全 文 ：书DOI:10. 13429 / j. cnki. cjcr. 2014. 09. 001
基金项目:国家自然科学基金项目 (81173473);山西省自
然科学基金项目 (2010011048-2);山西医科大
学青年基金 (02201128，02201124);太原市科
技项目人才专项明星专题 (120247-08)
通讯作者:杨官娥，E-mail:yangguane@ aliyun. com
·论 著·
沼泽红假单胞菌生物转化北桑寄生
提取物初步研究
邓欢欢， 耿子英， 闫鸿宇， 吴晓敏， 杨官娥
山西医科大学药学院，山西 太原 030001
摘要:目的 观察沼泽红假单胞菌生物转化北桑寄生提取物转化前后化学成分的变化及化学成分随培养时间变
化的特点。方法 将北桑寄生提取物与沼泽红假单胞菌共同培养，然后利用高效液相色谱法(HPLC)分析经过沼
泽红假单胞菌生物转化后北桑寄生化学成分的变化。结果 经沼泽红假单胞菌生物转化后北桑寄生提取物的化
学成分发生了很大变化。总的规律为转化液上清液中成分减少，沉淀中成分增加，生成了至少 4 种新的代谢产物，
并且成分随培养时间的变化而变化，20 d时基本达到稳定。结论 沼泽红假单胞菌可以对北桑寄生提取物中成分
进行生物转化，转化规律为水溶性化合物(转化液上清液中成分)转化为脂溶性化合物(转化液沉淀中成分)，这为
沼泽红假单胞菌生物转化北桑寄生的进一步研究提供参考。
关键词:北桑寄生;光合细菌;沼泽红假单胞菌;生物转化
中图分类号:Ｒ 284 文献标识码:A 文章编号:1674 － 8182(2014)09 － 1033 － 05
Biotransformation research of Loranthus tanakae
extract by Ｒhodopseudanonas palustris
DENG Huan-huan，GENG Zi-ying，YAN Hong-yu，WU Xiao-min，YANG Guan-e
School of Pharmacy，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
Corresponding author:YANG Guan-e，E-mail:yangguane@ aliyun. com
Abstract:Objective To observe the changes of chemical component of Loranthus tanakae extract before and after
biotransformation by Ｒhodopseudanonas palustris and the characteristics of its changing along with culture time．Methods
Loranthus tanakae extract and Ｒhodopseudanonas palustris were cultured together，and then the changes of chemical
component of Loranthus tanakae after biotransformation by Ｒhodopseudanonas palustris were analyzed by high performance
liquid chromatography(HPLC)． Ｒesults The chemical components of Loranthus tanakae extract changed greatly after
biotransformation by Ｒhodopseudanonas palustris． The general rule was that the composition in supernatant of conversion
liquid reduced;the composition in precipitation of conversion liquid increased;four new metabolic products at least
appeared，and its components changed along with the culture time and basically achieved stability at 20-day． Conclusions
The Ｒhodopseudanonas palustris can conduct biotransformation to the components of Loranthus tanakae extract． The law of
