全 文 ：中国农业科学 2016,49(14):2662-2674
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.002

收稿日期：2016-03-16；接受日期：2016-05-16
基金项目：国家自然科学基金（31360359）、国家现代农业产业技术体系专项资金（CARS-20-1-1）、云南省应用基础研究计划（2016FB071）、云南
省中青年学术技术带头人后备人才（2014HB038）
联系方式：吴转娣，E-mail：judith1123@126.com。刘新龙，E-mail：lxlgood868@163.com。吴转娣和刘新龙为同等贡献作者。通信作者吴才文，E-mail：
gksky_wcw@163.com


甘蔗独脚金内酯生物合成基因 ScCCD8 的克隆与表达分析
吴转娣，刘新龙，刘家勇，昝逢刚，赵培方，林秀琴，陈学宽，苏火生，刘洪博，吴才文
（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南开远 661699）

摘要：【目的】克隆甘蔗的 ScCCD8，分析其序列特征并预测其功能，研究在甘蔗不同组织部位、不同胁迫处
理条件以及不同生长时间点 ScCCD8 的表达情况，为该基因在甘蔗基因工程育种中的应用提供理论支撑。【方法】
以 NCBI 中检索的甘蔗 CCD8 同源片段 EST 序列为模板设计引物，扩增甘蔗 CCD8 的片段，采用 RACE 和 RT-PCR 技术
分别从甘蔗品种新台糖 22 号中克隆 CCD8 的 5′、3′目的片段和全长 cDNA 序列，以生物信息学方法对序列进行预测
分析，利用 qRT-PCR 方法分析 CCD8 在不同组织、不同逆境胁迫条件下和不同生长时间点的表达特性。【结果】克
隆获得甘蔗 CCD8，命名为 ScCCD8，GenBank 登录号为 KP742973.1。该 cDNA 全长 2 016 bp，含有 1 个 1 623 bp
的完整开放阅读框（ORF），编码 540 个氨基酸，编码的蛋白质分子量为 59.534 kD。生物信息学分析表明 ScCCD8
编码的蛋白是定位于叶绿体上的非分泌性蛋白，不是典型的跨膜蛋白，没有信号肽位点。存在着多个糖基化位点
和磷酸化位点等活性位点。序列分析表明，ScCCD8 与其他植物的 CCD8 蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显
示，甘蔗 ScCCD8 与高粱的 CCD8 蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析表明，ScCCD8 的表达具有
组织特异性，在根中的表达量最高，是老叶中表达量的18倍。其在模拟重度干旱胁迫（20% PEG）、盐胁迫（200 mmol·L-1
NaCl）、磷缺乏（1/8 mmol·L-1）和营养缺乏(纯水培养)4 种胁迫处理下，茎尖中的 ScCCD8 均被诱导表达，且在处
理 24 h 以后，ScCCD8 的表达量增加较为明显。在不同生长时期，ScCCD8 在甘蔗不同生长时期的茎尖中均有表达，
且在幼苗期的表达量高于萌芽期和分蘖期。【结论】从甘蔗品种 ROC22 中克隆获得的甘蔗独脚金内酯生物合成关键
基因 ScCCD8 是 CCD8 基因家族成员，推测 ScCCD8 可能与甘蔗 SLs 响应逆境胁迫有关。
关键词：甘蔗；ScCCD8；独脚金内酯；实时荧光定量 PCR；干旱胁迫

Cloning and Expression Analysis of Strigolactones Biosynthesis-
Related Gene ScCCD8 in Sugarcane
WU Zhuan-di, LIU Xin-long, LIU Jia-yong, ZAN Feng-gang, ZHAO Pei-fang, LIN Xiu-qin, CHEN Xue-kuan,
SU Huo-sheng, LIU Hong-bo, WU Cai-wen
(Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic
Improvement, Kaiyuan 661699, Yunnan)

