全 文 ： 收稿日期：2007-11-13
基金项目：广东省自然科学基金项目（003062）资助
作者简介：龙海涛(1979-)，男，湖南邵阳人，助教，硕士，从事生化与分子生物学研究。
注：李玲为通讯作者。

根癌农杆菌介导蓝猪耳转化的影响因素研究
龙海涛，李洪清，李 玲
(华南师范大学生命科学学院 广东省植物发育生物工程重点实验室，广东 广州 510631)

摘 要：研究了根癌农杆菌介导蓝猪耳转化的影响因子。结果表明，以蓝色花类型蓝猪耳 5～6 周的叶片为外
植体，在OD600为0.5～0.6的活化菌液中浸染5～10min，暗培养4d后，在愈伤组织诱导培养基(MS + BA 1.0mg/L
+ 2,4-D 0.1mg/L)上生长 14d，获得抗性愈伤组织；经芽诱导培养基(1/2MS + BA 1.0mg/L + NAA 0.1mg/L)培
养 28d 得到抗性芽；生根培养基(1/2MS)上培养 14d 得到抗性植株。经 PCR 检测证实外源基因已整合到
蓝猪耳基因组中，转化率达 13%～14%。Cef 和 Hyg 浓度对转化影响较大，转化的不同阶段其适宜浓度不同。
关键词：蓝猪耳；根癌农杆菌；转化；影响因子
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2008)02-0017-04

Optimization of Agrobacterium-mediated Transformation System for
Torenia fournieri
LONG Hai-tao, LI Hong-qing, LI Ling
(Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Science, South China Normal University,
Guangzhou 510631, Guangdong China)

Abstract: An efficient and stable Agrobacterium-mediated transformation system for Torenia was
established through investigating the factors influencing the transformation efficiency. Genetic
transformation of Torenia was performed by using 5~6 week leaflet as explants. After incubation in
Agrobacterium suspension of OD600 at 0.5~0.6 for 5~10min, the explants were co-cultivated on
co-culture medium containing 200μmol/L acetosyringone for 4d under dark. The explants were then
transferred to the calla induction agar medium MS + BA 1.0mg/L + 2,4-D 0.1mg/L, and cultivated
for 14d to obtain the resistant calla. The resistant calla were transferred to the shoot induction agar
medium 1/2MS + BA 1.0mg/L + NAA 0.1mg/L, and cultured for another 28d to obtain resistant
shoots. The 0.5cm or taller resistant shoots were finally transferred to rooting agar medium, and the
resistant plantlets were achieved after 14d cultivation. Hygromycin- resistant plants were confirmed
to be positive transformants by PCR. The transformation frequency was up to 13%～14% overall.
Key words：Torenia fournieri; Agrobacterium tumefacien; transformation; factor

蓝猪耳（Torenia fournieri）属玄参科蓝猪耳属，生长周期短，但盛花期较长，是热带亚热带地区
重要的一年生观赏花卉植物；同时因具有特殊的裸露胚囊[1]，也是植物细胞分化、花器官发育和授粉
受精研究的模式植物[2,3]。蓝猪耳遗传转化体系的研究已有不少报道[4,5]，但有关叶片遗传转化影响因素
的研究较缺乏。本文探讨了蓝猪耳外植体状况、抗生素和叶再生体系等因子对遗传转化的影响，旨在
建立较稳定的高效转化体系，为蓝猪耳基因工程理论研究和生产应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与培养基
以蓝猪耳叶片为外植体，参照李梅兰等[6]方法再生培养，叶诱导愈伤组织培养基: MS + BA 1.0mg/L

