全 文 ：江西林业科技 2010年第 5期
柳叶蜡梅 RAPD反应体系的研究
杨华 1，张都海 1，陈 磊 2，杜国坚 1
（1.浙江省林业科学研究院,浙江杭州 310023；2.浙江科技学院,浙江杭州 310023）
摘 要：以柳叶蜡梅（Chimonanthus Salicfiolius Hu）为材料，对其 DNA提取方法和 PCR扩增反应体系的建立和
优化进行探讨。最适宜的 PCR反应条件为：20 μL PCR反应体积中含有 1×缓冲液，20 ng 模板 DNA，2.75 mmol/L
MgCl2，0.25 mmol/L dNTPs，2.0 U Taq DNA 聚合酶，0.4 μmol/L 引物。扩增程序为：94 ℃预变性 2 min；再 32个循环：
94 ℃ 60 s，36 ℃ 30 s和 72 ℃ 120 s；最后 72 ℃延伸 10 min。
关键词：柳叶蜡梅；RAPD；优化
分类号：Q75 文献标识码：A 文章编号：1006－2505(2010)05－0018－03
收稿日期：2010-06-18,2010-08-20修回
基金项目：浙江省属科研院所专项公益技术攻关项目（2008F1017）。
作者简介：杨华，女，副研究员，博士，主要研究方向为植物遗传育种。
柳叶蜡梅（Chimonanthus Salicfiolius Hu）又名香风茶、毛
山茶、秋蜡梅等，为蜡梅科半常绿灌木，叶片披针形似柳叶，
色、香、形、姿皆具有观赏价值[1]。《中国药典》七七版记载“山
蜡梅叶”及其制剂“山蜡梅茶”可用于防治感冒和流行性感
冒，安徽、江西等地叫“香风茶”。现今国内外对柳叶蜡梅的
形态、分布、繁育等研究逐渐增多 [1-2]，而在其分子水平的研
究却未有见闻。本文意在通过探索柳叶蜡梅 RAPD的扩增
方案，提出适合柳叶蜡梅的 RAPD－PCR 反应体系，为从
DNA分子水平上分析柳叶蜡梅的遗传多样性及遗传分化打
下基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
实验材料取自浙江省林业科学研究院苗圃。随机采集柳
叶蜡梅枝条上的幼嫩叶片，用塑料袋封装，用冰袋保鲜，带回
实验室后保存于 4 ℃冰箱中备用。
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1 主要仪器设备。PCR扩增仪（Tpersonal Thermocycler ，
Biometra）；全自动凝胶成像分析系统（上海培清科技）；DYY-
8C型双稳电泳仪；
1.2.2 主要试剂。琼脂糖（Spain）；引物（(Sangon 公司）；Taq
DNA聚合酶和 Buffer (BIOER公司)；dNTPs (BIOER公司)；
1.3 基因组 DNA提取方法
1.3.1 SDS-CTAB法，参考文献[3]。
1.3.2 CTAB提取法，参考文献[4]。
1.4 PCR扩增条件的初步优化
PCR扩增采用 20 μl体系：10×buffer(w/Mg)2.0 μl，2.5mmol/
L dNTPs，0.2 μmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，20 ng左右的
模板 DNA。基本程序如下：94 ℃预变性 2min；再 32个循环：
94 ℃变性 1 min，36 ℃退火 30S，72 ℃延伸 2 min；最后 72 ℃
延伸 10 min。取加入溴酚蓝的扩增产物 13 μl，用含有溴化乙
锭的 1.2%琼脂糖凝胶在 1×TAE缓冲液中电泳分离检测，电
泳结果通过凝胶成像分析系统打印和存盘保存。
因 RAPD扩增容易受到诸多因素的影响，如 DNA模板
的浓度和纯度、引物与 dNTPs的用量、Taq DNA 聚合酶的浓
度、扩增程序与循环周期等都会影响扩增式样，因此，需要优
化固定 RAPD-PCR反应的各种条件，以期实验得到很好的重
复。筛选出多态性强，重复性好的引物是整个实验成功的关
键。实验过程中使用的引物见表 1。
表 1 RAPD分析用的 15个随机引物序列
1.5 dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物和 Mg2＋的用量
采用 L9(34)的正交表（见表 2），寻找最佳组合。
表 2 各种因子的浓度
1.6 扩增程序的优化
以 36 ℃、39 ℃、42 ℃、45 ℃ 4种温度作为退火温度，比
较确定最佳的温度。
2 结果与分析
引物 碱基（5’-3’） 引物 碱基（5’-3’） 引物 碱基（5’-3’）
61
62
63
64
65
TTCGAGCCAG
GTGAGGCGTC
GGGGGTCTTT
CCGCATCTAC
GATGACCGCC
71
72
73
74
75
AAAGCTGCGG
TGTCATCCCC
AAGCCTCGTC
TGCGTGCTTG
GACGGATCAG
76
77
78
79
80
CACACTCCAG
TTCCCCCCAG
TGAGTGGGTG
GTTGCCAGCC
ACTTCGCCAC
NO. dNTPs μmol/L Taq DNA聚合酶 U 引物 μmol/L Mg2＋ μmol/L
1
2
3
0.15
0.25
0.35
1
1.5
2
0.2
0.4
0.6
2
2.375
2.75
18· ·
DOI:10.16259/j.cnki.36-1342/s.2010.05.003
2.1 基因组 DNA提取
图 1 柳叶蜡梅基因组 DNA提取
对比两种方法提取柳叶蜡梅 DNA的效果。从试验结果
可以看出（见图 1），两种方法均可以提取出柳叶蜡梅的基因
组 DNA，但 SDS－CTAB法能有效地去除酚类化合物、多糖和
蛋白质，使提取的 DNA浓度更高，电泳前沿杂质少。因此，
SDS－CTAB法提取的柳叶蜡梅基因组 DNA能满足 PCR扩增
所需，可以作为优先选用的方法。
2.2 RAPD扩增反应的初步优化
2.2.1 dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物和 Mg2＋的用量对 RAPD
分析的影响
反应体系中各成分的用量对反应结果的影响很大，从
dNTPs、Taq DNA 聚合酶、Mg2＋和引物用量的组合实验中可以
