全 文 ：书第 44卷 第 12期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol．44 No．12
2016年 12月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Dec． 2016
1)贵州省国际科技合作计划［黔科合外 G字(2013)7010号］。
第一作者简介:刘济明，男，1963年 6月生，贵州大学林学院，教
授。E－mail:karst0623@ 163．com。
收稿日期:2016年 6月 26日。
责任编辑:潘 华。
小蓬竹植物内生真菌多样性1)
刘济明 柳嘉佳 颜强 熊雪 李丽霞 骆畅
(贵州大学，贵阳，550025) (贵州省社会科学院) (贵州大学)
摘 要 以喀斯特地区特有濒危物种小蓬竹(Drepanostachyum luodianense Keng f．)为研究对象，采用组织块分
离法分离内生真菌，结合形态学特征与分子生物学鉴定的方法对分离到的菌株进行鉴定。研究其内生真菌的多样
性，研究结果表明:从 180 个供试组织块中分离得到 105 株内生真菌，可划分为 19 个属，31 种(含 2 个可能的新
种)，相似度为 95%～100%。在属的分类水平上，以节菱孢霉属(Arthrinium)、镰刀菌属(Fusarium)、木霉属(Tri-
choderma)、炭角菌属(Xylaria)为优势菌属，分别占菌株总数量的 12．38%和 9．52%、6．67%、6．67%。小蓬竹内生真
菌 Shannon－Wiener多样性指数(H)为 2．800，Simpson指数(D)为 0．932，均匀度指数(E)为 0．604，且在不同组织部
位中小蓬竹内生真菌多样性也存在一定差异。Jaccard 指数与 Sorenson 指数变化趋势一致，均为根茎的相似性最
低，茎叶的相似性最高，而根和叶的居于两者之间。
关键词 小蓬竹;内生真菌;多样性
分类号 Q938．1
Diversity of Endophytic Fungal from Drepanostachyum luodianense / /Liu Jiming，Liu Jiajia(Guizhou Uniersity，Guiy-
ang 550025，P． Ｒ． China);Yan Qiang(Guizhou Provincial Academy of Social Science) ;Xiong Xue，Li Lixia，Luo
Chang(Guizhou Uniersity)/ / Journal of Northeast Forestry University，2016，44(12) :71－75，90．
We studied on Endophytic Fungal diversity of Drepanostachyum luodianense，which is unique endangered species of
Karst area． Endophytic fungal were isolated by tissue isolation method and identified to species and gene level based on
morphological characteristics and molecular analysis for cultivation，protection，exploit of D． luodianense and ecological
restoration of vegetation in karst area． By statistics，105 strains of Endophytic Fungal were isolated from the 180 tested tis-
sues，and were divided into 19 genus，31 strains (maybe including 2 species)． Their homologies ranged in 95%－100%．
In the genus classification level，Arthrinium mortierella accounted for 12．38%，Fusarium for 9．52%，Trichoderma for 6．67%，
and Genus xylaria for 6．80%，and they were the dominant species． The Shannon-Wiener index (H)was 2．800，Simpson
