全 文 ：红锥、白椎、大叶栎 3 个树种分子鉴定及亲缘关系的 ISSR分析
刘海龙1，2，3，陈晓明1，2，3，覃子海1，2，3，杨开太1，2，3，林建新1，2，3，黄金使1，2，3
(1．广西壮族自治区林业科学研究院，广西南宁 530002;2．国家林业局中南速生材繁育实验室，广西南宁 530002;3． 广西优良用材林资源培育重
点实验室，广西南宁 530002)
摘要 ［目的］进行红锥、白椎、大叶栎 3个树种的分子鉴定研究。［方法］利用 ISSR-PCR方法构建红锥(Castanopsis hystrix)、白椎(Cas-
tanopsis carlesii Hayata)、大叶栎(Quercus griffithii Hook)3个树种的 DNA指纹图谱，根据各个体的 Nei氏遗传距离矩阵，利用 UPGMA法
进行聚类分析。［结果］从 50个 ISSR引物中筛选出 6个多态性引物用于 ISSR-PCR扩增，共扩增出 86条不同 DNA带，平均每个引物扩
增的 DNA带的数目为 10． 75条，多态性条带数目为 53条，占总条带数的 61． 2%。其中，有 5个引物可扩增出差异条带和特异条带，能准
确地鉴定上述 3个树种。应用 DPS软件计算供试材料的遗传距离界于 0． 166 67 ～0． 809 52之间，平均为 0． 563 57。［结论］ISSR-PCR方
法可以解决红锥、白锥、大叶栎的鉴定问题。
关键词 壳斗科;红锥;白椎;大叶栎;ISSR;指纹图谱
中图分类号 S718． 46 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)30 －18419 －02
Molecular Identification of Castanopsis hystrix，Castanopsis carlesii and Quercus griffithii Using ISSR-PCR Method
LIU Hai-long et al (Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute，Nanning，Guangxi 530002)
Abstract ［Objective］This research aimed to develop molecular identification method for Castanopsis hystrix，Castanopsis carlesii and Quercus
griffithii． ［Method］DNA fingerprints of C． hystrix，C． carlesii and Q． griffithii were established using ISSR-PCR method． Cluster Analysis was
carried out using UPGMA method based on Nei’s genetic distances among each individual． ［Result］Six polymorphic primers were selected from
50 ISSR primers for ISSR-PCR amplification，and totally 86 discernible DNA bands were amplified with 53 polymorphic bands，accounting for
61． 2% of the total． The average number of DNA bands amplified by each primer was 10． 75． Specifically，totally 5 primers had amplified differ-
ential bands and specific bands，which were able to accurately identify C． hystrix，C． carlesii and Q． griffithii． As calculated by DPS v3． 01 soft-
ware，the genetic distances among test materials were ranged from 0． 166 67 to 0． 809 52，with an average of 0． 563 57． ［Conclusion］ISSR-PCR
method can be used to identify C． hystrix，C． carlesii and Q． griffithii effectively．
Key words Fagaceae;C． hystrix;C． carlesii;Q． griffithii;ISSR;DNA fingerprint
基金项目 广西林科院基本业务费项目“红锥群体遗传学研究”(林科
200901)。
