全 文 ：337※生物工程 食品科学 2008, Vol. 29, No. 05
南昆山毛叶茶cDNA文库构建
文海涛1，陈忠正1,*，赵 亮1，郭 健1，李 斌1，蒋跃明2
(1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；
2.浙江工商大学食品、生物与环境工程学院，浙江 杭州 310035)
摘 要：本研究以天然低咖啡碱茶树品种—南昆山毛叶茶春季嫩稍为材料，采用Stratagene公司ZAP系列试剂盒成
功构建了该品种全长cDNA文库。原始文库滴度为6.0×105pfu/ml，重组率为97.3%，1.0～2.0kb的插入片段占整
个文库的70%左右，达到一个高质量cDNA文库的要求，文库经扩增后滴度为1.9×109pfu/ml，重组率达到99.1%。
关键词：南昆山毛叶茶；c D N A文库；文库滴度
Construction of cDNA Library of Camellia ptilophylla Chang
WEN Hai-tao1，CHEN Zhong-zheng1,*，ZHAO Liang1，GUO Jian1，LI Bin1，JIANG Yue-ming2
(1.College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China；
2.College of Food Science, Biotechnology and Environmental Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)
Abstact ：In this study, cDNA library was constructed successfully from the specie of Camellia ptilophylla Chang with a low
content of caffeine through using a series of ZAP kits that bought from the company of Stratagene. The titer and recombinant rate
of this library were 6.0×105pfu/ml and 97.3 % respectively, the insert size with 1.0～2.0kb occupied 70% of the whole library,
matching the requirement of high quality library. The titer and recombinant rate of amplification library were 1.9×109pfu/ml
and 99.1 %, respectively.
Key words：Camellia ptilophylla Chang；cDNA ibrary；library titer
中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)05-0337-04
收稿日期：2007-11-30
基金项目：国家自然科学基金项目(30700558)；广东省自然科学基金项目(04020579)；广东省攻关项目(2006B20101009)；
浙江省“食品科学与工程”重中之重学科课题(ZSZKF200709)
作者简介：文海涛(1979-)，男，博士研究生，主要从事食品生物技术研究。E-mail：2005113004@stu.scau.edu.cn
*通讯作者：陈忠正(1974-)男，博士，讲师，主要从事食品生物技术研究。E-mail：zhongzhengch@scau.edu.cn
南昆山毛叶茶(Camellia ptilophylla Chang)，又名
可可茶，是上世纪80年代初中山大学张宏达教授在广东
境内发现的一个低咖啡碱高可可碱的茶树品种[1]，其生
物碱由3%～6%的可可碱替代了普通茶叶中2%～5%的
咖啡碱，而茶叶其他理化成分与普通茶叶无明显差异。
cDNA文库的构建是功能基因组学研究的基本手段
之一。日本学者Matsumoto[2]等1994年构建了茶叶的第
一个cDNA文库，并利用此文库通过同源探针筛选相继
获得了茶叶中的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-
lyase, PAL)和查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)基因
[3]；我国赵丽萍[4]首次成功构建了龙井43和安吉白茶两
个茶树品种cDNA文库，在大量测定EST(expressed se-