Abstract: 【Objective】The gene of Carotenoid Cleavage Dioxygenase8 (CCD8) from sugarcane (Saccharum officinarum L.)
was cloned, then the sequence signature and functions were investigated, furthermore the gene expression in different tissues,
different abiotic stresses and different growth times were analyzed. The objectives of the present study were to provide theoretical
supports for the application of the ScCCD8 gene in sugarcane genetic engineering breeding.【Method】Using homologous cloning
method to obtain the sequence of ScCCD8 gene from ROC22, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and
rapid amplification of cDNA ends PCR (RACE-PCR) were used to clone the full-length sequence of ScCCD8. The bioinformatic
14期 吴转娣等：甘蔗独脚金内酯生物合成基因 ScCCD8的克隆与表达分析 2663
characteristics of the ScCCD8 was analyzed using online service. The expression profiles of ScCCD8 in various tissues, in
response to different stress treatments and different growth times were investigated using quantitative real-time PCR (qRT-PCR).
【Result】CCD8 was isolated from sugarcane, named ScCCD8, which was submitted to GenBank with accession number
KP742973.1. It has 2 016 bp in length containing a 1 623 bp open reading frame (ORF) and encoding 540 amino acid residues.
The molecular weights of ScCCD8 encoding protein were 59.534 kD, it is not a transmembrane protein that did not contain the
signal peptide sites, indicating that it is not the secretory protein. Subcellular localization prediction showed that ScCCD8 might
localize in chloroplast, and it contains several active sites such as phosphorylation sites and glycosylation sites. Comparison of
protein sequences similarity analysis showed that ScCCD8 had more similarity with CCD8 from different plants. Phylogenetic
tree analysis showed that ScCCD8 had the closest genetic relationship with Sorghum bicolor. Expression quantity of ScCCD8 was
the highest in root, which is 18 times more than in old leaves. Analysis of the expression patterns in response to abiotic stress
revealed that ScCCD8 is up-regulated by PEG（20% PEG）, NaCl（200 mmol·L-1 NaCl） and phosphorus deficiency （1/8
mmol·L-1）and nutritional deficiency（cultured in pure water） in stem tip, and the obviously increase expression was found after
treated 24 hours. The expression of ScCCD8 in stem tip were various in different growth times, moreover the expression was
higher in germination stage then in tillering stage.【Conclusion】Sugarcane strigolactones biosynthesis-related gene ScCCD8 was
cloned from ROC22, which is the member of CCD8 gene family. It is speculated that ScCCD8 might participated in plant
resistance to abiotic stresses.
Key words: sugarcane; carotenoid cleavage dioxygenase 8; strigolactones; qRT-PCR; drought stress