index (D)was 0．932，and evenness index (E)was 0．604，and there was difference for diversity of Endophytic Fungal
from D． luodianense in different plant part． The variation tendency of Jaccard index and Sorenson index were consistent，the
highest homologies were in root and stem，the lowest in leaf and stem，and root and leaf were in between．
Keywords Drepanostachyum luodianense;Endophytic fungal;Diversity
植物内生真菌是指那些在其生活史的一定阶
段，或全部阶段生活于健康植物各组织和器官内的
真菌［1－3］。目前，国内外部分学者深入研究了部分
植物内生真菌的组成和分布［4－7］。由于植物内生真
菌具有丰富的多样性，所以要针对不同植物进行内
生真菌多样性研究［8－9］。同时，要不断深入研究和
分析同一植物不同季节和组织部位内生真菌的多样
性［10－11］，进一步比较和探讨不同宿主植物组织间动
态变化，对于丰富真菌的物种以及增强宿主植物的
生长、抗逆性和修复作用都具有重要意义［12－13］。目
前，关于小蓬竹内生真菌多样性的研究尚未见报道。
本文通过对小蓬竹不同组织部位可培养内生真菌数
量及菌群结构的研究，探明小蓬竹内生真菌多样性，
以期对小蓬竹的引种栽培和保护与利用以及喀斯特
地区植被和生态恢复提供理论依据与科学支撑。同
时，也为认识内生真菌的生态学功能，内生真菌与宿
主的关系以及竹类植物内生真菌资源的开发利用提
供参考和科学依据。
1 材料与方法
1．1 样本采集
供试植株取自于小蓬竹典型自然分布地———贵
州罗甸县董架乡董架村打鸟槽处，属于典型的南
亚热带季风气候，年平均气温 18．6 ℃，年降水量在
1 200 mm 左右，土壤为典型的喀斯特石灰土，土壤
肥力较高。
沿等高线分别设置 5 个样地(5 m×5 m) ，调查
样地内小蓬竹选取 3 点进行土壤因子调查，各样方
随机选取 10株，整丛挖出后，筛选出色泽鲜艳、健康
的植株，将植株分为根茎叶，茎分为上中下 3 部分，
分别取样分装并编号，用装有冰袋的取样箱带回。
1．2 培养基
25%双抗 PDA培养基:马铃薯 50 g，琼脂 4 g，葡
萄糖 4 g，定容至 1 000 mL，pH 自然，150 mg /L 庆大
霉素和 100 mg /L青霉素。
双抗竹秆煎汁琼脂培养基:竹秆 200．0 g，葡萄
糖 20．0 g，琼脂 20．0 g。蒸馏水 1 000 mL，pH 自然，
150 mg /L庆大霉素和 100 mg /L青霉素。
标准培养基:美国 BD(Difco)公司生产的标准
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.2016.12.035
PDA(Potato dextrose agar)。
1．3 小蓬竹内生真菌分离
采用组织块分离法对内生真菌进行分离培养，
用无菌刀片削去组织块两端，切成 4 mm×4 mm×3
mm的组织块，然后分别接于 25%双抗 PDA 培养基
上，每个优化后的平板上 6 个琼脂块各接 1 个组织
块，每种处理重复 10 个，根茎叶各 60 组织块，转到
真菌培养箱，26 ℃恒温培养。用接种针挑取菌丝尖
端部分转接至新的 PDA 培养基上，纯化 2 ～ 3 次后
直至获得单一菌种。采用斜面保藏方法，在斜面上
将待保藏菌株接入，编号后置于培养箱 26 ℃培养
4～7 d，待菌株生长旺盛后，置于冰箱中 4 ℃保藏备
用，定期检查［14］。采用组织印迹法、漂洗液洗涂布
法、空白平板对照法三类检测方法配合，综合检测消
毒效果，最大程度确保分离的菌是植物组织的内生
真菌［15－17］。
1．4 小蓬竹内生真菌分子生物学鉴定
内生真菌 DNA的提取、PCＲ 扩增和序列测定:
采用购买的生物工程(上海)股份有限公司 Ezup 柱
式真菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取，对 PCＲ 扩增
后的产物采用 PCＲ 产物纯化试剂盒 Kit Ver． 2． 0
(TaKaＲa)进行纯化，然后采用 1%琼脂糖凝胶(含
0．5 mg /L溴化乙锭)电泳检测 DNA的质量。