quence tag, EST)序列的基础上，从中获得了查尔酮异
构酶(chalcone isomerase, CHI)和黄酮醇合成酶(flavonol
synthase，FLS)等基因。但是由于茶叶自身特性的限
制，在分子生物学尤其是功能基因组学方面的研究远落
后于其他经济作物。到目前为止，茶叶中在GenBank
上登录或公开发表的研究论文报道的功能基因仅50多个
[5-6]。本研究拟以南昆山毛叶茶这一特殊生物碱模式的茶
叶资源为材料，通过构建其全长cDNA文库，为筛选和
克隆茶叶中生物碱代谢过程中系列N－甲基转移酶等基因
提供一个研究平台，同时也为茶叶其他功能基因的研究开
辟一条快速而有效的途径。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1茶叶材料
南昆山毛叶茶春季1芽2叶嫩稍，采于广东南昆山，
液N2冷冻后－80℃保存备用。
1.1.2试剂盒
2008, Vol. 29, No. 05 食品科学 ※生物工程338
ZAP Express cDNA Synthesis Kit、Z P Expr s
cDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning Kit Stratagene 公司；
Straight AsTM mRNA Isolation System、Magnetight TM
Separation Stand Novagen公司。
1.1.3文库扩增引物
3F：5......TTAATTGGGAGTGATTTCCC ......3、
7F：5......CATTATGCTGAGATATCCCG ......3上海英俊
生物技术有限公司。
1.2方法
1.2.1茶叶RNA提取、mRNA分离
茶叶总RNA采用CTAB提取、LiCl沉淀法[7]。RNA
质量检测通过紫外分光光度计分别测定其A260、A280和
A230值以及经1.0%甲醛变性凝胶电泳后观测其条带。茶
叶mRNA的分离严格按照Straight AsTM mRNA Isolation
System说明进行。
1.2.2cDNA文库构建
cDNA文库的构建与扩增采用ZAP Express cDNA
Synthesis Kit和ZAP Express cDNA Gigapack Ⅲ Gold
Cloning Kit提供的方法进行，实验具体流程为：cDNA
第一链的合成→cDNA第二链的合成→补平cDNA链末
端→EcoRⅠ接头的连接→EcoRⅠ末端的的磷酸化→
Xho I酶切→过柱分离cDNA→cDNA与ZAP表达载体
的连接→准备宿主菌→应用Gigapack Ⅲ Gold 包装蛋白
包装含有cDNA的ZAP重组载体→铺盘和库容量鉴定→
原始库的扩增。详细步骤见试剂盒说明书。
1.2.2.1cDNA合成
取一无RNase污染的离心管，依次加入：10×first-
strand buffer5μl、first-strand methyl nucleotide mixture
3μl、linker-primer2μl (1.4μg/μl)、DEPC-treated
water12.5μl、RNase Block Ribonuclease Inhibitor 1μl
(40U/μl)。总体积23.5μl。
上述试剂混匀后加入25μl mRNA，室温放置10min，
让引物与模板充分结合。最后加入1.5μl StrataScript RT
(50U/μl)，置42℃水浴1h。反应完成后取5μl另存备
用，然后依次加入：10×second-strand buffer 20μl、
second-strand dNTP mixture 8μl、sterile distilled water
114μl、RNase H2μl、DNA polymeraseⅠ11μl。总
体积20μl。轻轻混匀后于16℃水浴2.5h。
1.2.2.2cDNA分离与回收
经过末端补平和加接头以及XhoⅠ酶切消化后的
cDNA需要进行分级分离。按照说明书装好CL-2B葡聚
糖凝胶柱，先用约5ml的1×STE buffer洗柱子，当溶
液剩下大约50μl的时候，小心的加入混有column loading
dye 的cDNA样品，然后沿着柱子壁轻轻地加入约3ml
的1×STE buffer。当指示剂移到柱子上－0.4ml刻度时，
R○ R○
R○
R○
R○ R○
开始收集cDNA，每管收集3滴，约10μl，当指示
剂将流出柱子时停止收集。收集PAGE电泳检测后的大
片段cDNA，加入等体积的酚：氯仿-异戊醇，4℃，
16000×g，离心2min，上清转入一新离心管。加等
体积的氯仿，4℃，16000g，2min，上清转入另一离