transformation is that water soluble compounds(supernatant composition in conversion liquid)are transformed into fat
soluble compounds(precipitation composition in conversion liquid)． This biotransformation lays a foundation for further
research on the biotransformation of Loranthus tanakae by Ｒhodopseudanonas palustris．
Key words:Loranthus tanakae;Photosynthetic bacteria;Ｒhodopseudanonas palustris;Biotransformation
微生物转化天然药物是利用其自身丰富的酶系
统对外源化合物进行酶催化反应［1 － 2］，以增加天然产
物结构多样性，提高生物活性或改变理化性质［3 － 4］。
光合细菌是地球上最古老的生物之一，在自然界的碳
素循环和物质转化中起着重要作用，已被应用于微生
物转化中［5 － 7］。沼泽红假单胞菌(Ｒhodopseudanonas
palustris)为光合细菌中的一种。
北桑寄生(Loranthus tanakae Franch． et Sav．)系
桑寄生科桑寄生属植物北桑寄生的带叶茎枝，寄生于
栎属、榆属、李属、桦属等植物上［8］。有强筋骨、祛风
湿、降血压等效用［9］。本文研究沼泽红假单胞菌生
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物转化北桑寄生提取物转化前后化学成份的变化，以
及化学成分随培养时间变化的特点，为沼泽红假单胞
菌生物转化北桑寄生的进一步研究提供参考。
1 材料与方法
1． 1 主要仪器 AＲ1140 电子天平(奥斯豪国际贸
易有限公司)，KDM型可调温控电热套(山东鄄城华
鲁电热仪器有限公司)，KQ3200E 型超声波清洗器
(昆山市超声仪器有限公司)，DL-5-B 低速离心机
(上海安亭科学仪器厂)，SHB-DIII 型循环水式多用
真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，ＲE-52AA 型旋
转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，YXQ． SG． 41． 280
手提式压力蒸汽灭菌锅(上海华线医用仪器公司)，
超净工作台(上海新苗医疗器械有限公司)，D101 型
大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司)，日本岛
津 LC-10ATvp高效液相色谱仪及 Diamonsil C18(2)
色谱柱(250 × 4． 6 mm，Dikma Technologies)
1． 2 试剂与材料 甲醇(色谱醇，天津市科密欧化
学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学
试剂有限公司)，磷酸(分析纯，天津市星月化工有限
公司)，其余试剂均为分析纯。沼泽红假单胞菌系光
合细菌紫色非硫菌群红假单胞菌属的沼泽红假单胞
菌(Ｒ． palustris)，由山西大学光合细菌研究室分离鉴
定保存。北桑寄生，于 2010 年 10 月初采自山西省晋
城市历山，由山西医科大学药学院白云娥教授鉴定为
北桑寄生。标本保存于山西医科大学药学院中药学
教研室。
1． 3 培养基 常规培养基:乙酸钠 1 640 mg，酵母膏
1 000 mg，CaCl2·2H2O 75 mg，EDTA 20 mg，K2HPO4
900 mg，KH2PO4 600 mg，MgSO4·7H2O 200 mg，FeSO4
·7H2O 11． 8 mg，(NH4)2SO4 1 320 mg，微量元素
1 ml，去离子水定容至 1 L，pH值 7． 0。分装于 100 ml
血清瓶，1 × 105 Pa灭菌 25 min。北桑寄生培养基:称
取北桑寄生粉末适量，加入 7 倍量 50%甲醇，浸泡
30 min，超声提取 2次，每次 30 min，离心(4 000 r /min，
5 min)，合并上清液，上清液蒸至无醇味，用去离子水
稀释至北桑寄生原药材浓度 20 g /100 ml，加入全量
