点方面存在明显
结构差异。 这些研究成果为深入研究茶叶咖啡碱
合成酶的催化机制奠定了基础。
参 考 文 献
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南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶的空间结构与活性位点分析 183
中 国 食 品 学 报 2016 年第 9 期
mation and Modeling， 2014， 54： 593-600.
Analysis of the Spacial Structure and Active Sites of Caffeine Synthase from
Camellia ptilophylla Chang
Yan Changyu1，2 Ren Qiujing1 Chen Xiaofang1 Li Bin1 Chen Zhongzheng1*
（1College of Food Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642
2Drinkable Plants Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640）
Abstract Caffeine synthase is the key enzyme which catalyze the caffeine synthesis in tea， but little is known on
its spacial molecular structure which relation to its` catalytic mechanism. In this study， the cDNA library of Camellia
ptilophylla Chang which owned high caffeine content was successfully constructed， and caffeine synthase genes were
screened from the library and identified， then the spacial structure and the active site of the cloned caffeine synthase
were analyzed by software Modeller 9.10 and Autodock 4.0. The main results showed a new caffeine synthase gene with
1 100 bp owned complete ORF and encoding 369 deduced amino acids was isolated and named as MYCS1， and the fu-
sion protein which expressed from pET32a-MYCS1 in BL21 （DE3） shared the same catalytic activity as caffeine synthase.
The spacial structure of MYCS1 indicated it owned nine α-helices and seven β-sheets， and including a globular domain
with extended β-sheet and an active site cavity consist with a unique α-helical cap above the cavity. SAM as the methyl
donor binding with MYCS1 was mediated through several hydrogen bond and the binding domain was composed of
Asp63， Gly65， Asp103， Ser138， Phe139， Ser155. The methyl receptor including 7-mX and Tb binding with MYCS1
mainly the same as SAM by hydrogen bond formatted between them but affected by π-π accumulation effect and strong
hydrophobic effect which come from amino acid， and the binding domain mainly composed with Phe30， Thr31， Tyr156，
Trp160 and Phe321. These results indicated that the spacial structure of caffeine synthase from Camellia ptilophylla
Chang was similar to other SAM-dependent methyltransferases， and shared the similar conservative domain binding for
substrate， but existed obviously difference in key domain for substrate recognition. The findings would be helpful for bet-
ter understanding the caffeine synthase catalytic mechanism in tea plants.
Keywords Camellia ptilophylla Chang； caffeine synthase； spacial structure； active sites
澳大利亚科学家研发杀死超级病菌的新分子
澳大利亚墨尔本科学家近日首次在抗击耐抗生素超级细菌方面有了新突破， 他们研发出一种可以杀死超级细菌的分
子，而主导这次研究的是 24 岁的马来西亚裔博士生蓝舒洁（Shu Lam）。
墨尔本大学工程学院的科学家近日在 Nature Microbiology 杂志上发表了他们的新突破， 这一杀死超级病菌的最新研
究能够用于治疗癌症。
根据世界卫生组织（WHO），超级细菌是人类最大的威胁之一，它对现有所有的抗生素都有抵抗性。 科学家表示，“据分
析，到 2050 年，超级细菌每年会造成数千万人的死亡，而更严峻的是，在过去 30 年里仅有很少量的新抗生素被发明出来。 ”
来自马来西亚的蓝舒洁表示，她们的团队研发肽聚合物（peptide polymers），它们是一系列星状蛋白质分子。 肽聚合物
能够撕破超级细菌的细胞壁从而杀死它们。 而超级细菌对这种肽聚合物没有抵抗力。
据了解，这一研究尚在初期阶段。 蓝舒洁表示，她们的团队现在只针对一种超级细菌。 在未来需要有更多的研究，检查
其他类型的细菌对肽聚合物的抵抗性。 “我们的研究仍处于初级阶段，我们下一步的工作是仔细检查这些肽聚合物如何杀
死超级细菌的。 ” （消息来源：中国新闻网）
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