作者简介 刘海龙(1980 － ) ，男，湖北大悟人，工程师，博士研究生，从
事林木生物技术研究，E-mail:lhl － hb @ sohu． com。
收稿日期 2011-09-22
红锥(Castanopsis hystrix)和白椎(C． carlesii Hayata)皆
为壳斗科(Fagaceae)锥属(Castanopsis)植物，大叶栎(Quercus
griffithii Hook)为壳斗科(Fagaceae)栎属(Quercus)植物。红
锥和白椎很难根据形态标准将其鉴别开来［1 －3］。笔者利用
ISSR分析技术对红锥、白椎、大叶栎进行研究，根据筛选出的
分辨率高和重复性好的引物构建红锥及白椎的 DNA指纹图
谱，以便为其鉴定提供准确快捷的方法;大叶栎从形态上明
显有别于红锥、白椎，将其作为外类群，研究三者的遗传
关系。
1 材料与方法
1． 1 材料 供试 3种树种均采自广西(表 1)。
1． 2 方法
1． 2． 1 基因组 DNA提取。采集植株的幼嫩叶片，用硅胶充
分干燥。取 0． 1 g样品，用 Fasprep(Bio101，USA)粉碎，采用
改良 CTAB法［4］提取总 DNA，1． 0%琼脂糖电泳检测 DNA质
量，根据紫外吸收法估计 DNA的浓度和纯度。
1． 2． 2 ISSR反应体系及其 PCR 扩增。ISSR 引物是根据加
拿大 British Columbia大学公布的序列设计，由上海生工生物
工程技术服务有限公司合成。其反应体系经过优化确定为
25 μl体系，其中含约 60 ng 模板 DNA，1． 25 U Taq 酶，1． 5
mmol /L MgCl2，0． 25 mmol /L dNTPs，0． 3 μmol /L引物。PCR
扩增条件:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 1 min，52 ℃复性
45 s，72 ℃延伸 2 min，45个循环;72 ℃延伸 5 min。PCR产
物在含有 EB的 2%琼脂糖凝胶中电泳检测，以 100 bp Mark-
er (GeneRuler 100 ladder，Fermentas UAB，Inc．)作为标准分
子量对照，以 EPSON (Japan)紫外自动成像仪拍照记录。
1． 2． 3 DNA指纹图谱的建立。用 FR980电泳图象分析系统
(复日科技)计算扩增片段的分子量，扩增位点的命名由所用
引物和条带分子量来确定［5］。电泳图谱的每条带(DNA 片
段)均为 1 个分子标记(Marker) ，代表 1 个引物结合位点。
根据各分子标记的迁移率及其有无统计所有的二元数据，有
带(显性)记作 1，无带(隐性)记为 0，强带和弱带均赋值，根
据 0、1矩阵建立 3个树种的 DNA指纹图谱。采用 DPSv3． 01
版本软件对统计结果进行 UPGMA分析［6］，构建系统聚类分
析树状图。
表 1 供试材料
Table 1 Test plant materials for ISSR analysis
种
Plant species
样品编号
Individual code
采集地点
Locality
红锥 H1 广西浦北
Castanopsis hystrix H2 广西浦北
H3 广西博白
H4 广西博白
H5 广西东兰
白椎 C1 广西南宁
C． carlesii Hayata C2 广西南宁
C3 广西南宁
C4 广西南宁
C5 广西南宁
大叶栎 G1 广西苍梧
Quercus griffithii Hook
2 结果与分析
2． 1 引物筛选和 ISSR-PCR扩增结果 从 50 个 ISSR引物
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(30):18419 － 18420，18450 责任编辑 朱琼琼 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.30.233
中筛选出 6个扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于
ISSR-PCR 反应，分别为 UBC836、UBC873、UBC876、UBC879、
UBC900和 UBC853。结果显示:6 个引物对所有样品进行
PCR扩增，共扩增得到 86 条 DNA 不同的条带，其中多态性
条带 53条，占总条带数的 61． 2%;平均每个引物扩增的 DNA
条带数目为 10． 75 条;对红锥、白锥和大叶栎扩增得到的条
带数分别为 71、69和 49条(图 1)。
注:H1 ～ H5、C1 ～ C5 和 G1 为供试个体代码;M 表示 100 bp
DHA Ladder;箭头所指为特异性条带。
Note:H1 ～ H5，C1 ～ C5，G1:individual codes listed in Table 1;
M:100 bp DNA Marker;the arrows indicated the specific
bands．