2008,37(2):17-20.
Subtropical Plant Science
第 37 卷 ﹒18﹒
+ 2,4-D 0.1mg/L；愈伤组织与叶诱导芽培养基均为1/2MS + BA 1.0mg/L + NAA 0.1mg/L。转化时诱导培
养基（液体1/2MS）和共培养基含有200μmol/L乙酰丁香酮（AS），选择培养基与生根培养基（1/2MS）
含有15mg/L潮霉素（Hyg）和500mg/L头孢霉素（Cef）。
1.2 农杆菌菌株及转化
农杆菌菌株为EHA101，质粒为pAHCL(本室自存)，其T-DNA区含有潮霉素抗性(Hyg- )基因，用于
筛选。EHA101于诱导培养基活化至OD600为0.5～0.6，浸染5mm无菌苗叶片5～10min，置于共培养基25℃
暗培养4d。选择培养温度为25℃，光照强度800μmol/m2·s，光照16h/d。愈伤组织选择培养2周后统计抗
性愈伤组织频率（抗性愈伤组织数/浸染时所用外植体数×100%）和农杆菌复发率（农杆菌复发的外植
体数/浸染时所用外植体数×100%）；芽选择培养3周后统计抗性芽频率（抗性芽数/浸染时所用外植体
数×100%）；取0.5cm抗性芽转入生根培养基，筛选2周生根植株为抗性植株，统计分化率（抗性植株
数/浸染时所用外植体数×100%）。所有数据为3次独立试验平均值。
1.3 转化植株 PCR 检测
PCR 扩增反应条件为：94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，37 个循环，最后 72℃延伸 10min。
以非转化蓝猪耳和质粒 pAHCL 分别作为阴性和阳性对照。扩增片段为 T-DNA 区域潮霉素抗性基因的
片段（375bp），引物序列为：Hph1：5-GCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGG-3，Hph2：5-CGCATAACA
GCGCTCATTGACTGGAGC-3。统计抗性植株转化率（PCR 检测阳性的株系数/浸染外植体数×100%）。
2 结果与分析
2.1 叶片再生途径对转化的影响
比较不同再生途径对蓝猪耳转化率的影响，发现愈伤组织途径抗性芽频率和分化率高于不定芽途
径（表 1），可能由于在愈伤组织途径中，
外植体脱分化形成愈伤组织过程使其对
农杆菌的敏感性增加，从而有利于农杆
菌的遗传转化。根据这一结果，以下实
验采用愈伤组织再生途径进行转化。
2.2 叶龄对抗性芽频率的影响
实验表明，3～4 周和 5～6 周的叶片用根癌农杆菌转化后，抗性芽频率和分化率较高，8 周叶片较
低，2 周叶片的抗性芽频率和分化率最低
（表 2）。2 周叶片外植体在（含 500mg/L
Cef）培养过程中，对菌液浸染的忍耐性
较差，外植体农杆菌复发率达 25.1%，
生长发育受到抑制，愈伤组织和芽诱导
时间较长且芽体生长缓慢；8 周以上叶片
在选择培养中，68.2%外植体出现褐化，
同时分生能力极弱，形成的抗性愈伤组
织极少，分化率仅 2.6%。故随后实验以
5～6 周的叶片为材料。
2.3 不同花色蓝猪耳对转化的影响
分别以蓝色花类型和红色花类型的蓝猪耳叶片用根癌农杆菌转化，发现蓝色花类型的蓝猪耳的抗
性愈伤组织频率远高于红色花类型，其抗性芽频率和分化率也高（表 3）。故后面实验材料取蓝色花类
型叶片。
2.4 抗生素对转化的影响
将共培养后的叶片外植体分别置于含 300、400、500、600mg/L Cef 选择培养基上转化，结果发现
表 1 叶片不同再生途径对转化的影响
再生途径 抗性愈伤组织频率(%) 抗性芽频率(%) 分化率(%)
愈伤组织途径 20.6 16.3 5.6
不定芽途径 － 9.3 3.1
注：“－”表示无此再生过程。
表 2 不同年龄叶片外植体对转化的影响
叶龄 抗性愈伤组织频率(%) 抗性芽频率(%) 分化率(%)
2 周 6.0 1.3 0.3
3～4 周 14.1 11.0 4.3
