全 文 ：茶 叶 科 学 2003，23（2）：146—150
Journal of Tea Science
收稿日期：2002—01—23 修订日期：2003—07—16
基金项目： 2000年广东省自然科学基金资助课题
作者简介：李斌（1960-），女，山东龙口人，教授，博士生导师，从事茶叶生物技术、深加工等研究。
文章编号： 1000—369X（2003）02—0146—05
南昆山毛叶茶和云南大叶种的 RAPD分子标记研究
李斌，尹逸，周英，邓佩卿，杨宏伟
（华南农业大学食品学院 广东 广州 510642）
摘要：采用 RAPD分子标记技术对南昆山毛叶茶和云南大叶种进行 DNA分子标记研究。从 300个随机引物中筛
选出 36个有效引物共产生 4382 条 DNA片段，平均每个单株扩增出 109.55条带，片段大小分布在 0.15 kb～3.70
kb之间。在扩增出的 315条不同分子量的 DNA谱带中，21条是单态的，294条是多态的，多态性高达 93.33%，
其中云南大叶种多态性谱带达 286条，多态性为 90.79%，南昆山毛叶茶多态性谱带有 265条，多态性为 84.13%。
通过类平均聚类（UPGMA）法，绘制出南昆山毛叶茶与云南大叶种DNA之间的遗传关系树状图。
关键词：南昆山毛叶茶；云南大叶种；RAPD；遗传多态性
中图分类号：S571.1; Q523 文献标识码：A
Genetic Diversity of Two Sexual Tea Cultivars
Detected by RAPD Markers
LI Bin, YIN Yi, ZHOU Ying, DENG Pei-qing, YANG Hong-wei
(College of Food Sci and Tech, South China Agri Univ, Guangzhou 510642, China)
Abstract: RAPD markers analysis on the genome DNA of two sexual cultivars of Yunnadaye and Nankunshan
maoyecha were studied by amplifying with 36 arbitrary 10-mer primers in order to defect the genetic diversity and
relationship. Among the two sexual tea cultivars, 4382 loci were amplified, 109.55 loci per cultivars. In the total 315
DNA bands, 294 bands were polymorphic, the genetic diversity was 93.33%. It has been proved that Yunnadaye
possess much higher genetic diversity than Nankunshan maoyecha on DNA molecular level. According to the cluster
analysis, the two sexual cultivars might be divided into two groups by UPGMA method. 20 plants of Yunnadaye
were classified as one group and 20 plants of Nankunshan maoyecha were classified as another group.
Key words: Nankunshan maoyecha; Yunnadaye; RAPD; Genetic diversity
南昆山毛叶茶(Camellia ptilophylla Chang)
是二十世纪八十年代初，中山大学著名植物分
类学家、世界山茶科分类权威张宏达教授在中
国广东境内发现的一种天然无咖啡碱的茶树
品种资源[1-2]。该茶树是二倍体 [3]，体内生物
碱的组成由 3%～6%的可可豆碱替代了 3%～
5%的咖啡碱，加工的茶叶在风味上与普通茶
叶没有明显的差异 [4]，但在药理和生理功能
上，避免了咖啡碱引起的不适症状，具有强心，
保护缺氧心肌，提高机体动态耐力，帮助消化，
利尿等作用。初步研究表明其具有一定的抗肿
瘤作用[5-6]，该种质的发现引起了世界有关专
家的关注。本研究以南昆山毛叶茶为材料，选
取云南大叶种为对照，采用 RAPD 分子标记技
DOI:10.13305/j.cnki.jts.2003.02.012
2期 李斌，等：南昆山毛叶茶和云南大叶种的 RAPD分子标记研究