图 1 用引物UBC873、UBC853对红锥、白锥和大叶栎进行 ISSR-
PCR分析
Fig． 1 ISSR-PCR profiles of C． hystrix，C． carlesii and Q． grif-
fithii using primer UBC873，UBC853
2． 2 红锥、白锥和大叶栎 3种植物的 DNA指纹图谱 ISSR
分析表明，5个引物扩增得到的 DNA 指纹图谱能检测到种
间差异性的特征条带(表 2)。例如，引物 UBC873 在大叶栎
中扩增出分子量为 510 bp的特征条带，在白锥中扩增出分子
量为 460 bp的特征条带。而在红锥中则无特异性谱带。因
此，引物UBC873能将红锥、白锥和大叶栎三者区分开。同样
引物UBC836、UBC876、UBC879和UBC900也可单独区分这3
个树种。因此，可以利用上述 5个引物扩增的 3种植物 DNA
电泳谱带作为种间鉴定的指纹图谱。引物 UBC853 在对红
锥和白锥的基因组 DNA 进行扩增时，并未扩增出能显示红
锥和白锥种间差异性的特征条带，因此，该引物只能将大叶
栎与红锥、白锥区分开来，而不能区分出红锥和白锥。
2． 3 供试材料的遗传距离 通过 ISSR检测，获得86 ×11的
多态位点矩阵，据此计算 Nei氏遗传距离。结果表明，11 个
样品之间遗传距离的变异范围在 0． 166 67 ～ 0． 809 52 之间，
平均为 0． 611 185;白锥个体 C2和 C3之间的遗传距离最近，
为 0． 166 67;其次为红锥 2个个体 H3和 H4之间，遗传距离
为 0． 225 81;大叶栎个体 G1与白锥个体 C3之间遗传距离最
远，为 0． 809 52;其次大叶栎个体 G1与白锥个体 C2 之间，遗
传距离为 0． 789 47。
2． 4 供试材料的聚类分析 根据各个体的 Nei 氏遗传距离
矩阵，利用 UPGMA法进行聚类分析。从图 2 可以看出，11
个供试材料在树状图上聚为 3 支，分别为红锥、白椎、大叶
栎。其中，广西浦北的 2个红锥个体 H1 和 H2 聚在一起，广
西博白的2个红锥个体H3和H4聚在一起，它们再与广西东
兰的红锥个体 H5聚在一起，证明取自于不同地点的红锥个
体间产生了一定程度的遗传变异。此外，由树状图可知，红
锥与大叶栎的遗传距离比红锥与白锥之间更近。原因可能
有 2点:①材料的选择难以完全覆盖 3 个树种的遗传背景;
②分析方法的差异造成聚类不够完全。
表 2 红锥、白锥和大叶栎的 DNA指纹图谱比较(部分)
Table 2 Comparison on DNA fingerprints of C． hystrix，C． carlesii
and Q． griffithii (excerpt)
序号
No
标记编号
ISSR primer
红锥
Castanopsis
hystrix
白锥
Castanopsis
carlesii
大叶栎
Quercus
griffithii
1 UBC873-510 － － +
2 UBC873-460 － + －
3 UBC873-640 + － +
4 UBC853-1070 + + －
5 UBC853-1280 + + －
6 UBC853-540 － － +
7 UBC900-1800 + － －
8 UBC900-1600 + － －
9 UBC900-810 + － －
10 UBC900-490 + + －
11 UBC900-470 + + －
12 UBC879-1700 + + －
13 UBC879-1200 + － －
14 UBC879-250 － + +
15 UBC879-230 － － +
16 UBC836-630 + － －
17 UBC836-530 － + －
18 UBC836-470 + － －
19 UBC836-300 + － －
20 UBC876-740 + + －
21 UBC876-570 + + －
22 UBC876-330 － + －
注:“+”表示存在该条带;“－”表示该条带不存在。
Note:“+”indicated band existing;“－”indicated band not existing．
图 2 红锥、白锥和大叶栎间的 ISSR 遗传关系聚类分析结果
(UPGMA)
Fig． 2 Dendrogram for ISSR genetic relationship among C． hys-
trix，C． carlesii and Q． griffithii (UPGMA)
3 结论
根据植物化学成分，栎属介于锥属与柯属之间。根据木
材解剖形态，锥属较接近于栗属，柯属较接近于栎属，但锥、
柯、栎 3属之间都有一些种有彼此互相重叠的现象或过渡
型［7］。这说明锥属和栎属之间确实有很近的亲缘关系。从
外形上看，大叶栎的叶形、树干等均与红锥和白锥有较明显
的区别，而红锥与白锥之间的形态区别则不明显，该研究中，
用 ISSR-PCR方法可较容易的区分红锥与白锥。同时，该研