5～6 周 25.6 20.6 7.6
8 周 6.3 3.6 2.6
表 3 不同花色蓝猪耳对转化的影响
花色 抗性愈伤组织频率(%) 抗性芽频率(%) 分化率(%)
蓝色 30.6 25.3 8.6
红色 19.3 14.2 5.0
第 2 期 龙海涛,等：根癌农杆菌介导蓝猪耳转化的影响因素研究 ﹒19﹒
农杆菌复发率分别为 81.2%、13.2%、4.6%、1.6%，400mg/L Cef 基本能抑制农杆菌的生长。Cef 浓度
越高，越不利外植体的分化和生长，同时随着培养时间的延长，外植体农杆菌将减少。实验发现在诱
导愈伤组织时期 Cef 浓度为 500mg/L，在诱导芽时期浓度 Cef 降为 400mg/L，比 Cef 浓度不变（500mg/L）
的分化率略高（分别为 10.7%和 8.6%）。
将共培养的外植体置于含 10、12、15、18mg/L 的 Hyg 选择培养基上诱导抗性芽，结果表明，12、
15mg/L Hyg 转化效果较好，分化率分别达 6.6%和 10.7%（表 4）。
当选择培养基 Hyg 浓度为 10mg/L 时，其芽体转移到含 15mg/L Hyg 生根培养基上培养，2 周后所
有植株死亡，分化率为 0，可能假阳性植株对阳性植株的分化和生长存在竞争抑制，其过度分化和生长
抑制了阳性植株的分化和生长（表 4）。
当选择培养基 Hyg 浓度为 18mg/L，外
植体的分生能力受到抑制，愈伤组织、
芽体数少且生长极慢，整个诱导时间
比 15mg/L Hyg 的延长 2 周左右。
适当增加或降低 Hyg 浓度，可缩短芽体的诱导时间，促进芽的生长速度，提高转化率。在诱导愈
伤组织时期，以 12mg/L Hyg 浓度作为选择压，形成抗性愈伤组织后，无选择压培养基培养 7d，在含
15mg/L Hyg 的培养基生长 21d，分化率达 13.2%。
2.5 转化植株 PCR 检测
对 50 株生根的抗性植株进行 PCR 检测，均能扩
增出潮霉素抗性基因的一段 375bp 特异带，而非转化
植株未扩增出目的片段，部分结果如图 1 所示，阳性
率达 100%，证明基因已整合到蓝猪耳基因组中，同
时说明 15mg/L Hyg 和 500mg/L Cef 生根培养 2 周的
筛选方式可以有效筛选转基因植株，上述统计分化率
的方法能反应转化效果。
2.6 适宜转化条件
以蓝色花类型 5～6 周的叶片为外植体，取 OD600
为 0.5～0.6 活化的菌液浸染 5～10min。共培养基 MS
+ BA 1.0mg/L + 2,4-D 0.1mg/L + AS 200μmol/L 暗培
养 4d；在含 500mg/L Cef、12mg/L Hyg 愈伤组织诱
导培养基 MS + BA 1.0mg/L + 2,4-D 0.1mg/L 上生长 14d，获得抗性愈伤组织（图 2a）；在含 400mg/L Cef
芽诱导培养基 1/2MS + BA 1.0mg/L + NAA 0.1mg/L 上培养 7d，转入含 400mg/L Cef、15mg/L Hyg
的芽诱导培养基生长 21d，获得抗性芽（图 2b）；切取芽体转入 500mg/L Cef、15mg/L Hyg 生根
培养基 1/2MS 中培养 14d，得到抗性植株（图 2c、d）。转化率达 13%～14%。
表 4 诱导芽培养基不同浓度 Hyg 对转化的影响
浓度(mg/L) 抗性愈伤组织频率(%) 抗性芽频率(%) 分化率(%)
10 90.1 85.6 0
12 50.6 39.3 6.6
15 31.0 25.6 10.7
18 3.3 2.6 1.3
750bp
2000bp
1000bp
500bp
250bp
M 1 2 3 4 5 6 7
图 1 转基因蓝猪耳抗性植株 PCR 检测
注：M. DL2000 DNA Marker；1.pAHCL；
2.非转基因植株；3~7.转基因抗性植株
图2 农杆菌介导蓝猪耳的转化
a.抗性愈伤诱导; b.抗性芽体诱导; c.抗性植株生根筛选; d.抗性植株