常规培养基各组分，调 pH 值至 8． 0，分装于 100 ml
培养瓶，120 ～ 125 ℃，1 × 105 Pa 灭菌 25 min，得北
桑寄生培养基。
1． 4 方法 (1)沼泽红假单胞菌的活化:实验用器
皿均经高温灭菌消毒，取常规培养基，无菌条件下接
入 1 /10 体积沼泽红假单胞菌菌种，光照厌氧培养，培
养温度 30 ℃，光照强度 2 500 lux，培养 3 d后得到活
化的沼泽红假单胞菌菌种。(2)沼泽红假单胞菌生
物转化北桑寄生培养液的制备:取北桑寄生培养基
3 份，无菌条件下分别接入 1 /10 体积活化后的沼泽
红假单胞菌，(30 ± 2)℃光照厌氧培养，光照强度
2 500 lux，分别培养 3、5、20 d得培养不同时间的沼泽
红假单胞菌生物转化北桑寄生培养液(PSBT3d、
PSBT5d、PSBT20d)。(3)北桑寄生对照液的制备:取
北桑寄生培养基 1 份，无菌条件下接入 1 /10 体积灭
菌后的蒸馏水，(30 ± 2)℃光照厌氧培养，光照强度
2 500 lux，培养 20 d 得北桑寄生对照液(MIS)。
(4)样品处理:按实验设计培养天数后收集样品，
5 000 r /min离心 30 min，上清液定容至150 ml，过大
孔吸附树脂，用 3 个柱体积蒸馏水冲洗后，用 3 个柱
体积甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，减压蒸干，用适量甲
醇溶解，定容至 10 ml 为上清液供试品。取沉淀，加
入甲醇，超声萃取 3 次，合并萃取液，减压蒸干，用适
量甲醇溶解，定容至 10 L 为沉淀供试品。精密移取
上清液供试品、沉淀供试品各 1 ml，分别放置于 10 ml
容量瓶中，用甲醇定容至刻度，0． 45 μm 微孔滤膜过
滤，即得各供试品溶液。(5)色谱条件:色谱柱为
Diamonsil C18(2)(250 × 4． 6 mm，Dikma Technolo-
gies) ;检测波长 280 nm;流速 0． 8 ml /min;柱温
26 ℃;进样量 20 μl;流动相:A 为乙腈，B 为水(含
0. 1%磷酸)。流动相梯度条件:0、15、25、35、60、75、
85、100、115 min 时，乙腈含量分别为 5%、10%、
15%、19%、30%、45%、80%、100%、100%，水(含
0. 1% 磷酸)含量分别为 95%、90%、85%、81%、
70%、55%、20%、0%、0%。
2 结 果
2． 1 主要变化峰的标定 经过对所有样品与对照液
的分析，选取样品上清液和沉淀共 11 个成分作为主
要变化峰(图 1)。本课题组前期已对北桑寄生原药
材的指纹图谱及化学成分进行了研究［10 － 11］，其中成
分 3 为槲皮素-3-鼠李糖苷，成分 6 为鼠李素-3-鼠李
糖苷，成分 7 为鼠李柠檬素-3-鼠李糖苷。
2． 2 高效液相色谱法(HPLC)分析结果
2． 2． 1 上清液样品 HPLC 图 2 为沼泽红假单胞菌
生物转化北桑寄生 PSBT(3、5、20 d)和北桑寄生对照
MIS的上清液样品溶液液相色谱图及其中变化成分
的折线图。由图 2 可知，成分 3、成分 6、成分 7 含量
与对照液相比 3 d时开始降低，分别降低了 28． 47%、
32． 58%、66． 77%，5 d 时分别降低了 70． 31%、
65. 69%、95． 11%，20 d 时分别降低了 94． 40%、
97. 00%、99. 76%。由折线图可知，0 ～ 3 d 的降低速
率最大，3 ～ 5d的降低速率其次，5 ～ 20 d的降低速
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注:峰 3 为槲皮素-3-鼠李糖苷，峰 6 为鼠李素-3-鼠李糖苷，峰 7 为鼠李柠檬素-3-鼠李糖苷;Supernatant MIS、Precipitation MIS 分别为北桑寄生对照
上清液、沉淀样品液相色谱图，Supernatant PSBT、Precipitation PSBT分别为沼泽红假单胞菌生物转化北桑寄生(培养20 d时)上清液、沉淀样品液相
色谱图。
图 1 上清液、沉淀样品液相色谱图
注:Precipitation MIS为北桑寄生对照沉淀液相色谱图，Precipitation PSBT(3、5、20 d)分别为沼泽红假单胞菌生物转化北桑寄生(培养 3、5、20 d时)
沉淀液相色谱图;折线图中，0 为北桑寄生对照液，3、5、20 分别为培养天数为 3、5、20 d时沼泽红假单胞菌生物转化北桑寄生培养液。