PCＲ扩增产物采用真菌通用引物，其序列为:
ITS1－ F(5 － CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA － 3)、
ITS4－Ｒ(5－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3)。PCＲ
反应体系(50 μL) :PCＲ Master Mix 25 μL，DNA模板
1 μL;ITS1－F 2 μL，ITS4－Ｒ 2 μL;双蒸水补足 50 μL。
PCＲ反应条件为:94 ℃预变性 2 min后进行 34个循
环，每个循环包括 94 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1
min，循环结束后 72 ℃延伸 8 min，4 ℃保存。用 1%
的琼脂糖凝胶(含 0．5 mg /L 溴化乙锭)电泳进行检
测，并拍照。
内生真菌 ITS 序列的比对:所获序列由英潍捷
基(上海)贸易有限公司 Invitrogen 测序后，将测序
结果提交 NCBI 的 GenBank 数据库，进行同源序列
搜索(BLAST search) ，选择与目的序列最相近的真
实可靠的菌种序列作参考，使用 Clustal X－2．0 软件
进行匹配排列，用 MEGA 6 构建邻接 Neighbor－Join-
ing分析方法进行系统发育分析。
1．5 数据统计与处理
采用分离率(IＲ)、分离频率(IF)衡量植物组织
中内生真菌的丰富程度，比较判断优势菌群，同时采
用 Shannon－Wiener 指数(H)、Simpson 指数(D)、均
匀度指数(J)分析小蓬竹内生真菌的多样性特征，
用相似性系数(CS)和 Jaccard(C j)分析不同组织或
样本中内生真菌种类组成的相似程度。
H= －∑
s
i= 1
Pi lnPi， (1)
D=∑P2i， (2)
J= －∑
s
i= 1
Pi lnPi / lsS， (3)
CS = 2j /(a+b)， (4)
CJ = j /(a+b－j)。 (5)
式(1)、(2)、(3)中:Pi 是第 i种的比例多度，S 为物
种总数目。
式(4)、(5)中:j为两个组织或样本共同具有的内生
真菌种类数，a、b 分别为每个组织或样本中的内生
真菌种类数。
2 结果与分析
2．1 内生真菌的组成
试验采用组织块分离法从 180个供试小蓬竹组
织块(根、茎和叶各 60块)中分离内生真菌，共有 85
块被内生真菌侵染(见表 1) ，其中根 44 块，茎 21
块，叶 20块。共计从中分离得到 105 株内生真菌，
其中从根中分离出 63株，茎中 14株，叶中 28株。其
中根中内生真菌的分离频率最高，达到 60%;茎和叶
中分离到的内生真菌分别占总菌株数的 13．33%和
26．67%。在根组织中，共有 63株菌，分布于 17 个菌
属，其中镰刀菌属与漆斑菌属的分离频率最高，均占
总菌株数的 7．62%;茎中有 14 株菌 6 个属，分布比
较均，拟茎点霉属、弯孢聚壳属等为优势菌属，占总
菌株数的 1．90%;叶片中，28 株菌分布于 9 个属，节
菱孢霉属分离频率为 7．62%，为优势菌属。
2．2 内生真菌的 ITS－rDNA序列分析及系统发育树
的建立
基于 ITS 序列 BLAST 分析将所分离到的 105
株菌株归属为 19个属，31种(含 2个可能的新种) ，
通过进行 BLAST search 并与数据库中序列相近的
菌种进行比对(见表 2) ，发现该 105 株菌株的序列
同源性都较大，都达到了 95% ～100%。再将获取的
不同基因型的菌株采用 MEGA6．0 构建(Neighbor－
Joining)系统进化树(见图 1)。
分离到的 105株真菌均属于子囊菌门(Ascomy-
cota)的盘菌亚门(Pezizomycotina) ，在纲的分类水平
上，以粪壳菌纲(Sordariomycetes)优势菌群占菌株总
数的 85．71%，散囊菌纲(Eurotiomycetes)占菌株总数
的 5． 71%，座囊菌纲(Dothideomycetes)、锤舌菌纲
(Leotiomycetes)与丝孢子菌纲(Hyphomycetes)分别
仅占菌株总数的 4．76%、1．90%;从目的分类水平上
共有 10个分类单元，以炭角菌目(Xylariales)、肉座
27 东 北 林 业 大 学 学 报 第 44卷
菌目(Hypo Creales)为优势菌群，分别占菌株总数的
24．76%和 25．71%;在科的分类水平上，共有 17个分
