全 文 ：书Guihaia Aug． 2016，36(8):897－905
http:/ / journal．gxzw．gxib．cn
http:/ /www．guihaia－journal．com
DOI:10．11931 /guihaia．gxzw201601029
葛风伟，曾卫军，李艳红，等． 小蓬 NeMT2基因的克隆及其植物表达载体的构建［J］． 广西植物，2016，36(8):897－905
GE FW，ZENG WJ，LI YH，et al． Cloning and construction of plant expression vector of NeMT2 gene in Nanophyton erinaceum［J］． Guihaia，2016，36
(8) :897－905
小蓬 NeMT2基因的克隆及其植物表达载体的构建
葛风伟，曾卫军，李艳红，赵惠新*
(新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，新疆师范大学 生命科学学院，乌鲁木齐 830054 )
摘 要:该研究利用 ＲACE (Ｒapid amplification of cDNA ends)技术从小蓬中成功分离编码金属硫蛋白(Metal-
lothionein，MT)的 cDNA序列，命名为 NeMT2，在 GenBank中登录号为 KT835290。该基因全长 590 bp，开放阅
读框为 237 bp，编码 78个氨基酸，编码的氨基酸序列中含有 14个半胱氨酸残基(Cys，C)，呈 C-C，C-X-C，C-X-
X-C排列，集中分布在肽链的 N端和 C端，基因编码蛋白的分子量为 7．603 6 kD，等电点为 4．71。系统发育分
析表明，小蓬金属硫蛋白 NeMT2与藜科的海蓬子(AEF01492)和盐穗木(AHI62953)同源性最高，其次是甜菜
(XP_010667708．1)。生物信息学分析表明，金属硫蛋白 NeMT2 无信号肽结构，属于非跨膜亲水性蛋白;疏水
性分析表明，NeMT2蛋白的 35～45个氨基酸之间有较强的疏水性，其中第 41位 Asp具最强的疏水性(1．444);
结构预测分析该蛋白质二级结构的主要元件是无规则卷曲。通过 ＲT-PCＲ 对 NeMT2 基因的表达分析发现，
NeMT2基因在铜矿区和非铜矿区的小蓬叶片中均有表达，但该基因在铜矿区小蓬叶片的表达量明显高于非铜
矿区。将小蓬 NeMT2基因定向克隆到植物表达载体 pCAMBIA1300的 35S 启动子下游，构建该基因的植物超
表达载体 pCAMBIA1300+NeMT2。该研究结果为进一步研究该基因的功能和小蓬响应重金属胁迫的分子机制
提供了一定基础。
关键词:小蓬，NeMT2，ＲACE，序列分析，植物表达载体
中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1000-3142(2016)08-0897-09
Cloning and construction of plant expression vector
of NeMT2 gene in Nanophyton erinaceum
GE Feng-Wei，ZENG Wei-Jun，LI Yan-Hong，ZHAO Hui-Xin*
(Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Ｒegulatory Biology，
College of Life Sciences，Xinjiang Normal University，Urumqi 830054 )
Abstract:Nanophyton erinaceum has a long living history at Aletai Copper Mine in Xinjiang． In order to analyze the re-
lation between metallothionein gene and heavy metal response stress，a new heavy metal-responsive gene cDNA sequence
was successfully cloned by ＲACE (Ｒapid amplification of cDNA ends)from N． erinaceum． The gene was named as
NeMT2，and its accession number in GenBank was KT835290． The metallothionein gene NeMT2 was 590 bp in full