图 2 上清液样品溶液液相色谱图及其中变化成分折线图
率最小。成分 4 含量在 3 d 时与对照组相比无明显
变化，5 d时降低了 72． 07%，20 d时降低了 97． 64%，
由折线图可知，3 ～ 5 d 的降低速率最大，5 ～ 20 d 的
降低速率其次;其他成分 0 ～ 20 d无明显变化。
2． 2． 2 沉淀样品 HPLC 图 3 为沼泽红假单胞菌生
物转化北桑寄生 PSBT(3、5、20 d)和北桑寄生对照
MIS的沉淀样品溶液液相色谱图及其中变化成分的
折线图。由图 3 可知，成分 5、成分 8、成分 9、成分 10
为新产生成分，其中成分 5、成分 9、成分 10 在 3 d 时
就已生成，且随培养时间的延长，含量逐渐增加，如果
以 20 d 的峰面积为标准计算，3 d 时分别完成
30. 51%、79． 50%、82． 05%的转化，5 d 时分别完成
67． 53%、87． 02%、98． 26%的转化，成分 8 在 3 d 以
后开始生成，5 d完成 99． 94%的转化，基本达到最大
量。由其中变化成分的折线图可知，成分 5 在 3 ～ 5 d
的增加速率最大，0 ～ 3 d 增加速率其次，5 ～ 20 d 的
增加速率最小;成分 9、成分 10 在0 ～ 3 d 的增加速率
最大，3 ～ 5 d 的增加速率其次，5 ～ 20 d 的增加速率
最小;成分 8 在 3 d 以后开始生成，3 ～ 5 d 增加速率
最大，5 ～ 20 d无明显变化;成分 6、成分 7 为原北桑
寄生中已知成分，培养液沉淀中的量与对照液相比含
量明显增加。成分 6 转化 5 d时含量为最大，为对照
液上清液成分 6 的 20． 55%;成分 7 转化 3 d 时含量
达到最大，为对照液上清液成分 7 的 22． 26%。由其
中变化成分的折线图可知，成分 6 在 0 ～ 3 d 与 3 ～
5 d增加的速率相近，5 ～ 20 d含量有所降低但仍比对
照液含量高;成分 7 在 0 ～ 3 d 含量增加速率较大，但
3 ～ 5 d与 5 ～ 20 d含量有所降低，且 3 ～ 5 d含量降低
的速率明显大于5 ～ 20 d 含量降低的速率;其他成分
0 ～ 20 d无明显变化。
2． 2． 3 成分 6 和成分 7 总量的分析 因上清液和沉
淀均有成分 6 和成分 7，为了进一步分析成分 6 和成
分 7 是否为沼泽红假单胞菌生物转化的底物，对转化
液中上清液和沉淀中成分6、成分7的总量与对照液
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注:Supernatant MIS为北桑寄生对照上清液液相色谱图，Supernatant PSBT(3、5、20 d)分别为沼泽红假单胞菌生物转化北桑寄生(培养 3、5、
20 d时)上清液液相色谱图;折线图中，0 为北桑寄生对照液，3、5、20 分别为培养天数为 3、5、20 d时沼泽红假单胞菌生物转化北桑寄生培养液。
图 3 沉淀样品溶液液相色谱图和其中变化成分折线图
注:0 为北桑寄生对照液，3、5、20 分别为培养 3、5、20 d时沼泽红假单胞菌生物转化北桑寄生培养液。
图 4 成分 6、成分 7 总含量变化折线图
中上清液和沉淀中成分 6、成分 7 的总量进行比较。
由图 4 可知，转化液中成分 6、成分 7 的总含量在 3 d
时就明显低于对照液，随培养时间的变化而逐渐降
低，说明成分 6、成分 7 作为底物参与了沼泽红假单
胞菌的生物转化。
3 讨 论
经沼泽红假单胞菌生物转化后北桑寄生的化学
成分发生了很大的变化。上清液中成分 3、成分 4、成
分 6、成分 7 与对照液相比在 0 ～ 20 d 间含量逐渐降
低，20 d 时分别降低了 94． 40%、97． 64%、97． 00%、
99． 76%，即 20 d时北桑寄生提取液中成分的转化基
本完成。且成分 3、成分 4、成分 6、成分 7 为沼泽红
假单胞菌转化的底物。
下层沉淀萃取液中有 4 个新成分形成，分别为成
分 5、成分 8、成分 9、成分 10，其中成分 5、成分 9、成
分 10 在 3 d时就已生成，且含量随着培养天数的增
加而逐渐增加;成分 8 在 3 d以后开始生成，5 d 时达
到最大。成分 6、成分 7 为原北桑寄生中已知成分，
沉淀中成分 6、成分 7 含量先增加后降低，但总的含
量仍高于对照液。
通过对上清液和沉淀中成分 6 和成分 7 的总量
分析表明，转化 20 d后成分 6 的总量由 100%降低到
19． 68%，成分 7 的总量由 100%降低到 12． 48%，进
一步证明成分 6、成分 7 是沼泽红假单胞菌转化的底