类单元，以丛赤壳科(Nectriaceae)、梨孢假壳科(Ap-
iosporaceae)为优势菌群，分别占总菌株数的 9．52%、
12．38%;在属的分类水平上，共有 19 个分类单元，
以节菱孢霉属(Arthrinium)、镰刀菌属(Fusarium)、
木霉属(Trichoderma)、炭角菌属(Xylaria)为优势菌
属，分别占菌株总数的 12．38%和 9．52%、6．67%。结
果表明:小蓬竹植株中具有丰富的真菌物种多样性。
表 1 不同组织内内生真菌菌群的组成及分离频率
编号 菌属名称
根
菌株数
量 /个
分离频
率 /%
茎
菌株数
量 /个
分离频
率 /%
叶
菌株数
量 /个
分离频
率 /%
总数
量 /个
相对频
率 /%
1 Myrmecridium 6 5．71 0 0 0 0 6 5．71
2 暗球腔菌属(Phaeosphaeriaceae) 2 1．90 0 0 0 0 2 1．90
3 暗双孢属(Cordana) 4 3．81 0 0 0 0 4 3．81
4 半壳霉属 Ｒhytismataceae 1 0．95 2 1．90 0 0 3 2．86
5 刺盘孢属(Mitosporic glomerellaceae) 0 0．00 2 1．90 2 1．90 4 3．81
6 单胞瓶霉属(Phialemonium) 2 1．90 0 0 0 0 2 1．90
7 稻镰状瓶霉属(Harpophora) 7 6．67 0 0 0 0 7 6．67
8 节菱孢霉属(Arthrinium) 5 4．76 0 0 8 7．62 13 12．38
9 镰刀菌属(Fusarium) 8 7．62 0 0 2 1．90 10 9．52
10 脉孢菌属(Neurospora) 3 2．86 2 1．90 1 0．95 6 5．71
11 毛壳菌属(Chaetomium) 2 1．90 1 0．95 3 2．86 6 5．71
12 木霉属(Trichoderma) 4 3．81 1 0．95 2 1．90 7 6．67
13 拟茎点霉属(Mitosporic valsaceae) 2 1．90 2 1．90 2 1．90 6 5．71
14 漆斑菌属(Myrothecium) 8 7．62 0 0 0 0 8 7．62
15 曲霉属(Aspergillus) 0 0 2 1．90 0 0 2 1．90
16 肉座菌属(Hyp℃ rea) 2 1．90 0 0 0 0 2 1．90
17 炭角菌属(Xylaria) 1 0．95 0 0 6 5．71 7 6．67
18 弯孢聚壳属(Eutypella) 4 3．81 2 1．90 0 0 6 5．71
19 须壳孢属(Cucurbitariaceae) 2 1．90 0 0 2 1．90 4 1．94
合 计 63 60 14 13．33 28 26．67 105 1
表 2 基于 ITS序列 BLAST分析和形态学特征推断内生真菌的分类单元
类 群 代表菌株 菌株数量 /个 NCBI中最相近菌种(登录号) 序列相似性 /% 覆盖比率 /%
须壳孢属(Sghaeropsidales) LDDLFG001 1 Pyren℃ haeta sp． 3121(GQ895137．1) 99 100
节菱孢霉属(Arthrinium) LDDLFG002 1 Arthrinium sp． Wb558(AF455414．1) 100 99
LDDLFG021 1 Arthrinium sp． LH11(HQ832842．1) 100 100
LDDLFG018 9 Arthrinium arundinis(KP689169．1) 100 100
弯孢聚壳属(Eutypella) LDDLFG003 1 Eutypella sp． B1A0817P15CC416(JQ411317．1) 99 100
LDDLFJ004 1 Uncultured fungus(KC506256．1) 99 100
刺盘孢属(Colletotrichum) LDDLFJ006 1 Colletotrichum gloeosporioides(KM513606．1) 100 100
LDDLFY011 1 Colletotrichum gloeosporioides(KJ801795．1) 99 100
LDDLFG017 1 Colletotrichum gloeosporioides(EF622204．1) 100 100
似炭角菌属(Xylaria) LDDLFG007 1 Xylariales sp． Ki71H(GQ923981．1) 99 100