心管。加2倍体积的无水乙醇，－20℃沉淀。4℃、16000
×g离心力下离心60min，80%的乙醇洗涤一次，溶于
4μl的灭菌水中，备用。
1.2.2.3cDNA与载体连接
冰上预冷一灭菌离心管，依次加入：cDNA 2.5μl
(约100ng)、10×ligase buffer 0.5μl、10mmol/L rATP
(pH7.5) 0.μl、ZAP Express vector 1.0μl(1μg/μl)、T4
DNA ligase 0.5μl(4U/μl)。总体积 5μl 。4℃连接2d。
1.2.2.4连接产物包装
从－80℃冰箱快速取出一管包装蛋白(25μl)，立刻
置于冰上，观察包装蛋白在其刚刚开始溶解的时候迅速
加入2.5μl的连接产物，用枪头轻轻混匀，22℃水浴2h。
加50μl SM buffer、20μl氯仿，混匀后稍离心，此
即为原始文库，4℃保存。
1.2.2.5文库滴度及重组率测定
(1)取XL-Blue MRF菌划板(LB，Tetr)，挑取单菌落
入50ml LB液体补充培养基(0.5ml 1mol/L MgSO4、0.5ml
20%麦芽糖)，37℃振荡培养至A600约0.6，1000×g离
心10min收集菌体。
(2)菌体重悬于15ml 10mmol/L MgSO4中，摇匀后，
取适量菌液用10mmol/L MgSO4稀释至A600=0.5。取稀释
至A600=0.5的菌液20μl于灭菌离心管中，共4管，分
别加入1μl和稀释10倍的原始文库，各2管，37℃保
温15min。
(3)溶解NZY顶层培养基冷却并保温于48℃，在10ml
摇菌管中加入3ml NZY顶层培养基，15μl 0.5mol/L IPTG，
50μl X-gal(250mg/μl)，加入37℃保温15min的菌液，混
匀后迅速倒入NZY培养基的平板上，风干后37℃培养
过夜。
(4)统计噬菌斑的个数，并根据公式：噬菌斑的
个数×稀释倍数×总体积=文库滴度，计算原始文库
滴 度 。
重组率测定：由于文库利用X-gal显色原理，在测
定滴度时加入IPTG和 X-gal过夜培养后，通过蓝白斑的
数量计算文库重组率。
文库扩增参照说明进行，扩增文库加入终浓度7%
的DMSO后－80℃保存，滴度和重组率测定同上。
1.2.2.6文库质量鉴定
随机挑取28个白色噬菌斑，用设计的特异引物进
行PCR扩增鉴定插入片段大小。PCR扩增体系如下：
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含噬菌体的SM buffer 1μl，10× PCR buffer 3μl，
Mg2+ 2.4μl，引物3F/7F(10μmol/L) 各1.0μl，dNTPs
0.6μl，Taq 酶0.3μl，ddH 2O20.7μl。总体积30μl。
PCR扩增循环参数：94℃，5min；94℃，50s，56℃，
1min，72℃，2min；35个循环；72℃，10min。
2 结果与分析
2.1南昆山毛叶茶春梢总RNA提取
采用CTAB提取、LiCl沉淀法提取的南昆山毛叶茶
RNA，经1.0%甲醛变性凝胶电泳后，结果如图1所示。
从图中可以看出，提取的总RNA，其28S和18S条带
清晰、28S的亮度约为18S的两倍。用紫外分光光度计
分别测定RNA的A260、A280和A230值，结果各样品A260/
A280值在1.8～2.0之间，A260/A230值在2.0～2.2之间(见
表1)，说明所提取的总RNA质量好、纯度高，可以
用于后续实验。
样品编号 A260 A280 A230A260/A280A260/A230RNA浓度(ng/μl)
1 28.19614.1631 .3001.99 2.12 1127.86
2 21.50910.9120.2421.97 2.10 860.34
3 17.6309.1168.7281.93 2.02 705.22
4 20.03410.2359.5861.96 2.09 801.35
表 1 南昆山毛叶茶总 RNA 纯度及浓度
Table 1 Purity and concentration of RNA in Camellia ptilophylla
Ch an g
图1 南昆山毛叶茶总RNA甲醛变性凝胶电泳
Fig.1 Eletrophoresis on formaldehyde denaturation gel of RNA in
Camellia ptilophylla Chang
←28S
←18S
图2 南昆山毛叶茶mRNA及cDNA第一，第二链合成
Fig.2 cDNA synthesis of 1st and 2ed and mRNA in Camellia
ptilophylla Chang
第二链 第一链 m R N A M