物。推测成分 6、成分 7 可能通过被沼泽红假单胞菌
吸附或通过细胞壁进入细胞成为沉淀中成分，并被沼
泽红假单胞菌转化成新成分，亦可能成分 6、成分 7
在溶液中被沼泽红假单胞菌释放入细胞外液中的酶
转化，成为沉淀中新成分。具体转化途径及转化得到
新成分的结构需要进一步分离鉴定或 LC-MS 进一步
研究。
北桑寄生提取物中成分作为底物被沼泽红假单
胞菌转化，并且生成了新的代谢产物。但并非所有的
化学成分都发生了变化，说明北桑寄生中并非所有的
化学成分都参与了沼泽红假单胞菌的生物转化。改
变培养天数，北桑寄生上清液各化学成分含量降低顺
序和降低的量并不相同，且新成分的生成也有先后顺
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序，说明沼泽红假单胞菌生物转化北桑寄生各化学成
分并不是在同一时间进行的，存在一定的先后顺序。
总的趋势为沼泽红假单胞菌转化北桑寄生培养液中
上清液水溶性成分转化成为沉淀中成分，即水溶性降
低。转化生成的新成分的结构、具体规律及参与酶的
确定，将在后续实验中继续研究。
本研究为进一步研究沼泽红假单胞菌对北桑寄
生的生物转化奠定了基础，也为光合细菌在其他中药
生物转化中的应用奠定了基础。
参考文献
［1］ 朱晓松，程东庆．天然药物的微生物转化研究进展［J］． 国际中
医中药杂志，2011，33(8):740 － 742．
［2］ Loughlin WA． Biotransformations in organic synthesis［J］． Biore-
source Technology，2000，74(1) :49 － 62．
［3］ Yang GE，Zhang Z，Bai H，et al． Biotransformation of beta-amyrinac-
etate by Ｒhodobacter sphaeroides［J］． J Biosci Bioeng，2008，105
(5) :558 － 561．
［4］ Wang Y，Sun Y，Wang C，et al． Biotransformation of 11-keto-β-bo-
swellic acid by Cunninghamella blakesleana［J］． Phytochemistry，
2013，96:330 － 336．
［5］ Aruoma OI，Deiana M，Ｒosa A，et al． Assessment of the ability of the
antioxidant cocktail-derived from fermentation of plants with effective
microorganisms(EM-X)to modulate oxidative damage in the kidney
and liver of rats in vivo:studies upon the profile of poly-and mono-
unsaturated fatty acids［J］． Toxicol Lett，2002，135(3) :209 － 217．
［6］ 刘桂敏，赵秀梅，张肖洪． HPLC 法测定康强胶囊中人参皂苷
Ｒg1 的含量［J］．中草药，2001，32(9):800 － 801．
［7］ 胡旭光，臧建伟，唐春萍，等． 六味地黄汤生物制剂对肾阴虚小
鼠脾 T 淋巴细胞亚群的影响［J］． 时珍国医国药，2008，19(5):
1033 － 1034．
［8］ 许宁宁，白云娥，薛强强，等． 北桑寄生化学成分系统预实验
［J］．中国药物与临床，2012，12(6):762 － 763．
［9］ Kim YK，Kim YS，Choi SU，et al． Isolation of flavonol rhamnosides
from Loranthus tanakae and cytotoxic effect of them on human tumor
cell lines［J］． Arch Pharm Ｒes，2004，27(1) :44 － 47．
［10］ 袁庆芳，赵春梅，张忠鹏，等． 槲寄生药材的高效液相色谱指纹
图谱研究［J］．分析科学学报，2011，27(1):16 － 20．
［11］ 许宁宁．北桑寄生生药学与化学成分及槲寄生生药学研究［D］．
太原:山西医科大学，2012．
收稿日期:2014 － 04 － 28 修回日期:2014 － 05 － 20 编辑:
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