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术，对两个有性系品种基因组 DNA进行分子
标记研究，以期为茶树品种资源的收集、保存、
研究、利用，为鉴定茶树品种间的亲缘关系，
为茶树的遗传育种提供 DNA分子水平的研究
结果。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为有性系的南昆山毛叶茶和云
南大叶种，每个品种取 20 个单株。南昆山毛
叶茶 20 个单株均为无咖啡碱或低咖啡碱单
株，云南大叶种从有性群体品种中随机抽取
20个单株。每个单株取新梢 1芽 2叶进行DNA
提取和 PCR扩增。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取
参照陈亮等 [7]人的方法，略加改进，进行
DNA的提取。具体步骤如下：
称取 2.0g 茶叶，在液氮中快速研磨至粉
末状，移入 50 ml离心管，加入 10 ml提取液
提取，离心，去上清液，加入 15 ml裂解液，
于 65℃水浴上裂解 1h，加入 5 mlCI溶液处理
5 min，离心，取上清液，加入等体积的异丙
醇，沉淀出 DNA。
1.2.2 DNA的纯化
加入 2～3μ l的 Rnase于 TE溶解的 DNA
中处理 1～2 h，加入 500μlCI溶液处理 5 min，
离心，取上清液，加入乙醇漂洗后，加入 500
μl TE溶液，溶解纯化的 DNA，于-20℃冰箱
中保存备用。
1.2.3 RAPD 扩增
反应体系总体积 25μl，各组成成分如下表。
表 1 RAPD反应体系组分
Table 1 The composition of RAPD Reaction
组分 模板 DNA MgCl2 dNTP 引物 Taq酶 ddH2O
终浓
度
25-50ng 2mmol/L 0.2mmol/L 0.2mmol/L 1U 加至 25 ml
扩增步骤及参数：
取 1.5 ml已灭菌的 Eppendorf管，依扩增
样本数计算各成分的量，依次加入 ddH2O→10
×缓冲液→dNTP→引物→Taq酶，混匀后分装
到各扩增薄壁管中，依次加入模板，按下述程
序进行扩增：
94℃ 3 min
94℃ 45 s
36℃ 50 s 45个循环
72℃ 2 min
72℃ 10 min
扩增结束，取出样本，置于 4℃冰箱中保存。
将扩增样本进行琼脂糖凝胶电泳，在 UVP
凝胶成像系统中将凝胶照相并存盘。
1.2.4 UPGMA类平均法聚类分析
利用 Ntsys-PC1.8 软件包，采用类平均法
(UPGMA)聚类分析相似系数距阵和树状图。
2 结果分析
2.1 基因组 DNA 的提取与纯化
在 DNA提取过程中，为防止茶多酚氧化
影响 DNA的得率和质量，本研究采用可溶性
PVP 作吸附剂，β-巯基乙醇作抗氧化剂，去
除并防止茶多酚氧化。经上述处理的茶叶
DNA提取样本，其 DNA得率在 200-600μg/g
之间，没有明显的降解，适合进行 RAPD 扩增。
2.2 引物的筛选
从上海生物工程有限公司合成的 S1-S300
的 300 个引物中进行筛选，随机抽取 5个单株
的基因组 DNA为模板，筛选出 40个对 5个单
株均可扩增出谱带的引物，重复扩增后选择
36 个重复性较好的引物进行全面扩增。
2.3 RAPD 扩增带型分析
用所筛选出的 36 个引物对两个有性系品
种共 40 个单株进行 RAPD 扩增，共扩增出
4382 条谱带，平均每个单株扩增出 109.55 条
带，扩增的 DNA片段大小分布在 0.15-3.70 kb
茶 叶 科 学 23 卷
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之间。在扩增产生的不同分子量的 315条 DNA
带中，多态性带数为 294条，多态性达 93.33
％。20个云南大叶种单株，多态性带数为 286
条，多态性为 90.79％；南昆山毛叶茶多态性
带数为 265条，多态性为 84.13％。两品种遗
传多态性表现如表 2、图 1、图 2 所示。
表 2 南昆山毛叶茶与云南大叶种遗传多态性综合比较
Table 2 Genetic Diversity of the Two Cultivars
总带数 (条 ) 多态性带数(条) 多态性（%）
云南大叶种 286 90.79
南昆山毛叶茶 265 84.13
总 计 315 294 93.33
从上表两品种基因组 DNA的 RAPD 分子
标记结果可见，南昆山毛叶茶和云南大叶种都
具有丰富的遗传多态性，且云南大叶种的遗传
多态性较南昆山毛叶茶丰富，这一结果与两个
品种的起源、系统演化和染色体等的研究结果
相一致。
2.4 RAPD 的聚类分析