0 引言
【研究意义】独角金内酯（strigolactones，SLs）
是MAX/RMS/D途径产生的一种控制植物分枝的新激
素[1-3]，抑制植物分枝生长[2-4]，控制中胚轴伸长[5]，
促进侧根形成和诱导根毛伸长等[6-8]。SLs与生长素
（Auxins）相互作用进而抑制侧芽的生长，且生长
素是通过调节 CCD8而促进 SLs生物合成，最终抑
制侧芽的生长[9-11]。分蘖是决定甘蔗（Saccharum spp.）
有效茎数和产量的重要农艺性状之一，甘蔗作为最重
要的糖料作物，研究其分蘖具有重要的实践与理论意
义。【前人研究进展】CCD8是独脚金内酯生物合成
途径中的第三个酶，主要负责合成一种与 SLs结构相
似的可移动的前体－－己内酯[12]，目前，已经从拟
南芥[13]、水稻[9]中分离编码 CCD8的同源基因 MAX4、
D10等。HARRISON等[14]通过体外酶抑制试验表明，
植物分蘖表型的改变很可能是通过抑制 CCD8 的酶
活性进而抑制 SLs生物合成途径而实现的，而非 D27
或 CCD7，因此，CCD8被认为是 SLs调节植物分蘖
作用中的关键酶。甘蔗 CCD8功能的研究将为甘蔗的
分蘖调控研究提供重要理论基础。SLs 能通过抑制
腋芽的生长来抑制分枝，与生长素和细胞分裂素相
互作用，共同调控植物分枝的发育[10,15]，最终影响
植株分枝形态的建成[16-17]。SLs能够调节植物体内的
资源分配，能保持磷和氮的平衡，在不良环境条件下，
能改变植物的生长方式，使植物中的资源流向特定
的组织，以达到长期生存的目的。通过大量的矮化
多分蘖突变体的分离鉴定、相关基因的克隆、表达
调控模式分析及功能解析，植物 SLs生物合成、运输、
信号转导和降解途径的研究取得了许多重大的研究成
果[12, 18-21]。CCD8是 ARITE等[22]以 d10多分蘖突变
体材料通过图位克隆的方法分离出来的，是
MAX4/RMS1/DAD1/ D10的同源基因，编码类胡萝卜
素裂解双加氧酶 CCD8。利用 RNAi 干扰猕猴桃
AcCCD8，导致 AcCCD8表达量减少，分枝增多并延
迟了叶片的衰老[23]。西红柿 SICCD8 沉默后表现出
分枝、节点、不定根增多，矮化，花小，果实小，
且种子细少等[24]。因此，CCD8 可能不仅与 SLs 的
生物合成有关，还参与或影响其他的生物学通路而
影响植物的生殖发育[24]。多种植物的 CCD8 都在根
中高表达[22-28]。在拟南芥中，CCD8（MAX4）在根尖、
成熟花的气孔和长角果中高表达，在芽中没有表达[13,29]。
这些基因差异表达的原因还未知，推测其也可能参
与其他的信号通路[30]。【本研究切入点】CCD8 在
植物分蘖及生长发育的不同阶段起重要的调控作
用，但目前关于甘蔗独脚金内酯生物合成相关基因
的研究仍鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究
利用同源克隆的方法获得了甘蔗独脚金内酯生物合
成关键基因 ScCCD8 的 cDNA 全长序列，利用生物
信息学分析预测 ScCCD8的功能，并以 qRT-PCR分
析 ScCCD8 在不同组织、不同胁迫处理条件下和不
同生长时间点的表达模式，以期为研究 ScCCD8 在
甘蔗 SLs 生物合成过程中的作用及其参与甘蔗分蘖
调控响应逆境胁迫的作用提供理论依据。
2664 中 国 农 业 科 学 49卷
1 材料与方法
1.1 材料
选用中国蔗区的主栽品种之一 ROC22 为材料，
选取处于分蘖期的甘蔗茎尖作为研究材料，提取总
RNA。甘蔗材料由云南省甘蔗遗传改良重点实验室提
供。
1.2 材料处理
大田中选取生长健壮并长势一致的 ROC22 蔗
茎，砍成单芽茎段，洗净并 52℃温水脱毒处理 30
min。温室中以 45 d的甘蔗幼苗为材料，分别给予 6
种处理，（以 10%（w/v）PEG6000的 MS培养基处
理）中度干旱、（以 20%（w/v）PEG6000 的 MS
培养基处理）重度干旱、（以 200 mmol·L-1 NaCl的
MS培养基处理）中度盐胁迫、（以 300 mmol·L-1 NaCl
的 MS培养基处理）重度盐胁迫、（1/8 mmol·L-1）
磷缺乏、（纯水培养）营养缺乏，以不同时间段 0 h
（对照）、6、12、24、48、72和 96 h取样，以茎
尖作为材料，取样后，液氮速冻，并于-80℃保存备
用。
2014年 7月 2日，在云南省甘蔗遗传改良重点实
验室温室大棚中，以甘蔗渣和红壤土作为营养基质，
在种植桶中栽种经温水脱毒处理的甘蔗茎段材料，栽
种 30 d内盖膜处理，于不同时间段取样（7、14、30、
45、60、90和 120 d），以茎尖作为材料，液氮冷冻，
并于-80℃保存备用。
1.3 甘蔗 ScCCD8 的 EST 克隆
以甘蔗茎尖分生组织为材料，提取总 RNA，方
法参照 TaKaRa公司 RNA Plant Kit试剂盒说明书操
作，用 NanoDrop法测定 RNA的浓度，根据 OD260/
OD280及 OD260/OD230评估 RNA 的质量，并以琼脂
糖凝胶电泳的结果检测 RNA的完整性，以 1%的琼
脂糖凝胶电泳检测，于-70℃贮存备用。取 1 μg茎尖
总 RNA用于 cDNA的合成，方法按照 TaKaRa公司
的 RNA PCR Kit试剂盒说明书操作，使用随机引物
olig(dT)18。
以 NCBI 检索的甘蔗 ScCCD8 的 EST 序列
（CA191025.1 和 CA100587.1），以 DNAMAN 软件
分析并拼接 2 个片段。设计 1 对引物 ScCCD8EST-F
和 ScCCD8EST-R（表 1），由生工生物公司合成。
以 cDNA第一链为模板，PCR条件为 94℃ 3 min；
94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，32个循环；72℃ 10
min。PCR产物以 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并以
TaKaRa 公司的凝胶回收试剂盒对扩增的条带进行回
收、纯化，并连接到 pEASYTM-T5 Zero-Vector载体
中，转入 DH5α大肠杆菌中，阳性克隆经 PCR鉴定后，
送上海生工测序。测序结果经 BLAST比对分析。
1.4 ScCCD8 5′端和 3′端的克隆
3′RACE和 5′RACE均按 SMARTTM RACE cDNA
Amplification Kit试剂盒说明书进行操作。根据已得到
的 cDNA片段序列设计特异性引物，扩增目的基因的
3′和 5′末端。回收、测序、比对方法同 1.3，测序结果
用DNAMAN 6.0对测序结果与已知EST序列进行迸接。
以 1.2 中保存的 cDNA 为模板，设计引物
ScCCD8F 和 ScCCD8R（表 1），扩增 ScCCD8 的编
码区序列，扩增条件为 94℃ 3 min；94℃ 30 s，57℃
30 s，72℃ 45 s，32个循环；72℃ 10 min。回收、测
序、比对方法同 1.3。
1.5 ScCCD8 的生物信息学分析
采用 NCBI 平台对甘蔗 ScCCD8 进行 BLAST 同
源比对分析，使用 ORF Finer在线工具寻找编码框，
将目的片段序列与其他物种的 CCD8 核苷酸序列在
DNAMAN 进行比对，通过开放阅读框（ORF）分析
并进行氨基酸 BLAST比对，利用 Clustal W软件进行
多序列对齐和排序，用MEGA5.0构建NJ系统进化树。
利用 ProtParam（http://web.expasy.ory/ProtParam/）软
件对蛋白序列进行分析，预测蛋白的分子量和等电点；
利用 ProtScale进行蛋白质疏水性分析；Motif Scan分
析蛋白质生物活性位点分析；TMHMM Sever2.0（http：
// www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）分析蛋白的跨
膜结构域；SignalP4.1（http：//www. cbs. dtu. dk/services/
SignalP/）分析蛋白的信号肽；wolf PSORT（http：
//wolfpsort.seq. cbrc. jp/）预测亚细胞定位；使用
SOPMA 软件预测蛋白的二级结构；使用 NCBI 平台
对进行 BLAST同源比对分析，用MEGA5.0构建系统
进化树；分别运用 NetPhos 2.0Serve、DictyOGlyc 1.1
Server 在线软件预测 ScCCD8翻译后磷酸化、O-糖基
化修饰情况。
1.6 ScCCD8 在甘蔗不同组织部位的表达分析
根据 ScCCD8 序列设计荧光定量 PCR 引物，以
GAPDH 作为内参基因 [31]。选用 TaKaRa 公司的
PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser 和
SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，按试剂盒说明书
进行操作，定量 PCR体系为 20 μL，包括 DNA模板
（50 mg·μL-1）2 μL、SYBR®Premix Ex TaqII（Tli
RNaseH Plus）（2×）10.0 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）
14期 吴转娣等：甘蔗独脚金内酯生物合成基因 ScCCD8的克隆与表达分析 2665
表 1 CCD8 的 PCR 引物序列
Table 1 Primers used for the CCD8 gene amplification
引物名称 Primers name 引物序列 Sequences (5′-3′) 功能 Function
ScCCD8EST-F CCCAACACCCTCACCAAG 片段扩增引物 Gene specific primer for fragment
ScCCD8EST-R CCCGTTGATTCACTGTAGCG 片段扩增引物 Gene specific primer for fragment
ScCCD8-3′F1 CCAAGATCGACCTGGTGGAGAAGACGGCC 3′ RACE基因特异引物 1st Gene specific primer for 3′ end
ScCCD8-3′F2 TGCCGTCAGAGCCCTTCTTCGTGCCGC 3′ RACE基因特异引物 2nd Gene specific primer for 3′ end
ScCCD8-5′R1 GAGTCGGCACGCTGTGGAGATGTGA 5′ RACE基因特异引物 1st Gene specific primer for 5′ end
ScCCD8-5′R2 CGAAATCGCAACGCCGTCGTCCTCCTCCA 5′ RACE基因特异引物 2nd Gene specific primer for 5′ end
ScCCD8-F ATGTCTCCCACTATGGCTTCGC 编码区扩增上游引物 Forward primer for coding region
ScCCD8-R AGAGTCGGCACGCTGTGGAGAT 编码区扩增下游引物 Reverse primer for coding region
ScCCD8-QF CCTGTGGAACCTGGGCGACTAC 荧光定量上游引物 Forward primer for qRT-PCR
ScCCD8-QR ACGCCCGTGTTGGAGTTGTC 荧光定量下游引物 Reverse primer for qRT-PCR
GAPDH-F CACGGCCACTGGAAGCA 荧光定量内参上游引物 Forward primer for reference gene qRT-PCR
GAPDH-R TCCTCAGGGTTCCTGATGCC 荧光定量内参下游引物 Reverse primer for reference gene qRT-PCR