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3 讨 论
不同植物的外植体及同一器官不同发育阶段的外植体对农杆菌浸染的敏感性不同，因此，外植体的
来源影响着转化效率。陈丙春等[6]研究表明，茎段的转化芽诱导率要高于叶盘；李梅兰等[7]认为，叶片
是蓝猪耳再生培养最佳的外植体。本实验证实，用5～6周龄叶片外植体转化效果较好；叶龄2～4周叶
片对农杆菌的忍耐性较差，对于500mg/L Cef仍出现农杆菌复发的情况，因此必需提高Cef浓度，但Cef
对抗性芽的生长有抑制作用，并会增大外植体的褐化率，对遗传转化不利；8周以上叶片在转化过程中，
外植体褐化严重，存在分化受抑制的现象，始终处于“儡化”状态，愈伤组织和芽的分化时间长，转化
率较低。5～6周龄叶片外植体是转化的最佳材料。
一般认为，基因型的特异性与细胞的生理状态有关，具体来说与细胞受伤后的生理反应(分泌酚类
化合物，增强 T-DNA 转移)、内源激素水平(影响细胞生长和分化)及细胞壁结构(影响细菌对外植体的
吸附)等有关。在莴苣、拟南芥、马铃薯的转化中，基因型的差异表现甚至大于菌种的差异[8]。因此，
在转化之前需选择适宜的植物基因型。本实验证实，蓝色花类型的蓝猪耳转化率高于红色花类型，蓝
色花类型更易于蓝猪耳的遗传转化。
抑菌抗生素能抑制农杆菌生长，同时对植物组织也有一定的毒害作用，因此筛选出适宜的抗生素
浓度，抑制农杆菌生长，有利于提高转化效率。陈丙春等[6]认为400mg/L的Kan是叶盘的最佳筛选浓度，
李梅兰等[7]认为500mg/L Cef有利于叶盘的遗传转化。本实验表明，400mg/L Cef基本能抑制农杆菌的生
长。诱导愈伤组织时期Cef浓度为500mg/L，诱导芽时期浓度Cef降为400mg/L，比Cef浓度不变（500mg/L）
的分化率略高，更有利于蓝猪耳的遗传转化。择抗生素具有抑制非转化细胞分化生长的作用，其浓度
过低，转化的细胞和非转化细胞在生长发育过程中存在竞争，会导致大量非转化细胞生长，同时抑制
转化细胞生长；而过高浓度抗生素在抑制非转化细胞生长的同时，也抑制转化细胞生长，使得抗性愈
伤组织（芽）的分化生长时间延迟，分化数量减少，大大降低转化率。此外，选择方式也很重要，主
要的两种选择方式，一是先再生后选择，即在愈伤组织诱导或不定芽分化过程中加入较低选择压，获
得较多愈伤组织、不定芽或再生植株后，再于选择培养基中进行转化体筛选，此方式最大的缺陷是嵌
合体严重，假转化体多，后期选择纯化困难；二是先选择后再生，即在愈伤组织诱导或不定芽分化培
养一开始就加入较高选择压，使非转化细胞的生长受到抑制，而转化细胞能正常生长。本实验在含
12mg/L Hyg的培养基中诱导抗性愈伤组织，培养14d后，诱导出的愈伤组织转入无Hyg的诱导培养基，
愈伤组织生长状态好转，同时能分化出新的愈伤组织，以使抗性细胞尽可能分化（非抗性细胞分化也
增加），培养7d左右，再转入含15mg/L Hyg的诱导芽培养基增大筛选力度，抑制已分化的非抗性细胞生
长，甚至使其逐步死亡，从而提高转化效率。
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