length，and it had 237 bp OＲF (open reading frame)which encoded 78 amino acid residues． There were 14 Cys resi-
dues，arranged in the form of C-C，C-X-C and C-X-X-C，in the 78 amino acid residues，and these Cys residues distrib-
uted in N terminal and C terminal of peptides． The protein encoding by gene NeMT2 molecular weight was 7．603 6 kD
and its isoelectric point was 4．71． Phylogenetic analysis results demonstrated that the deduced amino acid sequence of
收稿日期:2016-01-19 修回日期:2016-04-21
基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金(2013211A024)［Supported by the Natural Science Foundation of Xinjiang (2013211A024) ］。
作者简介:葛风伟(1976-)，女，江苏新沂人，博士，讲师，从事植物逆境分子生物学研究，(E-mail)mastergfw@ 163．com。
* 通讯作者:赵惠新，博士，副教授，从事植物逆境分子生物学研究，(E-mail)954843437@ qq．com。
gene NeMT2 was the highest homology as the Salicornia brachiata (AEF01492) and the Halostachys caspica
(AHI62953)，secondly the Beta vulgaris (XP _010667708．1) ，but the lowest similarity with the Nelumbo nucifera
(XP_010253171)． Bioinformation analysis showed that metallothionein NeMT2 had no signal peptide and belonged to the
hydrophilic non－transmembrane protein． Hydrophobicity analysis was carried out and the results showed that there was a
strong hydrophobicity region between 35 to 45 amino acids，and the 41 Asp had the strongest hydrophobic property
(1．444)． Predication of structure indicated that random coil was the major components of its secondary structure． Expres-
sion analysis of NeMT2 gene was carried out by ＲT-PCＲ． The results showed that expression of NeMT2 gene was detected
both in Copper Mine and nor Copper Mine in Nanophyton erinaceum leaves，but the former was more stronger than the
latter，which indicated that NeMT2 gene was responsive to the heavy metal stress． Then NeMT2 gene in Nanophyton eri-
naceum was cloned into 35S promoter downstream of plant over-expression vector pCAMBIA1300 in orientation． The plant
overexpression vector pCAMBIA1300+NeMT2 was successfully constructed． These findings will provide information for
the functional study of NeMT2 and its molecular mechanism in repnse to the heavy metal stress．