0.8 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL和 H2O 6
μL，3次重复。采用两步法 PCR扩增：95℃ 30 s；95℃
5 s，60℃ 34 s，40个循环；95℃ 15 s；60℃ 1 min；
95℃ 15 s。每个样品设 3个重复，在ABI Vii7 Real time
PCR System（Applied Biosystems，USA）上进行试验。
利用 2-ΔΔCT法计算 ScCCD8的相对表达量。
2 结果
2.1 甘蔗 ScCCD8 的 cDNA 全长序列
如图 1所示，经 PCR扩增得到长度为 481 bp的
甘蔗 ScCCD8的 EST片段；3′RACE获得的产物为 567
bp；5′RACE获得一条长度为 1 667 bp的 5′端序列。
通过将中间片段、3′RNAC 序列和 5′端序列拼接，得
到全长为 2 016 bp的甘蔗 CCD8全长 cDNA序列，预
测其 ORF 框（图 2），并设计上下游引物进行 PCR
扩增，获得的编码区序列长度为 1 623 bp。甘蔗 CCD8
全长 2 016 bp，包含一个 35 bp的 5′非翻译区和一个
358 bp的 3′非翻译区，以及一个 1 623 bp的编码 540
个氨基酸的开放阅读框，命名为 ScCCD8，GenBank
登录号为 KP742973.1。
2.2 甘蔗 ScCCD8 的系统发育分析
通过分析 ORF框并进行氨基酸 BLAST比对，甘
蔗 ScCCD8与其他物种的 CCD8的氨基酸序列同源性
与核苷酸序列相似，特别是与禾本科植物的同源性均
高达 80%以上（图 3），与高粱（XM_002458432.1）
和玉米（NM_001197000.1）的氨基酸序列相似性达