采用 UPGMA进行聚类分析，得出云南大
叶种与南昆山毛叶茶聚类结果树状图（图 3）。
图中两品种在相似系数 0.65 处划分，各聚为一
类，分属不同的类群。从图中的相似系数可以
看出，南昆山毛叶茶各单株间的相似性高于云
南大叶种，说明云南大叶种的遗传多态性较丰
富。
3 讨论
3.1 RAPD 技术在茶树遗传多样性研究中应用
的可行性
RAPD 技术是利用随机引物在生物种群
中寻找同源序列，并将同源序列之间的片段扩
增出来的一种分子标记技术。该技术主要通过
DNA 带的有无统计分析生物种群或个体间的
遗传多样性和亲缘关系。RAPD 技术作为一种
简便、快速、安全和高灵敏度的分子标记，已
广泛应用在动植物种群划分，遗传图谱构建，
基因定位等研究领域。1996 年茶树开始应用
该技术进行种间、种内的遗传多样性研究和亲
缘关系分析，并得到了较理想的研究结果。本
研究采用 RAPD 分子标记技术对我国珍稀茶
树资源南昆山毛叶茶等 2 个有性系品种的 40
个单株进行研究，所得结果与传统的茶树形
态、解剖、细胞和染色体研究结果相吻合，由
此说明 RAPD 技术在茶树品种资源研究上应
用是完全可行的。
3.2 南昆山毛叶茶与云南大叶种遗传多样性分析
不同物种的基因组 DNA 多态性表现不
同，同一物种不同品种，基因组 DNA多态性
表现也不同。Wachira F.N[8]的研究表明，茶
（C.sinensis）、普洱茶（C.assamica）和尖
萼茶（C.assamica ssp.lasiocalyx）等 38 个无
性系的遗传多态性为 62％，我国陈亮等[9]对
中国 15 个无性系的 RAPD 分析，其基因组
DNA扩增谱带的多态性高达 94.2％。现有的
研究表明，多态性程度随品种和引物数的增
加而提高。我们的研究表明，两个有性系品
种的遗传多样性高达 93.33％，其中云南大叶
种 20 个单株间的多态性达 90.79％，南昆山
毛叶茶 20 个单株间的多态性为 84.13％。根
据植物一般的演变规律，生长在原产地或生
态条件与作物习性相近地区的品种，往往拥
有较多的变异类型，其品种间的遗传多态性
也较高；距原产地越远，气候条件越极端，
在自然选择和人工选择的双重作用下，许多
不适应的变异类型被淘汰，品种内的变异类
型减少，品种间的遗传多样性也相对减少。
本研究结果从DNA分子水平上证实了茶树这
一演变规律。
本文作者曾对南昆山毛叶茶[4]和云南大叶
种[10]的染色体组型进行了分析研究，结果表明，
南昆山毛叶茶属对称性较低的2B型核型，而云
南大叶种属对称性较高的2A型核型。根据植物
染色体的进化是从对称性核型向不对称性核型
演化的理论可知，南昆山毛叶茶是起源较晚，
较进化的茶树资源，而云南大叶种是起源较早，
较原始的茶树类型。本研究从 DNA分子水平的
遗传多样性研究上也证实了这一结论。
2期 李斌，等：南昆山毛叶茶和云南大叶种的 RAPD分子标记研究
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3.3 结论
本研究采用 RAPD分子标记技术，对茶树
两个有性系品种的 40 个单株进行了 DNA 分
子水平的研究，结果表明：
1）CTAB 裂解法提取茶叶 DNA 是可行
的，提取的 DNA经纯化能够进行 PCR 扩增；
2）RAPD 可成功地运用于茶树品种资源
的遗传多样性研究；
3）36个引物的扩增结果表明，南昆山毛
叶茶的遗传多样性低于云南大叶种，是起源上
较进化的茶树品种类型。
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1 5 10 15 20 25 30 35 40
图 1 云南大叶种和南昆山毛叶茶的 S266 扩增带型图
Fig. 1 Primer S266 Amplified Banding of the two sexual cultivars
(注 :1-20为云南大叶种单株 ,21-40为南昆山毛叶茶单株 )
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150
0.60 0.64 0.68 0.72 0.76 0.80 0.84 0.88 0.92 0.96 1.00
图 3 两个有性系品种聚类分析树状图
Fig. 3 Clustering analysis for two sexual cultivars
1 5 10 15 20 25 30 35 40
图 2 云南大叶种和南昆山毛叶茶的 S125 扩增带型图
Fig. 2 Primer S125 Amplified Banding of the two sexual cultivars
注 :1-20为云南大叶种单株 , 21-40为南昆山毛叶茶单株