Key words:Nanophyton erinaceum，NeMT2，rapid amplification of cDNA ends，sequence analysis，plant expression vector
金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类广泛
存在于生物体内的低分子量(6 000 ～ 7 000 Da)蛋
白，富含半胱氨酸(Cystine，Cys)，对多种金属有高度
亲和性。植物金属硫蛋白在重金属离子解毒及金属
离子代谢(常团结和朱祯，2002a)、活性氧清除
(Akashi et al，2004)、转运和储存金属离子(Belghith
et al，2016)、维持金属离子稳态(Hegelund et al，
2012)等方面起到重要作用。另外，该基因还参与
了植物的生长发育、胚胎发育、果实成熟、衰老和抗
逆反应等植物生理过程(常团结和朱祯，2002a，b;
Charbonnel-Campaa et al，2000)。因此，对金属硫蛋
白基因 MT的研究将成为植物抗逆研究中的一个重
要方向(樊连梅等，2011)。目前，已从 NCBI 数据库
中搜索到拟南芥等多种植物的金属硫蛋白基因，但
对其功能研究还知之甚少。随着现代生物学技术的
日新月异，植物抗逆基因资源的开发及转基因育种
方面的研究，已成为植物逆境分子生物学的热点和
农业抗逆领域的重要课题(颜宏等，2006)。
小蓬(Nanophyton erinaceum)是藜科小蓬属植
物，是重要的抗逆植物。常生于戈壁、石质山坡，其
适应性极强，在我国仅分布于新疆(新疆植物志编
委会，1994)。阿勒泰市是新疆重点有色金属开发
带，通过前期野外考察发现小蓬是阿勒泰富蕴县铜
矿区的优势物种之一。目前对小蓬的研究多集中在
抗逆生理学方面，关于其抗逆的分子机制尤其是小
蓬金属硫蛋白基因 MT 的研究未见报道。因此，本
研究以小蓬叶片为材料，通过 ＲACE 技术从小蓬中
克隆得到金属硫蛋白基因 NeMT2 的 cDNA 全长序
列，利用生物信息分析方法对 NeMT2 基因编码的氨
基酸序列与组成、蛋白质理化性质、发育树进化分
析、跨膜区与信号肽、疏水性分析、蛋白质二级结构
进行预测。通过 ＲT-PCＲ 技术分析了 NeMT2 基因
的表达，以 pCAMBIA1300 载体为基本载体构建了
该基因的表达载体，上述工作将为小蓬金属硫蛋白
基因 NeMT2功能的研究提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试验材料 利用大量采样法分别采集生长在
新疆阿勒泰富蕴县铜矿区(46° 45． 477 N，89° 41．
430 E)和非铜矿区(距离铜矿区 3．5 km的国道)的
小蓬植株，选取株龄基本一致的小蓬顶端光合枝叶
片作为材料。在小蓬生长旺盛的铜矿区选取 3 个 5
m × 5 m的采集区样方，分别于每个样方的 4 个方
向各选 1个点，每个点选取 5株共 60株小蓬进行样
品采集。同时选取距铜矿区 3．5 km 处的非矿区采
集小蓬叶片，方法同矿区一致。收集的叶片样品经
液氮处理后带回实验室，置于－70 ℃冰箱中保存，提
取的总 ＲNA用于 ＲT-PCＲ分析。
1．1．2 试剂 菌株 E． coli DH5α由实验室保存，质粒
载体为 pMD18-T Vector(Invitrogen)。MMLV第一链
cDNA 反转录试剂盒等购自宝生物公司，TＲIzol、
DNA凝胶回收试剂盒(AxyGEN)、PCＲ 扩增试剂盒
均购自北京天根公司。
1．2 方法
1．2．1 总 ＲNA 的提取与第一链 cDNA 合成 采用
TＲIzol法提取小蓬幼叶总 ＲNA。提取的总 ＲNA 上
样于 1%琼脂糖凝胶中，检测 ＲNA的完整性。取 11
μL的总 ＲNA 为模板，依据 Ｒeverse Transcriptase M-
898 广 西 植 物 36卷
MLV(ＲNaseH－)(TaKaＲa)反转录试剂盒进行 cDNA
第一链的合成。合成的 cDNA 样品稀释 5 ～ 10 倍，
置于－20 ℃冰箱中，用于后续的基因克隆实验。设
计金属硫蛋白基因克隆引物(表 1)，送至华大基因
科技有限公司合成。
1．2．2 NeMT2基因的克隆与序列测定 根据本课题
组前期研究获得的金属硫蛋白基因部分序列
(KT821088，221 bp)，设计 3ＲACE 上游引物 GSP3
1 和 GSP3 2(表 1)进行 NeMT2基因 3序列的克隆。
以上述反转录的 cDNA 第一链为模板，表 1 相对应
的引物进行 PCＲ 扩增。GSP3 1 为上游引物，AP1
为下游引物，进行第 1 轮扩增。GSP3 2 为上游引