M 1 M 1 M 1 M 1
bp
2000
1000
500
bp
2000
1000
500
481 bp
bp
5000
3000
1000
bp
5000
2000
1000
3000
2000
567 bp 1667 bp
1682 bp


图 1 甘蔗 ScCCD8 的 PCR 扩增电泳图
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the PCR amplification of sugarcane ScCCD8
2666 中 国 农 业 科 学 49卷
1
121
241
361
481
601
721
841
961
1081
1201
1321
1441
1561
1681
1801
1921

图 2 ScCCD8 的编码区序列及推导出的氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide and predicted amino acid sequences of ScCCD8

到 97%，与谷子（XM_012846216.1）、水稻（NM_
001050764.2）和二穗短柄草（XM_003569750.3）的
相似性分别高达 96%、96%和 89%。与其他双子叶植
物 如 小 果野 芭 蕉 （ XM_009391093.1 ） 、海 枣
（XM_008806408.1）、油棕（XM_010919038.1）、
梅（XM_008221883.1）、碧桃（XM_007222324.1）
分别为 88%、88%、78%、79%和 79%。结果表明，
不同植物的 CCD8 蛋白结构与功能高度保守，甘蔗
ScCCD8 与其他单子叶或双子叶植物可能具有较相似
的功能。
在 NCBI上筛选出与甘蔗 ScCCD8氨基酸序列相
似性较高的 17 个物种的 CCD8 蛋白，并进行多序列
比对。结果显示，甘蔗 ScCCD8的氨基酸序列与其他
氨基酸序列有高度的保守性，特别是可变结构域、糖
基化位点及磷酸化位点等重要功能位点的序列保守性
更高。利用 MEGA5.0 构建甘蔗与其他 17 个物种的
NJ进化树（图 4）显示具有相同种属关系的物种被聚
为一类。总体上，甘蔗 ScCCD8的氨基酸序列与山羊
草、水稻和二穗短柄草的亲缘关系最近，与高粱、玉
米和谷子的亲缘关系较近，与柚、甜橙、海枣、野菊
花、苹果、烟草和秋海棠等双子叶植物的亲缘关系相
对较远。
2.3 甘蔗 ScCCD8 的生物学信息学分析
2.3.1 ScCCD8 蛋白质特征分析 经生物学信息学在
线软件 ProtParam分析甘蔗 ScCCD8 的蛋白质特性，
结果表明， ScCCD8 所编码的蛋白分子式为
C2652H4093N737O781S23，分子量为 59.534 kD，等电点为
6.00，Ala、Gly、Val、Leu 4个氨基酸出现频率较高，
分别为 8.9%、9.3%、8.1%和 8.2%，而另一些氨基酸
如 Pyl、Sec在氨基酸序列中没有发现。稳定性系数为
43.44，为不稳定蛋白（不稳定系数＜40 是稳定蛋白，
＞40 是不稳定蛋白），总平均亲水性（GRAVY）为
-0.277，为亲水蛋白（蛋白质亲水区域多于疏水区域）。
无信号肽位点（图 5），没有跨膜区，不是跨膜蛋白。
wolf PSORT预测亚细胞定位于叶绿体中。
使用 SOPMA 软件预测 ScCCD8 蛋白的二级结构
（图 6），该蛋白 α-螺旋（h）占 25.93%、β-折叠（e）
占 22.78%、β-转角（t）占 10.19%和无规则卷曲（c）
41.11%。结果表明，该蛋白质二级结构的大部分由无
规则卷曲和 α-螺旋构成，α-螺旋在 N端与中部所占比
14期 吴转娣等：甘蔗独脚金内酯生物合成基因 ScCCD8的克隆与表达分析 2667
81XP_002458477.1
73NP_001183929.1
78XP_012701670.1
67EAY75798.1
69XP_003569798.1
43AKR76311.1
160XP_002458477.1
153NP_001183929.1
159XP_012701670.1
150EAY75798.1
154XP_003569798.1
122AKR76311.1
245XP_002458477.1
238NP_001183929.1
244XP_012701670.1
235EAY75798.1
239XP_003569798.1
207AKR76311.1
330XP_002458477.1
323NP_001183929.1
329XP_012701670.1
320EAY75798.1
324XP_003569798.1
292AKR76311.1
415XP_002458477.1
408NP_001183929.1
414XP_012701670.1
405EAY75798.1
409XP_003569798.1
377AKR76311.1
500XP_002458477.1
493NP_001183929.1
499XP_012701670.1
490EAY75798.1
494XP_003569798.1
462AKR76311.1
578XP_002458477.1
571NP_001183929.1
577XP_012701670.1
568EAY75798.1
570XP_003569798.1
539AKR76311.1
XP_002458477.1：高粱 Sorghum bicolo；NP_001183929.1：玉米 Zea mays；XP_012701670.1：谷子 Setaria italica；EAY75798.1：水稻 Oryza sativa Indica
Group；XP_003569798.1：二穗短柄草 Brachypodium distachyon；AKR76311.1：甘蔗 Saccharum hybrid cultivar ROC22。分别用黑色和灰色表示相同和
相似的残基 The identical and similar residues are shown in black and gray, respectively