2000bp
1000bp
750bp
500bp
2.3.1文库滴度和重组率
取南昆山毛叶茶cDNA原始文库1μl，稀释成不同
浓度后涂板，平板上同时涂有IPTG和X-gal，过夜培
养后根据平板上噬菌斑个数以及蓝白斑的比例，计算得
文库滴度为6.0×105pfu/ml；重组率为97.3%。已有的
报道显示[8]，植物高质量cDNA文库的滴度应达到3.3×
105以上，本研究所得南昆山毛叶茶cDNA文库达到此要
求。图3为原始文库稀释10倍后涂板所得结果。
图3 南昆山毛叶茶原始文库蓝白斑筛选
Fig.3 Blue-white spot screening of original library in Camellia
ptilophylla Chang
为利于文库的长期保存，将文库扩增后，检测其
滴度为1.9×109pfu/ml，重组率达到99.1%，达到高质
量文库扩增要求，将该文库加入终浓度至7%的DMSO
后，于－8 0℃保存。
2.3.2插入片段检测
在原始文库进行蓝白斑筛选后的平板上，随机挑选
28个白色噬菌斑于预先加入10μl的SM buffer的离心管
中，4℃过夜使噬菌斑完全释放出来，取1μl作模板用
设计好的特异引物进行PCR扩增，检测插入片段大小。
从图4可以看出，插入片段除一个小于0.5kb外，其余
片段均在0.5kb以上，其中有19个片段大小在1.0～2.0kb
之间，有一个片段长达约3.0kb，大于1.0kb插入片段占
整个挑选菌落的70%左右，达到cDNA文库构建的要求。
3 讨 论
高质量的RNA是进行RT-PCR、Northern杂交、
cDNA文库构建以及RACE等研究的基础，同时也是分
离高质量mRNA的前提，所以针对不同材料选择不同
2.2南昆山毛叶茶春梢mRNA分离与反转录
茶叶总RNA混合后测定其浓度，取适量总RNA和
一定量的磁珠，分离总R N A中的m R N A，纯化后的
mRNA在反转录酶和DNA聚合酶作用下分别得到一链和
二链的cDNA，分别取三种产物各1μl经琼脂糖凝胶电
泳，结果如图2所示。从图可以看出，实验中得到的
mRNA和经反转录获得的cDNA第一链其片段大小主要分
布在1～2kb之间，而双链cDNA片段多为0.5kb以上，所
获得的片段符合构建文库的要求，可以进行下一步实验。
2.3南昆山毛叶茶cDNA文库质量鉴定
将大片段cDNA与噬菌体载体连接、包装后，即
得到南昆山毛叶茶原始文库。测定该文库滴度、重组
率和插入片段大小以鉴定其质量；将原始文库扩增以利
于长期保存。
2008, Vol. 29, No. 05 食品科学 ※生物工程340
图4 南昆山毛叶茶cDNA文库插入片段PCR鉴定
Fig.4 PCR identification of the insert fragment of cDNA library in
Camellia ptilophylla Chang
M
M
2000bp
1000bp
750bp
500bp
2000bp
1000bp
750bp
500bp
RNA提取方法非常重要。茶叶由于其富含茶多酚和多糖
等物质，采用普通的Trizol试剂法或异硫氰酸胍裂解法
难以提取到高质量的RNA。李娟[9]对比了几种不同方法
提取茶叶总RNA，发现在研磨过程中添加不溶性PVP，
并且整个过程在低温下进行，提取的RNA质量最好，
而直接按Trizol试剂说明提取的RNA降解严重。南昆山
毛叶茶与普通茶叶相比不仅富含茶多酚，而且花青素含
量比普通茶叶高很多。为了消除这些不利因素的影响，
本实验在参考张智俊[10]研究的基础上，采用CTAB-LiCl
沉淀法提取南昆山毛叶茶RNA，较好地解决了高茶多
酚、高花青素含量对RNA提取的影响，得到了较理想
的的效果(见图1)，满足了文库构建等进一部实验的需
要。此外，利用该方法从其他茶树品种中同样获得了
质量较佳的RNA，说明该方法能适应不同特性的茶树品
种，且较Trizol等试剂盒方法更节约成本。
在文库构建过程中cDNA片段的大小以及连接之前
对cDNA准确定量至关重要。经XhoⅠ酶切后的双链
cDNA与大量的小片段DNA和引物混合在一起，小片
段核苷酸的存在除了会影响后期与载体的连接外还直接
影响文库插入片段大小和全长cDNA的比例，所以分离
后应该尽量减少小片段DNA的回收。另外，由于载体
的浓度是一定的，cDNA在与之连接时，只有在准确测
定cDNA浓度情况下，控制插入cDNA与载体的比例连
接才能取到理想的效果，文库质量才会有保证。
南昆山毛叶茶cDNA文库的成功构建，不仅为这一
特殊资源的功能基因组学研究提供了一个技术平台，同
时也为茶树分子生物学研究打下坚实的基础。
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