物，AP2 为下游引物，进行第 2 轮扩增。同样根据
NeMT2 基因部分序列设计 5 ＲACE 的下游引物
GSP51 和 GSP52(表 1)进行 NeMT2基因 5序列的
克隆。以 AP3为上游引物，GSP51 为下游引物，进
行第 1轮扩增反应。以 AP4为上游引物，GSP52为
下游引物进行第 2轮扩增反应。
利用克隆获得 NeMT2的 3和 5的基因片段，拼
接得到 NeMT2基因的全长 cDNA序列。用 NCBI 的
OＲF程序搜索 NeMT2 的开放阅读框(open reading
frame，OＲF)，设计全长特异性引物 NeMT2-F 和
NeMT2-Ｒ(表 1)，PCＲ 扩增 NeMT2 基因的编码区。
扩增产物上样于 1．2%的琼脂糖凝胶检测片段大小，
根据凝胶回收试剂盒说明书进行片段回收与纯化。
取 4．5 μL 纯化产物与 1 μL pMD18-T 载体连接，连
接产物转化大肠杆菌感受态细胞，以氨苄为筛选标
记在 LB固体培养基上 37 ℃过夜培养，之后进行蓝
白斑筛选重组子。挑取单克隆菌落摇菌培养，进行
PCＲ鉴定，菌液送华大基因科技有限公司测序。
1．2．3 NeMT2基因生物信息学分析 用 NCBI(http:/ /
www．ncbi．nlm．nih． gov /)的 BLAST 软件进行同源性
搜索，用 OＲF Finder程序(http:/ /www．ncbi．nlm．nih．
gov /gorf /gorf．html)预测金属硫蛋白基因的开放阅读
框;用 Conserved Domains(http:/ /www．ncbi．nlm．nih．
gov /Structure /cdd /wrpsb．cgi)进行蛋白质保守区分
析;之后使用 ClustalX 软件进行氨基酸序列的多重
比对分析;采用 MEGA 5．0构建了系统进化树;利用
ExPASy 的 ProtParam(http:/ /web． expasy． org /prot-
param /)分析编码蛋白质的相对分子量、等电点、亲
水性分析等理化性质(Walker，2005);用 ExPASy 的
ProtScale(http:/ /web． expasy． org /cgi-bin /protscale /
protscale．pl)以默认算法 (Hphob． /Kyte ＆ Doolittle)
表 1 小蓬 NeMT2基因克隆引物
Table 1 List of primers used for cloning NeMT2 gene
引物名称
Primer name
核酸序列
Nucleotide sequence
GSP3 1 ATTTCGCAGAGACCGCTTCAAACCCT
GSP3 2 CATCATCGTAGACGGTGTTGCTCCCA
GSP5 1 TCTTGGGAGCAACACCGT
GSP5 2 ACGATGATGGTAGGGTTTGA
AP1 CTAATACGACTCACTATAGGGC
AP2 CTAATACGACTCACTATAGGGC
AP3 GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGG
AP4 GGCCACGCGTCGACTAGTAC
NeMT2-F ATGTCTTGCTGTGGTGGT
NeMT2-Ｒ TCACTTGCAGGTGCAAGGG
进行疏水性分析(Kyte et al，1982);利用 TMHMM
Server v． 2． 0(http:/ /www． cbs． dtu． dk /services /TM-
HMM/)和 TMpred Server(http:/ / ch．embnet．org / soft-
ware /TMPＲED_form． html)进行金属硫蛋白跨膜区
预测;采用 SignalP4．1(http:/ /www． cbs． dtu． dk /serv-
ices /SignalP)对编码蛋白信号肽进行预测分析(Pe-
tersen et al，2011);用 SOPMA 程序(https:/ /npsa-
prabi． ibcp． fr /cgi-bin /npsa_automat． pl?page = npsa_
sopm．html)预测 NeMT2 蛋白的二级结构(Geourjon
＆ Deleage，1995)。
1．2．4 NeMT2基因 ＲT-PCＲ 表达分析 利用大量采
样法分别采集生长在新疆阿勒泰富蕴县铜矿区和非
铜矿区小蓬植株，采集小蓬顶端光合枝的叶片用
TＲIzol法提取总 ＲNA，用酶标仪(Bio-tek ELx 800)
测定 ＲNA的浓度。分别取矿区和非矿区的小蓬叶
片等量总 ＲNA，依据 M-MLV 反转录试剂盒(TaKa-
Ｒa)进行 cDNA第一链的合成。根据藜科植物 Actin