图 3 ScCCD8 与其他作物同源蛋白的序列分析结果
Fig. 3 Sequence alignment of amino acid residues of ScCCD8 with other related proteins

例较大，β-转角则主要在中部和前部，延伸链主要集中
在中部及 C端，无规则卷曲的分布则比较平均（图 6）。
作为蛋白质折叠的主要驱动力，蛋白质的亲水、
疏水氨基酸的组成能够影响蛋白质的结构和特性，经
在线软件 ProtScale采用 Hyhob/Kyte & Doolittle的方
法分析（图 7）显示，第 358位具有最高分值为 1.922，
疏水性最强；第 349 位最低分值，为-3.067，亲水性
最强。整条多肽链表现为亲水性，没有特别明显的疏
水区或亲水区，总体上亲水区多于疏水区，故推测甘
蔗 ScCCD8蛋白是一种亲水蛋白。
2.3.2 ScCCD8 蛋白的生物活性位点分析 蛋白质的
修饰方式主要包括蛋白质的磷酸化和糖基化，它可以
调节蛋白质的活力和功能。运用 DictyOGlyc 1.1 Server
和NetPhos 2.0 Server在线软件预测 ScCCD8翻译后磷
酸化、O-糖基化修饰情况，结果显示 ScCCD8蛋白有
可能发生磷酸化修饰的位点有 30 个, 其中色氨酸
（Ser）、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）可能发生磷
酸化修饰的位点分别有 13、9和 8个（图 8）；有可
2668 中 国 农 业 科 学 49卷


图 4 不同物种 CCD8 氨基酸序列的聚类分析
Fig. 4 Clustering analysis of the deduced amino acid sequences of CCD8 with homologous among sugarcane and other plants

分
值
So
or
e


C-score：剪切位置分值；S-score：信号肽分值；Y-score：C和 S-score综合分值
C-score: Cleavage site score; S-score: Signal peptide score; Y-score: combined cleavage site score

图 5 ScCCD8 蛋白的信号肽分析
Fig. 5 Signal peptide analysis of ScCCD8 protein



图 6 SOPMA 软件预测 ScCCD8 蛋白的二级结构
Fig. 6 Secondary structure analysis of ScCCD8 protein
14期 吴转娣等：甘蔗独脚金内酯生物合成基因 ScCCD8的克隆与表达分析 2669
Hphob./Kyte&Doolittle
0 100 200 300 400 500
-3.5
-3.0
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0
0.5
1.0
1.5
2.0
位点 Position
分
值
So
or
e


图 7 ScCCD8 蛋白的亲水性/疏水性预测
Fig. 7 Hydrophobicity/ hydrophilicity prediction of ScCCD8