究还初步证明了取自于不同地点的红锥个体间产生了一定
程度的遗传变异。笔者所在红锥课题组正在进行全国居群
和广西居群的红锥遗传多样性分析，其研究结果将更清晰的
(下转第 18450页)
02481 安徽农业科学 2011 年
素对产量的贡献大小，并清楚它们之间的相互作用。分析结
果(表 4)表明，对实际产量直接贡献最大的是有效穗数，通
径系数为 0． 556 5，主要是通过空秕率产生的间接作用;而空
秕率对实际产量有较强的负直接效应，通径系数为
－0． 814 0;株高对产量的直接作用也是负效应(－ 0． 239 2) ，
但它们通过有效穗数和空秕率产生的间接作用是不容忽视
的。千粒重对产量的直接作用的通径系数只有 －0． 120 5，是
因为被其通过空秕率产生的间接作用所抵消。剩余通径为
0． 065 81，其他因素对产量所起的作用较小。这说明水稻分
蘖和抽穗灌浆期的气象条件对水稻产量影响较大，即在水稻
生产中有效穗数多、控制水稻株高以及减少空秕率有利于提
高水稻产量。
图 2 播种期与产量的关系
Fig． 2 The relationship between sowing date and yield
表 4 经济性状对实际产量的通径系数
Table 4 The path coefficients between economic characteristics and the
actual output
因子
Factors
直接
Direct →X1 →X4 →X5 →X6
X1 0． 556 5 0． 347 6 －0． 027 5 －0． 195 5
X4 －0． 814 0 －0． 237 6 －0． 045 3 0． 161 9
X5 －0． 120 5 0． 127 2 －0． 305 9 －0． 012 1
X6 －0． 239 2 0． 454 8 0． 551 1 －0． 006 1
注:决定系数 =0． 995 67;剩余通径系数 = 0． 065 81;X1、X2、X3、X4、X5
和 X6 分别为有效穗数、每穗总粒数、每穗实粒数、空秕率、千粒重
和株高。
Note:Coefficient of determination = 0． 995 67，surplus path coefficient =
0． 065 81;X1，X2，X3，X4，X5 and X6 represent number of productive
ear，total grains per ear，full grains number per ear，sterile gain ra-
tio，1 000-grain weight and plant weight，respectively．
3 结论与讨论
试验结果表明，水稻齐穗前的日照时数对实粒数的影响
显著，特别是齐穗前5 d的日照时数影响程度达极显著水平，
齐穗后5 d内的温度和降水量对实粒数影响显著。成都市水
稻产量最高的播期为 4 月 3 日，与之对应的产量结构:有效
穗 342万穗 /hm2，穗实粒数 143． 5 粒，空秕率为 13%左右。
千粒重 28． 5 g，全生育期为 158 d。在作用于产量的各性状
中，主要因子是有效穗数和空秕率。成都市水稻过多地提前
或推迟播种期，会对产量构成明显影响，但在一定的时间范
围内进行适当早播对产量的影响不明显:成都地区的播种安
全期应在 3月下旬至 4 月上旬，提前至 3 月中旬或推迟至 4
月中旬甚至更晚将会明显减产。
成都市水稻穗花期一般在 7月下旬至 8 月上旬，成熟收
获期在 8月下旬至 9 月上旬。成都市秋季易出现连阴雨天
气，造成水稻灌浆速度缓慢，甚至灌浆受阻，病虫危害加重，
加上收天不好，成熟后无法及时收晒，严重影响了水稻的产
量和品质。按四川省地方标准(DB51 /T581-2006)“农业气象
术语”中秋绵雨的标准［6］，对试验田所在地—温江 1970 ～
2009年秋绵雨分别出现在 8月下旬、9月上旬、9月中旬的年
数及 1970 ～ 2009 年不同时段的秋绵雨出现频率进行了统
计，发现秋绵雨出现在 9月上旬的频率最高(27． 5%) ，9月中
旬次之(17． 5%) ，8 月下旬最低(15． 5%)。结合图 2 分析，
成都市水稻安全播种期适当提前到 3 月 27 日前后，使水稻
成熟收获期能够提前到 8月下旬，使灌浆成熟期避开或少受
秋绵雨天气危害，以实现水稻优质高产。由于田间试验条件
限制，分析结果的合理性、稳定性等均有待进一步试验验证。
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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
2006．
(上接第 18420页)
揭示红锥群体的遗传多样性水平和遗传分化状况。
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05481 安徽农业科学 2011 年