基因序列设计一对引物 Actin-F:5-GTGGTCGTA-
CAACGGTATTGTG-3，Actin-Ｒ:5-GACCCTCCAATC-
CAGACACTG-3。以反转录的第一链 cDNA 为模
板，用上述合成的 Actin 引物和 NeMT2 基因特异性
引物同批异管进行 ＲT-PCＲ基因表达分析。
1．2．5 NeMT2基因真核表达载体的构建 用 BamH I
和 Pst I 双酶切含有 NeMT2 基因的克隆载体
pMD18-T，pCAMBIA1300 质粒同样进行双酶切，经
琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收及纯化。将目的
基因与 pCAMBIA1300 载体进行体外连接，构建
NeMT2 基因的植物表达载体 pCAMBIA1300 +
9988期 葛风伟等:小蓬 NeMT2基因的克隆及其植物表达载体的构建
NeMT2。随后转化到大肠杆菌感受态细胞中，在含
Kan的 LB固体培养基中培养 。将转化出来的单菌
落通过摇菌，将经过菌液 PCＲ鉴定的阳性菌液进行
质粒抽提。将抽提的重组质粒分别使用 BamH I 和
Pst I进行双酶切，根据片段大小鉴定质粒的构建。
2 结果与分析
2．1 ＲNA质量检测
由图 1 可见，28S、18S 和 5S 条带整齐清晰，表
明所提总 ＲNA 完整性较好，没有降解;紫外分光光
度检测 OD260 /OD280为 1．8 ～ 2．0 之间。提取的总
ＲNA的纯度及完整性都较高，可用于下一步的反转
录分析。
图 1 ＲNA凝胶电泳图
Fig． 1 ＲNA agarose gel electrophoresis
2．2 小蓬金属硫蛋白 NeMT2基因的克隆
由图 2 可知，通过 NCBI 数据库进行比对，
Blastn比对结果显示:其与藜科植物海蓬子 MT基因
(GenBank 登录号:KF876178． 1)序列的同源性为
83%，与盐穗木 MT2 基因 (GenBank 登录号:
JF780913．1)序列的同源性为 80%。小蓬金属硫蛋
白基因与其它植物的金属硫蛋白基因的亲缘关系也
较近，序列同源性分析见表 2，可推测其为 MT 家族
成员。将克隆的基因命名为 NeMT2，并提交到 Gen-
Bank上，登录号为 KT835290。
克隆获得的 NeMT2基因全长 590 bp，通过生物
信息学(OＲF Finder)分析其完整的开放阅读框
(OＲF)。发现该基因包含一个 237 bp 开放阅读框，
编码 78 个氨基酸，其中 5非编码区 211 bp，3非编
码区 412 bp(图 3)。
2．3 小蓬金属硫蛋白 NeMT2理化性质预测及分析
ExPASy ProtParam预测表明，小蓬 NeMT2基因
表 2 NCBI Blastn同源序列搜索
Fig． 2 Homology sequence search by NCBI Blastn
金属硫蛋白基因
MT gene
登录号
Access No．
同源性
Similarity
(%)
Halostachys caspica metallothionein
mＲNA，complete cds
KF876178．1 83
Salicornia brachiata metallothionein
(MT-2)mＲNA，complete cds
JF780913．1 80
Beta vulgaris vulgaris metallothionein-
like protein type 2
XM_010669406．1 80
Mesembryanthemum crystallinum met-
allothionein
AF000935．1 78
Amaranthus cruentus metallothionein
mＲNA
AF268027．1 78
Limonium bicolor metallothionein type 2 EF103575．1 77
编码蛋白的分子式为 C300 H477 N89 O108 S17，理论分子
量为 7．6036 kD，理论等电点为 4．71;预测该蛋白的
半衰期为 30 h ，不稳定参数为 30．72 ，预测其为稳定
蛋白(＜ 40 为稳定蛋白)。相对含量较多的氨基酸
有 Gly (15个，19．2%)，Cys (14 个，17．9%) ，Ala(8
个，10．3%) ，Asn (6个，7．7%) ，Lys(5个，6．4%) ，Pro
(4 个，5．1%) ，Ser(4 个，5．1%) ，Thr(4 个，5．1%) ，
Glu(4 个，5． 1%) ，Asp(3 个，3． 8%) ，Ile(3 个，
3．8%) ，Met(3个，3．8%) ，Phe(2 个，2．6%)和 Val(2