磷
酸
化
势
Ph
os
ph
or
yl
at
io
n
po
te
nt
ia
l


图 8 ScCCD8 蛋白氨基酸序列翻译后磷酸化修饰位点预测
Fig. 8 Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence of ScCCD8 protein

能发生 O-糖基化修饰的位点有 4 个，均为苏氨酸
（Thr），分别在肽链的第 2、第 23、第 25、第 27位
（图 9）。磷酸化位点分布都较为平均，糖基化位点
则主要分布在 N端。
利用Motif Scan分析蛋白质生物活性位点，结果
表明，该蛋白序列含有：1个 N-糖基化位点，分别位
于 367—370 氨基酸段；10 个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位
点，分别为 50—53、112—115、168—171、227—230、
369—372、383—386、410—413、454—457、497—500
和 512—515氨基酸段；10个 N-肉豆蔻酰化作用位点，
分别位于 47—52、158—163、166—171、217—222、
402—407、420—425、470—475、490—495、501—506
和 528—533氨基酸段；7个蛋白激酶 C磷酸化位点分
别位于 59—61、112—114、191—193、212—214、
324—326、462—464和 497—499氨基酸段；1个酪氨
酸激酶磷酸化位点，位于 249—257氨基酸段；1个酰
胺化位点，位于 461—434。
2.4 ScCCD8 在甘蔗不同组织部位和胁迫诱导中的表
达分析
提取甘蔗不同组织来源的总 RNA，以甘蔗的
GAPDH作为内参，对 ScCCD8进行 qRT-PCR分析（图
10），结果表明，甘蔗 ScCCD8在各器官中的表达量
差异比较大，在甘蔗的根尖、分蘖芽、腋芽、茎尖的
表达量相对较高，老根、嫩叶（距茎尖分生组织处约
2670 中 国 农 业 科 学 49卷
O
-糖
基
化
修
饰
位
点
O
-g
ly
oo
sy
la
tio
n
po
te
nt
ia
l


图 9 ScCCD8 蛋白氨基酸序列翻译后 O-糖基化修饰位点预测
Fig. 9 Prediction of O-glycosylation site modification in amino acid sequence of ScCCD8 protein

5 cm）、老叶（第四叶中段）、节（第五节）和叶鞘
中的表达量相对较少。茎尖中的表达量是老叶中的 18
倍左右，因此可以说 ScCCD8在甘蔗中的表达有较高
的组织特异性，且主要是在甘蔗的幼嫩组织中强表达。
温室中以 45 d的甘蔗幼苗为材料，分别给予 4种
处理，3个重复，（以 10%（w/v）PEG6000的MS培
养基处理）干旱、（以 200 mmol·L-1 NaCl的MS培养
基处理）盐胁迫、（1/8 mmol·L-1）磷缺乏、（纯水培
养）营养缺乏，以不同时间段 0 h（对照）、6、12、24、
48、72和 96 h取样，以茎尖作为材料，提取总 RNA，
对 ScCCD8进行 qRT-PCR分析（图 11），结果表明，
在不同胁迫条件下，ScCCD8能够响应逆境的胁迫，在
处理 24 h以后 ScCCD8的表达量的增加较为明显。结
果表明，在甘蔗茎尖中的 ScCCD8受到胁迫诱导表达。
利用 qRT-PCR 技术分析甘蔗茎尖 ScCCD8 从 7
月2日栽种到至11月份进入分蘖期之间不同时间点的
相对表达量，以甘蔗茎尖作为材料，均设 6个重复，
其中 3个为温室中的桶栽试验，另外 3个为大田栽种
的试验。结果发现，该基因在甘蔗在不同生长时期的
茎尖中均有表达，且在幼苗期的表达量高于萌芽期和
分蘖期（图 12），结果表明，在不同生长时期，ScCCD8
的表达量存在差异。

0
5
10
15
20
25
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Sc
CC
D
8相
对
表
达
量
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
le
ve
l o
f S
cC
C
D
8


1：根尖；2：老根；3：叶鞘；4：分蘖芽；5：节；6：腋芽；7：茎尖；8：嫩叶；9：老叶
1: Root tip; 2: Root; 3: Sheath; 4: Tiller bud; 5: Internode; 6: Axillary bud; 7: Stem tip; 8: Tender leaf; 9: Old leaf

图 10 甘蔗不同组织 ScCCD8 的 qRT-PCR 分析
Fig. 10 Expression analysis of ScCCD8 gene in different sugarcane tissues by qRT-PCR
14期 吴转娣等：甘蔗独脚金内酯生物合成基因 ScCCD8的克隆与表达分析 2671
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 6 12 24 48 72 96
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
时间 Time (h)
A
B
C
D
0 6 12 24 48 72 96
0 6 12 24 48 72 96
0 6 12 24 48 72 96