炭角菌属(Xylaria) LDDLFY024 1 Xylaria sp． SOF11(JF703668．1) 99 97
LDDLFY029 1 Xylaria sp． C－2(AB741610．1) 99 100
拟茎点霉属(Phomopsas spp．) LDDLFG008 1 Phomopsis sp． M23－2(HM595506．1) 96 100
漆斑菌属(Myrothecium) LDDLFG009 3 Myrothecium verrucaria(HQ607996．1) 99 99
LDDLFG041 1 Myrothecium verrucaria(HQ607996．1) 100 99
半壳霉属(Leptostroma) LDDLFJ010 1 Leptostroma sp． 20_2* (KC354586．1) 100 93
镰刀菌属(Fusarium) LDDLFG012 1 Fusarium oxysporum(KM268673．1) 100 99
LDDLFG013 1 Fusarium oxysporum(KP050556．1) 100 99
LDDLFG014 1 Fusarium oxysporum(KM282627．1) 100 100
LDDLFG023 1 Fusarium sp． WF150(HQ130706．1) 99 98
LDDLFG037 1 Fusarium sp． LMG201(KJ598872．1) 100 100
LDDLFG040 1 Fusarium redolens(EF495234．1) 99 100
LDDLFY042 1 Fusarium poae(AB587024．1) 100 100
LDDLFG043 1 Fusarium oxysporum(LN626919．1) 100 100
LDDLFG047 1 Fusarium sp． C_1_BESC_294z(KC007281．1) 99 100
单胞瓶霉属真菌(Phialemonium) LDDLFG019 1 Phialemonium sp． NＲＲL 54513(JN093262．1) 100 99
脉孢菌属(Neurospora) LDDLFG020 1 Neurospora sp． 3396(FJ527871．1) 100 100
疑似须壳孢属(Cucurbitariaceae) LDDLFG022 1 Fungal sp． NIS2(KF910768．1) 100 100
37第 12期 刘济明，等:小蓬竹植物内生真菌多样性
续(表 2)
类 群 代表菌株 菌株数量 /个 NCBI中最相近菌种(登录号) 序列相似性 /% 覆盖比率 /%
镰状瓶霉属(Harpophora) LDDLFG025 1 Harpophora oryzae(EU636699．1) 96 98
LDDLFG036 1 Harpophora oryzae(EU636699．1) 98 95
LDDLFG045 1 Harpophora oryzae(EU636699．1) 95 98
曲霉属(Aspergillus) LDDLFJ026 1 Aspergillus versicolor(AY373883．1) 100 100
毛壳菌属(Chaetomium) LDDLFY027 1 Chaetomium funicola(EF017204．1) 99 100
肉座菌属(Hypocrea) LDDLFG038 1 Hyp℃ rea nigricans(JN943369．1) 99 100
木霉属(Trichoderma) LDDLFG046 1 Trichoderma rossicum(LDDLFG046) 99 99
暗双孢属(Cordana) LDDLFG048 1 Cordana terrestris(KF733463．1) 99 97
暗球腔菌属(Phaeosphaeriacea) LDDLFG049 1 Setophoma terrestris(KF494170．1) 99 99
Myrmecridium属 LDDLFG005 1 Myrmecridium sp． TMS－2011(HQ631062．1) 100 99
LDDLFG044 1 Myrmecridium sp． TMS－2011(HQ631062．1) 100 100
图 1 邻接法构建 ITS序列的系统进化树
47 东 北 林 业 大 学 学 报 第 44卷
2．3 不同组织内生真菌分布多样性及相似性
从多样性指数来看，小蓬竹内生真菌多样性指
数(H)、Simpson指数(D)依次为 2．800、0．932，均匀