个，2． 6%) ;相对含量较少的氨基酸有 Tyr(1 个，
1．3%);NeMT2 蛋白不含有 Pyl，Sec，Arg，Trp，Leu，
Gln和 His。亲水性平均数为－0．027，预测 NeMT2
蛋白为亲水性蛋白。
2．4 小蓬金属硫蛋白 NeMT2 氨基酸序列比对和系
统进化树分析
2．4．1 金属硫蛋白 NeMT2 氨基酸序列比对分析 根
据 Blast搜索，筛选出与小蓬 NeMT2 蛋白序列相似
度较高的 7 个植物金属硫蛋白的同源序列，采用
Clustal W软件进行多重序列的比对分析(图 4)。
发现小蓬 NeMT2 蛋白的氨基酸序列同藜科海
蓬子(Salicornia brachiata)和盐穗木(Halostachys
caspica)相似序列较高。NeMT2 基因编码的氨基酸
序列共有 14个 Cys残基，该残基主要集中在肽链的
N端和 C 端。Cys 残基以 C-C 型，C-X-C 型和 C-X-
X-C型排列，其中 C-X-C 型在该氨基酸序列出现了
5次。该氨基酸中部不含有 Cys，保守性很低。可
见，Cys残基的数目和位置在不同物种间都有很高
的保守性。根据 Conserved Domains 程序预测小蓬
NeMT2蛋白的保守序列，发现第 26～77个氨基酸之
009 广 西 植 物 36卷
图 2 小蓬 NeMT2基因全长 cDNA及其推测的氨基酸序列 编码区用下划线标出(起始密码子 ATG，终止密码子 TGA)。
Fig． 2 Total cDNA sequence of NeMT2 gene from Nanophyton erinaceum and deduced amino acid sequence
Coding sequence is underlined (initiation codon is ATG，and stop codon is TGA)．
图 3 NeMT2 PCＲ产物扩增 M． 分子量标记 (DL 2 000);
1． 3 ＲACE产物;2． 5 ＲACE产物;3． CDS产物。
Fig． 3 PCＲ amplification result of NeMT2
M． Marker (DL 2 000);1． 3 ＲACE product;
2． 5 ＲACE product;3． CDS product．
间的序列是 Metallothionein－ 2的保守区，该区域具有
金属硫蛋白基因典型的结构域特征，从而确定
NeMT2基因为Ⅱ类金属硫蛋白基因(ClassⅡ)(图 5)。
2．4．2 系统进化树分析 从 NCBI 上搜索了海蓬子、
盐穗木、蝇子草(Silene niceensis)、甜菜(Beta vulgar-
is)、红树(Bruguiera gymnorhiza)莲(Nelumbo nucif-
era)、苋菜(Amaranthus cruentus)棉花(Gossypium ar-
boreum)、菠菜(Spinacia oleracea)、马黛茶(IIex para-
guariensis)、拟南芥 (Arabidopsis thaliana)、荠蓝
(Camelina sativa)和星星草(Puccinellia tenuiflora)共
13种植物的金属硫蛋白基因的氨基酸序列，用于系
统发育树的构建(图 6)。进化分析表明，藜科的海
蓬子(AEF01492)和盐穗木(AHI62953)来自同一个
进化分枝，而本研究所克隆 NeMT2 基因所推测的氨
基酸序列与这二者的同源性最高，其次是甜菜(XP_
010667708．1);而与莲(XP _010253171)和马黛茶
(AFP93964)的亲缘关系最远。
2．5 小蓬金属硫蛋白 NeMT2跨膜结构、信号肽预测
及疏水性分析
蛋白质跨膜结构域预测表明，NeMT2 蛋白的肽
链位于细胞膜外，说明该蛋白没有跨膜结构域。利
用 SignalP 4．1对 NeMT2蛋白信号肽进行预测分析，
发现该蛋白并不存在信号肽序列。可见，小蓬
NeMT2蛋白属于非跨膜、非分泌型蛋白。
通过 Protscale程序对蛋白质的疏水性预测(图
7)结果可知，小蓬金属硫蛋白 NeMT2中部疏水性较
强，而两端则为亲水区。由图可知，第 64 位 Cys 的
亲水性最强，分值为－1．178(最低);第 41 位 Asp 的
疏水性最强，分值为 1．444(最高)。
2．6 小蓬金属硫蛋白 NeMT2的二级结构预测分析
利用 SOPMA程序预测小蓬金属硫蛋白 NeMT2
的二级结构(图 8)。由图 8可知，金属硫蛋白 NeMT2
的二级结构包含 65．38%的无规则卷曲、16．67%的
α-螺旋、11．54%的延伸链、6．41%的 β-折叠。可见，
无规则卷曲在该蛋白的二级结构中占有大多数，预
测其形成 α-螺旋、β-折叠的氨基酸很少。