A：干旱胁迫处理；B：盐胁迫处理；C：磷缺乏处理；D：营养缺乏处理
A: Drought stress; B: Salt stress; C: Phosphorus deficiency stress; D: Nutrient deficiency stress

图 11 甘蔗不同胁迫条件下 ScCCD8 的 qRT-PCR 分析
Fig. 11 Expression analyses of ScCCD8 gene under different stressed conditions by qRT-PCR
2672 中 国 农 业 科 学 49卷
Sc
CC
D
8相
对
表
达
量
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
le
ve
l
of
S
cC
CD
8


7—14 d：萌芽期；30—90 d：幼苗期；120 d：分蘖期
7-14 days: Stages in germination; 30-90 days: Seedling stage; 120 days: Tillering stage

图 12 甘蔗不同生长时期 ScCCD8 的 qRT-PCR 分析
Fig. 12 Expression analyses of ScCCD8 gene at different stages of terminal by qRT-PCR

3 讨论
CCD8 参与独脚金内酯的生物合成，CCD8 的转
录是调节分枝抑制通路的关键步骤[22]，它可能在生长
素反馈调控独角金内酯及其衍生物的过程中有重要作
用[32]，另外，SLs 也是通过与生长素的交叉应答，抑
制生长素的极性运输能力来抑制侧芽生长[33]。因此，
CCD8 可能是在其他植物激素的共同作用下调控 SLs
生物合成并最终影响植物分枝的关键基因。
本研究从甘蔗主栽品种 ROC22 中克隆获得与甘
蔗分蘖相关的基因 ScCCD8，该基因序列全长 2 016
bp，其开放阅读框为 1 623 bp，编码 540个氨基酸，
ScCCD8 可能定位于叶绿体中[21]。通过同源性分析和
进化树分析结果表明，甘蔗 ScCCD8的氨基酸序列与
高粱、玉米、谷子和水稻等禾本科植物的同源性比较
高，与小果野芭蕉、海枣、油棕、梅、碧桃和甜橙等
双子叶植物的同源性也达到 80%左右，经生物信息学
预测分析 表明分离获得的 ScCCD8 是 CCD8 在甘蔗
中的同系物，且氨基酸序列具有较高的保守性，推测
这些基因在功能上可能高度相似。
ScCCD8 是甘蔗合成独脚金内酯所必需的，其具
有较高的组织特异性，主要是在幼嫩分生组织处表达，
在根尖的表达量最高，其次是茎尖、分蘖芽和腋芽，
而在老叶、老根和节等部位的表达量相对低。在受到
非生物胁迫的情况下，该基因在甘蔗茎尖的表达受到
胁迫的诱导表达，表明该基因与甘蔗非生物胁迫的响
应有关。ScCCD8 在不同生长时期的甘蔗茎尖中的表
达量分析表明它在甘蔗生长过程中存在差异表达。
水稻 CCD8是一个定位于叶绿体中的蛋白质，在
甘蔗中的 ScCCD8通过在线分析表明其同样定位于叶
绿体[21,34]，该推断还需要进一步的试验验证。
参与甘蔗独脚金内酯生物合成基因的其他基因，
如 D27、CCD7、MAX1以及相关的调控因子的研究还
相对较少，作者已经从甘蔗中克隆获得了这些基因的
cDNA 全长序列，下一步将会结合 ScCCD8，进一步
开展基因功能的鉴定和信号转导通路方面的研究，深
入研究甘蔗独脚金内酯的生物合成基因与甘蔗逆境胁
迫的关系，为进一步了解 SLs调控植物分蘖的作用机
制研究提供新的线索。
4 结论
获得甘蔗独脚金内酯生物合成基因 ScCCD8的全
长 cDNA。ScCCD8蛋白具有 CCD8家族的一般特性。
该基因全长 2 016 bp，ORF框为 1 623 bp，编码 540
个氨基酸，ScCCD8定位于叶绿体上的非分泌性蛋白，
不是典型的跨膜蛋白，还存在着糖基化位点和磷酸化
位点等活性位点，ScCCD8 在不同部位的表达具有组
织特异性，在非生物胁迫作用下被诱导表达。在不同
生长时期 ScCCD8的表达存在差异，推测 ScCCD8可
能参与了甘蔗的非生物胁迫响应过程。
14期 吴转娣等：甘蔗独脚金内酯生物合成基因 ScCCD8的克隆与表达分析 2673
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（责任编辑 李莉）