看到（见图 2），第 1和 8的反应体系结果较好，第 5和 7的反
应体系扩增条带不是很清晰，第 2、3、4、6、9的反应体系完全
没有扩增结果。考虑到节省引物用量，最后选定第 8种反应
体系。
2.2.2 退火温度对 RAPD分析的影响。初次筛选出的引物还
图 2 不同浓度 dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物和Mg2＋的 RAPD扩增结果（使用引物依次为 61、62、71、74、79）
存在着弱带，弥散背景较为严重的问题。这种现象可能是由
于退火温度造成的。通过对 RAPD反应的退火温度的调节，
发现柳叶蜡梅的 RAPD反应在 36 ℃最好（见图 3），最终使用
温度为 36 ℃。
图 3 不同退火温度对 RAPD扩增的影响（每个退火温度下有 5个引物：71、74、75、78和 80，M为 100-bp DNA ladder Marker）
3 讨论
DNA的质量是决定分子生物学实验成就的主要因素之
一。自从 Marmur[5]在 1961年建立用 SDS和氯仿从细胞中分
离提取 DNA样品的经典方法以来，研究者一直在探索能制
备高纯度和高完整性 DNA 制品的最佳方案。Rogers 和
Bendich[6]用 CTAB法从植物材料中提取 DNA，但是产量较低。
Collins和 Symons[7]在 1992年从新鲜的叶片中成功提取出核
DNA，但步骤比较繁琐，产量也不高。目前，植物组织 DNA的
提取方法主要有 SDS法[8]、高盐低 pH法[9-10]、CTAB法[11-12]等。
虽然植物 DNA提取方法因材料不同而各异，但在材料的选
择上，总的一个原则是尽量使用植物的幼嫩部位。由于不同
植物及同一植物不同组织的结构及生化成分并不相同，对
DNA的不同提取方法会造成不同程度的影响。SDS是一种离
子型表面活性剂，溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而破坏细
胞膜。CTAB作为一种去污剂，能裂解细胞，破坏细胞膜系统，
使蛋白质变性，它能有效地防止组织破碎和沉淀大量材料时
的电离化作用及酚类化合物的进一步氧化。本实验说明 SDS－
CTAB法对柳叶蜡梅的 DNA提取是比较适用的。
一般 RAPD-PCR的退火温度都在 35 ℃~40 ℃[10,13] 之间，
高于 40 ℃时会抑制 PCR反应，本实验最终退火温度为 36 ℃，
19· ·
·封面说明·
山乌桕 Sapium discolor (Champ. ex Benth. ) Muell.-Arg.
山乌桕为大戟科乌桕属植物，落叶乔木，高达 21 m，秋天
叶变为红色或黄红色，点缀着亚热带森林的美丽秋色。叶卵
状长椭圆形，长 4～10 cm，宽 2～5 cm，全缘，两面无毛，叶背淡
绿色；叶柄初为淡红色，于叶片基部有两枚膨大的腺体，叶柄
长 2～7 cm。花序长 4～10 cm，花淡黄色，雄花花梗丝状，长
0.1～0.3 cm，苞片卵形，两边各有一枚腺体，每苞片内有花 7
朵；小苞片长 0.1～0.12 cm，花萼杯状，具不整齐裂齿；雌花花
梗粗壮，长 0.5～0.9 cm，每苞片内有 1花，花萼裂片长 0.18～2
cm。花柱粗壮，柱头 3裂。蒴果，3室；种子近球形，薄被蜡质假
种皮。花期 4～6月，果成熟期 9～10月。
山乌桕主要分布在浙江、安徽、江西、福建、台湾、湖南、
湖北、广东、广西、云南、贵州、印度、越南等地，海拔 500～1 500 m，
较喜光，种子繁殖，是良好的园林观赏树种。
（刘仁林）
符合一般 RAPD-PCR的退火温度。通过实验获得优化的 20
μL反应体系和扩增程序能有效的进行柳叶蜡梅 RAPD的扩
增，为柳叶蜡梅的相关分子研究提供有益的参考。
参考文献：
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Optimization of RAPD Reaction System for
Chimonanthus salicfiolius
YANG Hua1, ZHANG Duhai1, CHEN Lei2, DU Guojian1
（1. Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou Zhejiang 310023, China;
2. Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou Zhejiang 310023, China）
Abstract: Taking Chimonanthus salicfiolius Hu as molecular study material, the building and optimization of its DNA
extraction method and PCR Amplification Reaction System were discussed. The results showed that the conditions being
suitable for RAPD- PCR as follows: 1×buffer, 20 ng template DNA, 2.75 mmol/L MgCl2, 0.25 mmol/L dNTPs, 2.0 U Taq
DNA polymerase, 0.4 μmol/L primer. The amplification cycling was 1 cycle at 94 ℃ for 2 min; 32 cycles at 94 ℃ for 60 s,
36 ℃ for 30 s, and 72 ℃ for 120 s, respectively; and 1 cycle at 72 ℃ for 10 min.
Key words: Chimonanthus salicfiolius Hu; RAPD; Optimization
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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