度指数(E)为 0．604。但在不同组织中小蓬竹内生
真菌多样性也存在一定差异。总的来看，在多样性
指数方面，Shannon－Wiener 和 Simpson 指数在不同
组织中的变化趋势一致，均为根最高，茎其次，叶片
最低。茎的均匀度指数(E)最高，为 0．775，叶的最
低为 0．597(见表 3)。结果表明，小蓬竹植株中存在
大量的内生真菌，并且根中内生真菌数量和种群多
样性远高于叶和茎内。
表 3 小蓬竹根、茎、叶内生真菌多样性指数
参 数 根 茎 叶 总数
多样性指数(H) 2．652±0．22 2．045±0．19 1．989±0．17 2．800
Simpson指数(D) 0．919±0．03 0．867±0．06 0．834±0．07 0．932
均匀度指数(E) 0．640±0．02 0．775±0．05 0．597±0．06 0．604
表 4对不同组织中内生真菌菌群的相似性比较
发现:Jaccard 指数与 Sorenson 指数变化趋势一致，
均为根茎的相似性最低，茎叶的相似性最高，而根
和叶的居于两者之间。此外，Jaccard 指数都不大
于 0．5，Sorenson指数稍大于 0．5(见表 4) ，这表明小
蓬竹的内生真菌菌群各组织间差异是适中的，虽具
有一定的相似性，但相似性不高，各组织中分布的内
生真菌各有其特点。
表 4 小蓬竹内生真菌菌群相似性系数比较
组织 根 茎 叶
根 0．353 0．444
茎 0．522 0．500
叶 0．615 0．667
注:表中对角线以上为 Jaccard指数，以下为 Sorenson指数。
3 结论与讨论
本研究明确了喀斯特地区的小蓬竹内生真菌的
组成结构，粪壳菌纲(Sordariomycetes)为优势菌群，
可分为 19属，其中以节菱孢霉属(Arthrinium)、镰刀
菌属(Fusarium)、木霉属(Trichoderma)、炭角菌属
(Xylaria)为优势菌属。这与有关竹类真菌分类鉴
定方面的研究基本相符［18－19］。考虑竹类的生物特
性，普遍被认为其内生真菌的腐生性较强、或为潜伏
性病原菌菌属，为排除相关干扰，所采集的样本全部
来自完全没有受到伤害或感染病害健康植株，并且
实验采用组织印迹法、漂洗液洗涂布法、空白平板对
照法三类检测方法配合，综合检测消毒效果，确保分
离的菌是植物组织的内生真菌。因此，一些常见植
物病原菌和腐生菌菌群，却是在健康小蓬竹植物中
普遍大量存在。主要是因为真菌与宿主两者间互作
用的结果随着环境因子(气候、土壤性质等)、宿主
种类和生理状态、真菌基因型的变化都可能改
变［20］。一方面，对于同一菌株对不同植株而言，随
着环境条件和宿主生理状况的改变，菌类的基因型
极易发生突变，可能由致病菌的偏利共生，甚至寄生
变为互惠共生，从而表现出不同的生活方式。致病
性炭疽菌(Colletotrichum)的突变株可以定殖在葫芦
科植物如西瓜和南瓜上，表现出如抗病、促进生长和
抗旱等偏利共生或互惠共生的生活方式［21］。另一
方面，有些内生真菌属于潜在性病原菌，在宿主抵抗
力下降或者某一生长阶段才表现出致病性。此外，
特定的环境条件，内生真菌包括炭疽菌、镰刀菌和拟
茎点霉等［22－23］可能发挥腐生菌的功能，产生腐生菌
相似的细胞降解酶［24］。综上研究表明，小蓬竹内生
真菌的组成与种类与其喀斯特石漠化特殊生境有密
不可分的关系。
小蓬竹不同组织中内生真菌的数量、种类及分
布存在显著性差异，这体现了内生真菌的组织偏好
性和特异性，可能是由于不同部位的结构成分不同、
生长年限不同、富含的营养物质不完全相同，以及真
菌在土壤与空气中传播机制的不同造成的［25］。综
合来看，根部分离到的内生真菌数量种类最多、多样
性指数最高，叶片其次，茎中最少的但分布均匀。这
与孙丽等［26］的新疆阿魏、陈立军等［27］油菜的内生
真菌的分离鉴定结果相符。同时与小蓬竹其地下茎
合轴型，一年生与多年生根部混生，竹秆在地面密集
丛生的生物特性关系密切:一方面由于很多源自土
壤的内生真菌从根部侵入向上扩展，再入侵到茎部;
另外雨水飞溅、空气流动也使叶片接触到微生物的
机会也比茎部相对更多。此外，在喀斯特相对贫瘠
的土壤上，根中所含的营养物质比茎、叶丰富也是不
可忽视的因素。
参 考 文 献
［1］ 刘济明．喀斯特适生植物小蓬竹研究Ⅰ［M］．贵阳:贵阳人民出
版社，2010:95－109．
［2］ CAＲＲOLL G． Fungal endophytes in stems and leaves:fromlatent
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