2．7 NeMT2基因 ＲT-PCＲ表达分析
以小蓬肌动蛋白 Actin基因为内参进行定量，通
过 ＲT-PCＲ 对 NeMT2 基因在矿区和非矿区小蓬叶
片中的表达进行分析。图 9结果表明，NeMT2基因
1098期 葛风伟等:小蓬 NeMT2基因的克隆及其植物表达载体的构建
图 4 小蓬金属硫蛋白 NeMT2与 7种植物 MT蛋白序列的比对
Fig． 4 Multiple sequence alignment of metallothionein NeMT2 from Nanophyton erinaceum with MT protein from seven plants
图 5 NeMT2氨基酸保守功能区
Fig． 5 Conserved domain of NeMT2
在铜矿区和非铜矿区的小蓬叶片中均有表达，但该
基因在铜矿区小蓬叶片的表达量明显高于非铜矿区。
2．8 NeMT2基因真核表达载体的构建和鉴定
用 BamH I和 Pst I 双酶切克隆载体 pMD18-T+
NeMT2和 pCAMBIA1300，将 NeMT2 片段和 pCAM-
BIA1300载体片段用 T4 DNA 连接酶连接，转化大
肠杆菌 DH5a，筛选的阳性克隆用酶切验证(图 10)。
从图 10(泳道 3)可知，重组质粒用 BamH I 和 Pst I
双酶切获得一条约 230 bp的条带，说明构建的植物
表达载体已成功将小蓬 NeMT2基因整合进去。
3 讨论
通过前期野外考察，发现小蓬是阿勒泰富蕴县
铜矿区的优势物种。目前，关于金属硫蛋白基因
MT的结构组成及特点、该基因在小蓬耐受重金属
胁迫过程中的作用等相关研究未见报道。
本研究采用 ＲACE技术从小蓬叶片中克隆得到
金属硫蛋白基因 NeMT2 的 cDNA 全长序列。通常
依据氨基酸序列中 Cys 残基的排列方式对植物金属
硫蛋白基因进行分类(张艳等，2007)。根据 Cobbett
＆ Goldsbrough(2002)的分类方法将小蓬金属硫蛋
白 NeMT2 归为第Ⅱ类。Ⅱ类 MT 不存在信号肽序
列，无跨膜结构域，属于非分泌亲水性蛋白;其蛋白
质二级结构的主要元件是无规则卷曲(孟红恩等，
2014)。对克隆得到的小蓬金属硫蛋白 NeMT2 进行
生物信息学分析表明，NeMT2 蛋白二级结构的主要
成分是无规则卷曲，预测其二级结构中较少形成 α-
螺旋和 β-折叠的肽段。张艳等(2006)认为 MT 分
子中不含 α-螺旋和 β-折叠肽段，但存在一种很坚固
的构象，本研究的预测与该文献相符。另外，NeMT2
蛋白中共含有 14个 Cys残基，占该蛋白总氨基酸的
17．9%，这些 Cys 残基主要分布在肽链的 N 端和 C
端。本研究同源序列比对表明，不同来源的植物金
209 广 西 植 物 36卷
图 6 小蓬金属硫蛋白 NeMT2系统进化树分析
标尺在左下方，Bootstap = 1 000。
Fig． 6 Phylogenetic tree analysis of metallothionein NeMT2
from Nanophyton erinaceum The scale was at the bottom-left，
and the bootstrap values based on 1 000 replicates were indicated．
图 7 小蓬金属硫蛋白 NeMT2疏水性分析
Fig． 7 Hydrophobicity profile of metallothionein
NeMT2 from Nanophyton erinaceum
属硫蛋白两端序列的同源性很高，而中部同源性低，
Cys残基都集中分布在肽链的 N 端和 C 端，可见 N
端和 C端序列对金属硫蛋白的结构和功能的重要
性。金属硫蛋白基因结构典型的特征是 Cys含量高
(Hamer，1986)。该结构也是金属硫蛋白对重金属
胁迫应答的结构基础(刘瑜等，2011;Liu et al，2016)。
金属硫蛋白与生物体内的多种生理功能相关，
其最为主要的功能就是解除重金属离子的毒害作
用，提高植物的重金属耐性。金属硫蛋白富含 Cys
残基，肽链中巯基(SH)含量高因而导致其对重金属
的亲和力高，该蛋白可以螯合 Cu、Zn、Pb 等 18 种重
金属，所以金属硫蛋白在解除重金属毒害方面起着
重要作用(赵之伟等，2013)。龙葵的金属硫蛋白
MTS基因家族已被证明涉及重金属铬、铜的解毒
(Fidalgo et al，2013;Teixeira et al，2013)。植物金
属硫蛋白两端富含 Cys 的区域在中间区的帮助下相
互接近，与金属离子结合形成一个结构域(Jordi et
al，2006;孟红恩等，2014)。在植物对 Zn2+和 Cu2+的
解毒过程中，金属硫蛋白是通过巯基与金属离子结
合，从而降低重金属离子的毒性(Nathalie et al，
2001)。但到目前为止，金属硫蛋白参与植物重金
属解毒的作用机理仍不十分清楚。
植物金属硫蛋白基因的表达具有可诱导性。植
物金属硫蛋白基因的表达受金属离子、高盐、干旱、
低温、热激等不同环境因子的影响(全先庆等，
2006;张艳等，2007)。目前研究最多的是植物金属
硫蛋白基因对重金属的胁迫响应。Kumar et al
(2012)研究发现，藜科植物海蓬子在高盐、高温和
干旱胁迫处理下，金属硫蛋白基因 SbMT-2 表达量
增加;而受冷胁迫处理后，该基因的表达量明显下
降，说明 SbMT-2 基因可能在提高海蓬子抵御逆境
方面发挥了重要作用。转基因及基因敲除技术已广
泛用于金属硫蛋白的功能研究，结果证实金属硫蛋
白不但能降低重金属对植物的毒害，还能提高植物
的耐受性(Brkljacic et al，2004;赵之伟等，2013)。
Turchi et al(2012)发现，转入菜豌豆金属硫蛋白
MTA1基因的白杨，对重金属锌和铜的抗性显著提
高;转金属硫蛋白 MT 基因的矮牵牛对铅的抗性及
吸收能力明显增强(李伟等，2001);转木豆 MT1 基
因的拟南芥植株，对重金属 Cu2+和 Cd2+的抗性明显
提高(Sekhar et al，2011)。在拟南芥中表达 MT4a
基因提高了铜胁迫下植物的金属耐性，使植物体中
铜的积累量增加(Ｒodríguez-Llorente et al，2010)。
植物金属硫蛋白既受重金属离子诱导又有重金属解
毒的作用，该蛋白可以作为一种重金属污染生物标
志物(陈春等，2009)。
新疆阿勒泰富蕴县铜矿区和非铜矿区土壤重金
属 Cu含量分别为 4 035．65和 1 100．09 mg·kg-1(前
期研究结果)。本研究利用 ＲT-PCＲ 对小蓬 NeMT2
基因的表达进行分析，发现 NeMT2 基因在铜矿区小
蓬叶片的表达量明显高于非铜矿区。可见，NeMT2
基因的表达随着重金属 Cu 含量的不同表现出明显
3098期 葛风伟等:小蓬 NeMT2基因的克隆及其植物表达载体的构建
图 8 小蓬金属硫蛋白 NeMT2的二级结构预测
Fig． 8 The secondary structures predication of metallothionein NeMT2 from Nanophyton erinaceum
图 9 小蓬 NeMT2基因的 ＲT-PCＲ表达分析 M． 分子
量标记 DL 2 000;1． NeMT2基因(非铜矿区);2． NeMT2基因
(铜矿区);3． Actin基因(非铜矿区);4． Actin基因(铜矿区)。
Fig． 9 ＲT-PCＲ expression analysis of NeMT2 from Nanophyton
erinaceum M． Marker DL 2 000;1． NeMT2 gene (nor-mining area);
2． NeMT2 gene (mining area);3． Actin gene (nor-mining
area);4． Actin gene (mining area)．
的变化，暗示该基因有可能参与小蓬对重金属 Cu
胁迫的应答过程。鉴于此，该基因可作为培育抗重
金属转基因植物的优良基因。当然，该基因参与小
蓬重金属胁迫应答的分子机理还有待于更深入的研
究。小蓬金属硫蛋白基因 NeMT2 的克隆与表达载
体的构建，将为进一步研究该基因的功能奠定基础。
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图 10 Escherichia coli DH5a中的载体 pCAMBIA1300+
NeMT2的酶切验证 M． DNA分子量标记;1． pCAMBIA1300+
NeMT2重组质粒;2． pCAMBIA1300+NeMT2重组质粒
BamH I单酶切产物;3． pCAMBIA1300+NeMT2
重组质粒 BamH I和 Pst I双酶切产物。
Fig． 10 Identification by restriction of vector pCAMBIA1300+
NeMT2 in Escherichia coli DH5a M． DNA Marker;1． Plasmid of
pCAMBIA1300+NeMT2;2． Plasmid of pCAMBIA1300+NeMT2 digestion
with BamH I;3． Plasmid of pCAMBIA1300+NeMT2
digestion with both BamH I and Pst I．
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